現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)

現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)第一頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第一章緒論

第一節(jié)基因操作技術(shù)1.基因操作技術(shù)

基因操作技術(shù)（重組DNA技術(shù)、基因工程）是在DNA水平上闡明生命現(xiàn)象的技術(shù)，包括DNA的“切”、“連”、“擴(kuò)”等。

“切”指限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA。

“連”指用DNA連接酶連接兩個(gè)DNA片段。

“擴(kuò)”是指目的DNA在宿主/載體系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增。第二頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.實(shí)驗(yàn)方案

（1）基因操作實(shí)驗(yàn)的主要目的有三個(gè)：

①分離目的基因，獲取DNA信息；

②分析基因結(jié)構(gòu)；

③分析基因功能。（2）試驗(yàn)流程設(shè)計(jì)首先，應(yīng)確定使用怎樣的研究方案；其次，根據(jù)試驗(yàn)規(guī)模和研究室情況；最后，根據(jù)研究人員生活規(guī)律確定試驗(yàn)時(shí)間。第三頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三3.實(shí)驗(yàn)方法

在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法時(shí)應(yīng)考慮

①能否達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

②是否符合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)狀；

③是否符合自己的喜好。

實(shí)驗(yàn)方法精度愛好實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕?jīng)費(fèi)預(yù)算實(shí)驗(yàn)周期儀器性能準(zhǔn)確性速度確定實(shí)驗(yàn)方法時(shí)應(yīng)考慮的因素第四頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三4.實(shí)驗(yàn)遵循的原則①忠于實(shí)驗(yàn)流程④設(shè)平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)②關(guān)注實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)⑤準(zhǔn)確的試劑用量③準(zhǔn)備充足的實(shí)驗(yàn)材料⑥數(shù)據(jù)整理注意：⑴第一次實(shí)驗(yàn)成功，第二次實(shí)驗(yàn)馬虎。⑵實(shí)驗(yàn)精度：①必須嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行的操作；②較嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作，允許5%的變動(dòng)；③允許20%變動(dòng)的實(shí)驗(yàn)操作；④不需要特別注意的實(shí)驗(yàn)操作。⑶酶促反應(yīng)不順利時(shí)，若加入更多的酶或DNA，結(jié)果會(huì)越來越糟。⑷不設(shè)平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)往往是實(shí)驗(yàn)失敗的原因。⑸樣本標(biāo)記的零亂也往往是實(shí)驗(yàn)失敗的重要原因。第五頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三5.實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備購(gòu)買利用公共服務(wù)機(jī)構(gòu)接受饋贈(zèng)寫求助信要注意：①你需要什么？②及時(shí)、真實(shí)的將相關(guān)信息告訴對(duì)方，不能隱瞞。③通常向論文通訊作者尋求幫助。④寫信的稿紙是印有單位標(biāo)志、名稱、電話號(hào)碼等信息的公函紙。第六頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第二節(jié)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則與安全⒈實(shí)驗(yàn)室規(guī)則⑴保持肅靜⑵保持整潔⑶嚴(yán)格操作⑷注意節(jié)約⑸保證安全⒉實(shí)驗(yàn)室常識(shí)⑴使用貴重儀器如分析天平、分光光度劑、離心機(jī)等倍加愛護(hù)，使用前熟知使用方法，使用時(shí)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，發(fā)生故障時(shí)，立即關(guān)機(jī)。⑵凡揮發(fā)性、有煙霧、有毒和有氣味的實(shí)驗(yàn)，均應(yīng)在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行。第七頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三⑶配制試劑時(shí)，應(yīng)對(duì)試劑純度、結(jié)構(gòu)式、分子質(zhì)量等特性熟悉，做到“有的放矢”。⑷量瓶是量器，不要用量瓶做容器。⑸洗凈器皿應(yīng)倒置架上，使其自然風(fēng)干。⒊實(shí)驗(yàn)室安全⑴《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》查看⑵了解電閘、水閥煤氣總閥門所在處，離開實(shí)驗(yàn)室檢查是否關(guān)好。⑶使用電器設(shè)備時(shí)嚴(yán)防觸電。⑷使用高溫高壓鍋滅菌時(shí)不得離人。⑸使用可燃物，特別是易燃物，應(yīng)特別小心。⑹凡使用腐蝕性試劑，必須謹(jǐn)慎操作，防止濺出。⑺廢液特別是強(qiáng)酸強(qiáng)堿，應(yīng)稀釋后倒入水池。⑻有毒物品應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)定辦理審批手續(xù)后方可領(lǐng)取，使用時(shí)嚴(yán)格操作，用后妥善處理。第八頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三⒋實(shí)驗(yàn)室急救⑴觸電①關(guān)閉電源；②用干木棍將導(dǎo)線與被害者分開；③將被害者移至木板上，與地面分離；④急救者必須做好觸電安全措施，手腳必須絕緣。⑵火災(zāi)隔絕氧氣①起火物與水相容：水、濕布、沙土、滅火器等②起火物與水不相容：不可用水⑶燙傷乙醇消毒，涂2%苦味酸或5%鞣酸，防感染⑷玻璃割傷或其他器械損傷

