實驗四氨基酸紙層析

實驗四氨基酸紙層析第一頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二一、實驗?zāi)康模?、本實驗采用紙色譜對幾種氨基酸進行分離和鑒定,以了解紙色譜的原理，練習(xí)其操作方法。

2、了解測定折光率的簡單原理，掌握阿貝折射儀的使用方法。第二頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

二、實驗原理1、色譜分析法（簡稱色譜法或?qū)游龇ǎ┥V分析法簡稱色譜法或?qū)游龇ā?906年，俄國植物學(xué)家Tsweet將CaCO3放在豎立的玻璃柱中，從頂端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚沖洗。在柱的不同部位形成色帶，因而命名為色譜。管內(nèi)填充物稱為固定相，沖洗劑稱為流動相。色譜法就是利用混合物中各組分在固定相和移動相中進行反復(fù)的吸附或分配作用，達到各組分分開的目的。

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分類:(1)按照被分離物質(zhì)在固定相中的作用原理不同，色譜法可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜等。(2)按照操作方式不同，又可分為柱色譜、薄層色譜、紙色譜、氣相色譜、和高效液相色譜等。第四頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

紙色譜為分配色譜，色譜過程在固定相構(gòu)成的平面狀層下進行。濾紙為載體，固定相為濾紙上的水，流動相（展開劑）為用水飽和過的有機溶劑。紙色譜屬于分配色譜。衡量物質(zhì)向上移動的物理量是比移值（Rf）第五頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二例:大黃中游離蒽醌的紙色譜圖溶劑前沿大黃素甲醚蘆薈大黃素大黃素大黃酸點樣點第六頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

２、化合物的折光率

折光率象沸點一樣，是液體有機物最重要的物理常數(shù)之一。衡量液體有機物純度的標(biāo)準(zhǔn)，折光率比沸點更可靠。利用折光率不僅可鑒定未知物，且可確定沸點和結(jié)構(gòu)相似的液體混合物的組成。

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液體的折光率不但與結(jié)構(gòu)和入射光的波長有關(guān)，而且也受溫度、壓力等因素的影響。由于大氣的變化對折光率的測定影響并不顯著，所以，通常表示折光率時只標(biāo)明入射光線的波長和測定時的溫度。例如，在入射光為鈉的黃光(波長為589.3nm)，測定溫度為20℃時，水的折光率為1.3330，表示為=

1．3330。這里n代表折光率，20代表測定時的溫度，D代表鈉光。

折光率可以通過折光儀精確地測定出來，常用的是阿貝(Abble)折射儀。第八頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

阿貝折射儀基本原理

在一定的外界(如溫度、壓力等)條件下，波長一定的單色光從介質(zhì)A斜射入介質(zhì)B時，要發(fā)生折射現(xiàn)象。其入射角α與折射β的正弦之比是一個常數(shù)，并且與這兩個介質(zhì)的折射率nA(介質(zhì)A)、nB(介質(zhì)B)成反比。即：根據(jù)折射定律可得：

當(dāng)則所以(折射角的最大值，稱為臨界角)

時sin0=1

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在臨界角以內(nèi)的區(qū)域都有光線通過,是明亮的，在臨界角以外的區(qū)域沒有光線通過，是暗的。在臨界角上正好是“半明半暗”（如圖4-2所示）。目鏡上有一個十字交叉線，若十字交叉線與明暗分界線重合，就表示光線由被測液體進入棱鏡時的入射角正好為90。

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由于,棱鏡的折光率nB是常數(shù)，各種液體的折光率不同，臨界角也不同。通過測定臨界角的相對位置，經(jīng)過換算就可以找出液體的折光率，阿貝折光儀的刻度是經(jīng)過換算后的折光率的讀數(shù)，故可直接讀出折光率。第十一頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

阿貝(Abbe)折光儀

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阿貝(Abbe)折光儀

阿貝（Abbe）折光儀的結(jié)構(gòu)如圖。它的主要組成部分是兩塊直角棱鏡組成的棱鏡組，上面一塊是表面光滑的測量棱鏡，下面一塊是表面磨砂的可以開啟的輔助棱鏡。左面的鏡筒是讀數(shù)鏡筒，內(nèi)有刻度盤，其上面有兩行數(shù)值。右邊一行是折射率數(shù)值（1.3000～1.7000），左邊一行是工業(yè)上測量溶液濃度的標(biāo)度（0～95%）。右面的鏡筒是測量目鏡，用來觀察折光情況。筒內(nèi)裝有消色散棱鏡。光線由反射鏡射入輔助棱鏡，發(fā)生漫射，以不同人射角射入液層，然后再射到測量棱鏡的表面上。此時一部分光線經(jīng)折射后進入測量目鏡，另一部分光線則發(fā)生全反射。調(diào)節(jié)螺旋，以使測量目鏡中的視野半明半暗。第十三頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

三、實驗步驟（一）紙層析1．在濾紙條上端邊緣約1厘米的中央剪一小孔。2．將濾紙條平放于潔凈的紙上，在距離濾紙下端1cm處用鉛筆輕畫一橫線，并在橫線的中央畫一直徑為2mm的小圓圈。3．用毛細管吸取氨基酸混合液，在濾紙條下端的小圓圈內(nèi)點樣。第十四頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