清理傷口，硼酸水洗凈，涂碘酒，包扎⑸灼傷皮膚①?gòu)?qiáng)堿：大量清水稀釋，涂5%硼酸或2%乙酸②強(qiáng)酸、溴：大量清水稀釋，5%NaHCO3或5%氨水⑹煤氣中毒呼吸新鮮空氣第九頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三思考題：⒈什么是DNA重組技術(shù)？其實(shí)驗(yàn)的主要目的是什么？答案⒉試分析有些人工作很辛苦，但總得不出理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因。答案⒊如何獲得你需要的實(shí)驗(yàn)材料（特別是未商品化的材料）？答案⒋什么是《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2004）？據(jù)此生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室可分幾級(jí)？答案⒌實(shí)驗(yàn)室發(fā)生火災(zāi)時(shí)該如何處理？燙傷、灼傷時(shí)該如何處理？答案⒍如何處理對(duì)環(huán)境有污染的試劑？答案第十頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第二章儀器操作與溶液配制

第一節(jié)常用器皿與儀器1、塑料制品Eppendrof管第十一頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三2、微量移液器（槍）使用方法調(diào)節(jié)時(shí)，自大到小。由小值調(diào)到大值時(shí)，應(yīng)多調(diào)1/3圈，再反調(diào)至設(shè)定值。第十二頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三3、恒溫水浴鍋

多用于酶促反應(yīng)，將Eppendrof管插入浮漂中進(jìn)行反應(yīng)。第十三頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三4、小型離心機(jī)

離心甩干是指短時(shí)間（1~3s）的離心操作，目的是使附著于管壁的液體沉入管底。第十四頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三5、離心干燥機(jī)目的是使DNA樣品快速干燥。第十五頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三6、旋渦混合器利用不對(duì)稱的旋轉(zhuǎn)將管內(nèi)液體混勻。第十六頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三7、振蕩器

攪拌離心管內(nèi)液體，加速難容物溶解，清洗浸泡于溶液中的不潔器皿。第十七頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三8、真空泵

利用真空吸走液體，作用與離心干燥機(jī)或凝膠干燥機(jī)類似。第十八頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三9、紫外發(fā)光裝置防護(hù)板（貼有起保護(hù)作用的保鮮膜）過濾板

紫外線可分為短波、中波、長(zhǎng)波等類型，短波光線強(qiáng)，對(duì)DNA損傷大。實(shí)驗(yàn)室一般使用中波，使用時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。因燈管和過濾板有使用壽命，用完后及時(shí)關(guān)閉。第十九頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三10、一次性手套11、紙巾①防止危險(xiǎn)試劑沾到手上。②防止試劑受到污染。

吸走殘余液體，一般衛(wèi)生紙就可以。擦拭實(shí)驗(yàn)用品（如玻璃板）時(shí)，要用專用、不帶毛屑的面巾紙。第二十頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第二節(jié)溶液1、實(shí)驗(yàn)用水一蒸水：多用于大腸桿菌培養(yǎng)基的制備、電泳緩沖液的配制、器皿的漂洗的實(shí)驗(yàn)。二蒸水：用于生物化學(xué)及組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。第二十一頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三2、儲(chǔ)液3、試劑稱量精度一般稱量精度為3位有效數(shù)字。4、試劑滅菌不可高溫高壓滅菌的試劑有：①遇熱易分解的試劑②易揮發(fā)的試劑③有機(jī)溶劑④腐蝕性、刺激性強(qiáng)的試劑。第二十二頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三問題：1、如何正確使用微量移液器？使用中應(yīng)特別注意哪些事項(xiàng)？2、如何改變微量移液器的移液量？應(yīng)自大調(diào)到小，還是自小調(diào)到大？為什么？答案3、哪些試劑需要高溫高壓滅菌？哪些試劑不能采用高溫高壓滅菌？對(duì)于不能采用高溫高壓方式滅菌的試劑如何滅菌？滅菌后試劑如何保存？是否需要分裝？答案4、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，哪些簡(jiǎn)易儀器或裝置可以替代真空泵的作用？答案5、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，哪些溶液可以用旋渦混合器混勻？為什么？6、配制培養(yǎng)基時(shí)，通常使用哪種級(jí)別的水？為什么？答案第二十三頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第三章大腸桿菌培養(yǎng)與保存準(zhǔn)備1）制作平板（稱試劑、溶解、滅菌）2）清潔超凈工作臺(tái)3）配制液體培養(yǎng)基培養(yǎng)平板培養(yǎng)保存穿刺培養(yǎng)

液體小量培養(yǎng)（制作初始菌）DNA擴(kuò)增甘油保存液體大量培養(yǎng)蛋白質(zhì)表達(dá)第二十四頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第一節(jié)培養(yǎng)前準(zhǔn)備1、大腸桿菌菌株主要來自K12，根據(jù)菌體表面糖蛋白成分（O抗原、H抗原、K抗原等）分類。2、培養(yǎng)大腸桿菌所需的物品微量移液器液體培養(yǎng)基槍尖盒1）操作臺(tái)第二十五頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三油性記號(hào)筆、小木棒、70%乙醇、涂布棒、接種環(huán)、煤氣燈、牙簽抗生素（-20℃保存）平板（蓋子朝上），保持干燥2）滅菌方法高溫高壓滅菌（培養(yǎng)基、試劑、槍尖、小木棒、牙簽等）干熱滅菌（玻璃器皿及金屬器皿）火焰滅菌（試管瓶口、接種環(huán)等）紫外線滅菌（器械及培養(yǎng)基）乙醇滅菌（實(shí)驗(yàn)人員手、器械、操作臺(tái)）第二十六頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三3）接種工具接種環(huán)用于液體培養(yǎng)基的接種及平板劃線。小木棒用于從平板向液體轉(zhuǎn)接細(xì)菌。牙簽用于從菌落中挑選需要的單菌落。涂布棒用于向平板上涂布液體菌體。固體液體涂布棒小木棒牙簽第二十七頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三3、培養(yǎng)基種類1）液體培養(yǎng)基用于大量繁殖菌株以提取質(zhì)粒DNA或表達(dá)的目的蛋白質(zhì)。2）固體培養(yǎng)基目的是使菌落增殖到一定大小，以獲取質(zhì)粒斑或分離出單菌落。3）抗生素配制：A無菌水溶解抗生素，吸入注射器針筒內(nèi)。

B注射器嘴上安裝微量過濾器（過濾滅菌）。

C按每份1ml量分裝到Eppendorf管中，保存于-20℃冰箱。第二十八頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三使用：在接種前加入到液體培養(yǎng)基中，在配制固體培養(yǎng)基時(shí)，待滅菌后加入抗生素。4、培養(yǎng)基的配制

1)液體培養(yǎng)基的配制小體積LB培養(yǎng)基的配制（2ml為例）材料：試管及瓶塞藥匙

1L燒杯攪拌器及攪拌轉(zhuǎn)子試劑步驟：①胰蛋白酶10g

酵母提取物5g1L燒杯

NaCl10g第二十九頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三②加雙蒸水至刻度，用攪拌器混合均勻。③用分裝器分裝至試管，每份2ml。④高溫高壓滅菌，室溫保存。大體積LB培養(yǎng)基的配制（800ml為例）材料：藥匙

2L三角瓶鋁箔紙電動(dòng)攪拌器及攪拌轉(zhuǎn)子試劑步驟：①胰蛋白酶8g

酵母提取物4g三角瓶

NaCl8g第三十頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三②加雙蒸水至800ml，混合均勻。③高溫高壓滅菌，室溫保存。2)制作平板材料：煤氣燈或酒精燈水平臺(tái)面

1L三角瓶鋁箔紙直徑9cm的培養(yǎng)基藥匙試劑瓊脂粉步驟：①胰蛋白酶8g

酵母提取物4g三角瓶

NaCl8g

瓊脂粉第三十一頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三②鋁箔紙封口，混勻，滅菌。③待冷卻至60℃左右，分裝至培養(yǎng)皿。④水平臺(tái)上凝固。⑤倒置塑料袋中4℃保存。注意：1、若需要加入抗生素，待冷卻至60℃，分裝前加入。2、直徑9cm的平皿，每皿25ml為宜。3、盡量縮短平皿開蓋時(shí)間，分裝的培養(yǎng)基很快凝固，因此操作要快。4、凝結(jié)在蓋上的水珠可能至污染，故倒轉(zhuǎn)存放。5、氨芐青霉素易失活，添加后的平皿應(yīng)在數(shù)周內(nèi)使用。第三十二頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第二節(jié)大腸桿菌培養(yǎng)無菌操作前用70%乙醇消毒臺(tái)面。離酒精燈較近距離進(jìn)行無菌操作。開蓋前和開蓋后用酒精燈灼燒瓶口2至3次。瓶口傾斜，不得垂直向上。使用平皿時(shí)盡量去除凝結(jié)在蓋子上的水珠，并不得混淆蓋子。1、培養(yǎng)

1）小量液體培養(yǎng)材料：接種針或小木棒煤氣燈第三十三頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三

搖床

2mlLB液體培養(yǎng)基長(zhǎng)有細(xì)菌的平皿步驟：①用接種針接種燒紅接種針的鉑金絲輕觸平皿邊緣挑起一個(gè)菌落灼燒試管口，開蓋將鉑金絲伸進(jìn)液體培養(yǎng)基

37℃震蕩過夜②用小木棒接種灼燒瓶口，取一根木棒木棒挑起單菌落同上第三十四頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三2)大量液體培養(yǎng)基材料：煤氣燈搖床少量初始菌

8mlLB液體培養(yǎng)基步驟：①小量培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至過夜。②稍微打開盛有大體積培養(yǎng)液的三角瓶瓶蓋，灼燒瓶口。③打開有初始培養(yǎng)菌的試管口，灼燒，將初始培養(yǎng)菌轉(zhuǎn)入大量培養(yǎng)基中，蓋上蓋子，再灼燒瓶口。④37℃震蕩過夜。3）菌落測(cè)定第三十五頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三①在煤氣燈旁用微量移液器吸培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)至Eppendrof管。②打開分光光度計(jì)，調(diào)整波長(zhǎng)至600nm。③吸取未接菌的培養(yǎng)基至比色杯中，調(diào)整光吸收值為零。④取Eppendrof管內(nèi)的菌液于比色杯中，測(cè)A600值。4）平板培養(yǎng)劃線培養(yǎng)材料：接種針、煤氣燈或酒精燈、新的LA平板、菌誘導(dǎo)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期平臺(tái)期死亡期結(jié)果：A=0.2~1.0時(shí)為指數(shù)生長(zhǎng)期，A＞1.0為平臺(tái)期。A=1.0為10個(gè)/ml。8600600600第三十六頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三步驟：①用煤氣燈將接種針燒紅，輕觸平板一側(cè)，冷卻。②用鉑金絲挑去平板上的單菌落，在培養(yǎng)基表面劃線。③再灼燒鉑金絲，冷卻。④與前面所劃線的一部分交叉劃線，以減少菌數(shù)。⑤重復(fù)上步驟。⑥37℃倒置培養(yǎng)過夜。第三十七頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第三節(jié)大腸桿菌菌株保存1、平板保存材料：新平板、圓形標(biāo)簽紙、牙簽、封口膜或膠帶、長(zhǎng)有大腸桿菌的初始平皿步驟：①在平板底部貼標(biāo)簽，做標(biāo)記。②用牙簽挑單菌落，接種到平板。③37℃過夜后4℃保存。涂布培養(yǎng)材料：涂布棒、新的平板、酒精燈或煤氣燈、菌液步驟：①將平板翻轉(zhuǎn)過來，置于蓋上，50℃干燥20至30分鐘。②取100ul菌液，滴于平板上。③用涂布棒涂布均勻。④37℃倒置過夜。第三十八頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三3、穿刺保存材料：含0.7%瓊脂的LB培養(yǎng)基、鉑金絲、封口膜、玻璃瓶。步驟：①玻璃瓶?jī)?nèi)裝2/3培養(yǎng)基，滅菌，冷卻。②接種針火焰滅菌，在培養(yǎng)基中冷卻。③挑取單菌落后刺入培養(yǎng)基底部。④37度下培養(yǎng)12至18小時(shí)。⑤蓋緊瓶蓋，封口膜封口，室溫避光保存。2、甘油管保存材料：2ml凍存管、滅菌的80%甘油、封口膜、菌液步驟：①過夜培養(yǎng)2ml菌液后，取1ml至凍存管。②加入200ul80%甘油，混勻。③擰緊管帽，用封口膜封口，保存于-70℃或-20℃。第三十九頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三問題：1、用于基因克隆的大腸桿菌菌株主要有哪些？它們各自有什么主要特征？2、配制氨芐青霉素等抗生素時(shí)是否需要滅菌？如何滅菌?3、在進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)，何時(shí)需要大量培養(yǎng)？何時(shí)需要小量培養(yǎng)？4、在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，應(yīng)注意哪些問題？5、當(dāng)用平板培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，培養(yǎng)皿必須倒置，為什么？6、大腸桿菌的保存方法主要有哪些？第四十頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第四章基因操作中的酶學(xué)反應(yīng)

第一節(jié)常用酶的保存注意：1、常規(guī)儲(chǔ)存于-20℃

，也有4℃或8℃

。2、儲(chǔ)存的冰箱不能選用自動(dòng)除霜類。3、不與通常樣品保存在同一冰箱。4、盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成全部操作。5、直接在冰箱內(nèi)吸取需要的酶量。6、可用冰盒或金屬制的冰空盛裝Eppendrof管，以便在冰箱之外吸取酶液。第四十一頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第二節(jié)限制性內(nèi)切核酸酶1、定義：是一類識(shí)別DNA上3~8個(gè)特異核苷酸序列，并產(chǎn)生切割反應(yīng)的內(nèi)切核酸酶的總稱。2、修飾酶：與限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別的DNA序列相同，產(chǎn)生修飾反應(yīng)的酶叫修飾酶，主要是甲基化酶。3、限制-修飾系統(tǒng)：限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)病毒等外來DNA起切割反應(yīng)，但自身基因組DNA因修飾酶的修飾作用而不能被切割，這種防御機(jī)制叫~第四十二頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三1、識(shí)別序列

Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列長(zhǎng)度通常為4~8個(gè)核苷酸，對(duì)數(shù)具有對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)。識(shí)別序列越長(zhǎng)，其序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越低。4、限制性內(nèi)切酶的命名EcoRⅠE代表Escherichia屬

co代表coli種

R代表RY13株用羅馬數(shù)字區(qū)別不同特異性的酶第四十三頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三2、DNA片段的末端結(jié)構(gòu)如EcoRⅠ切割后產(chǎn)生5ˊ粘性末端：PstⅠ切割后產(chǎn)生3ˊ粘性末端：第四十四頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三

有一些酶沿對(duì)稱軸切斷DNA，產(chǎn)生平端或鈍端（Bluntend）,如SmaⅠ：3、反應(yīng)條件

添加緩沖液濃度：10×儲(chǔ)液

反應(yīng)最適溫度：37℃

第四十五頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第三節(jié)限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA實(shí)驗(yàn)

1、單個(gè)酶的切割反應(yīng)材料:37℃恒溫水浴箱

pBlueScriptⅡSK（DNA）雙蒸水

EcoRⅠ10×H添加緩沖液步驟：①按以下順序混合試劑：雙蒸水13uLDNA4uL10×H緩沖液2uLEcoRⅠ1uL②混勻。③37℃保溫1小時(shí)。+第四十六頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期三④確認(rèn)酶是否切完全（取1~4uL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳）。⑤剩余的反應(yīng)液用于以后的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中注意：1、酶較昂貴，注意節(jié)約，加樣中可能會(huì)失敗，故最后添加酶。2、反應(yīng)體系中加入的酶量不能超過總體積的1/10。（否則將導(dǎo)致第二活力）。3、酶試劑中添加有甘油，應(yīng)適當(dāng)離心后混勻，切忌用旋渦混合器等劇烈震蕩，否則可致酶失