4.取干燥大試管，加入被水飽和的酚溶液10ml，注意勿使溶液沾到試管壁上，將試管垂直固定于鐵架臺上。5.在距濾紙條下端0.5cm處穿大頭針。從濾紙條上端小孔處穿棉線并左右分開，調(diào)節(jié)線的高度使濾紙垂直懸于試管內(nèi)且下湍浸入溶液0.5cm，注意勿使點樣點浸入溶液中，亦勿使濾紙條接觸試管壁。6.此時即可看到溶劑向上移動，溶劑升到一定高度時，小心將紙條取出，以鉛筆標(biāo)出溶劑上升的前沿。第十五頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

7.將濾紙條兩端，用大頭針釘在小木框上，吹干后用噴霧器均勻地噴一層0.2%茚三酮乙醇溶液，然后再將濾紙條吹干，即可看到紙上顯出三色點，每個色點代表一種氨基酸。8.分別測量并計算三種氨基酸的Rf，再根據(jù)教師供給的值確定此三個色點各為何種氨基酸。9.留在試管內(nèi)的酚溶劑切勿棄去，塞緊塞子。氨基酸

Rf值蛋氨酸

0.84丙氨酸

0.62谷氨酸

0.32第十六頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

（二）折光率的測定1、折光儀讀數(shù)的校正

（1）將阿貝折光儀置于普通白熾燈前或靠近窗戶的桌子上。但不要放在直射的陽光下，以免液體試樣迅速蒸發(fā)。將溫度計插人金屬匣中，然后接道恒溫水，恒溫20min左右。恒溫溫度可以從溫度計中讀出。（2）旋開棱鏡鎖緊扳手，開啟鋪助棱鏡，用按鏡紙蘸少量乙酸（或丙酮）輕輕揩拭鏡面。待鏡面干燥后，滴加1～2滴蒸餾水于輔助棱鏡面上，旋緊棱鏡鎖緊扳手，使蒸餾水均勻地充滿視場，注意不要有氣泡。

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（3）調(diào)節(jié)反光鏡，使從測量目鏡中觀察到的視場最亮。調(diào)節(jié)目鏡，使聚焦于“十”字的支點上。調(diào)整消色散棱鏡手輪，使視場中呈現(xiàn)黑白分界線。轉(zhuǎn)動棱鏡轉(zhuǎn)動手輪，使黑白分界線恰與“十”字的交點重合。（4）記下蒸餾水的折光率，重復(fù)操作2～3次，與標(biāo)準(zhǔn)值比較，得到零點的校正值。第十八頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

2、加樣

打開棱鏡，用擦鏡紙(必要時用絲絹沾少量乙醇或丙酮)輕輕擦洗上下鏡面，要單向擦，不要來回擦。待溶劑揮發(fā)后，滴1～2滴待測液體于磨砂棱鏡面上,小心地關(guān)閉棱鏡，使液體鋪滿整個鏡面。3、對光

調(diào)節(jié)反光鏡使入射光達到最強，目鏡內(nèi)視場明亮，輕輕轉(zhuǎn)動棱鏡調(diào)節(jié)旋鈕，直到在望遠鏡內(nèi)觀察到明暗分界線或彩色光帶。第十九頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二4、消色

轉(zhuǎn)動棱鏡微調(diào)旋紐（消色散）至看到一個黑白明晰的分界線,如圖所示.轉(zhuǎn)動棱鏡調(diào)節(jié)旋鈕使分界線對準(zhǔn)十字交叉線的中心。

5、精調(diào)第二十頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二

6、讀數(shù)

從鏡筒讀出折光率（位于下面的刻度）并記下測定時的溫度,重復(fù)2～3次．7、清洗

測好樣品后，用擦鏡紙輕輕擦去上下鏡面上的液體，再用乙醇或丙酮潤濕的擦鏡紙單向擦上下鏡面，待棱鏡干后，旋緊鎖鈕.

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1．層析缸要預(yù)先飽和，展開劑勿附著于大試管內(nèi)壁。2．點樣量要適當(dāng)，太少效果不明顯，太多分離不好。要求點的樣直徑不超過０.５ｃｍ。３．無論在準(zhǔn)備工作中還是以后的實驗過程中，都不要用手觸摸紙條中部，因為手上不干凈物或皮屑落在紙上會產(chǎn)生多余斑點而干擾實驗結(jié)果．4．樣品點不能浸入展開劑中。注意：

第二十二頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二5．Abbe折光儀使用前,必須用重蒸餾水(=1.3330)或標(biāo)準(zhǔn)折光玻璃塊校正.每次測定前、后都必需用1～2滴丙酮或乙醇滴于棱鏡面上，合上棱鏡，使上下鏡面全部被丙酮潤濕再打開棱鏡，然后用擦鏡紙擦干丙酮。6．嚴(yán)禁腐蝕性液體、強酸、強堿、氟化物等的使用。7．阿貝折射儀的關(guān)鍵部位是棱鏡，必須注意保護。滴加液體時，滴管的末端切不可觸及棱鏡，擦洗棱鏡時要單向擦，不要來回擦，以免在鏡面上造成痕跡。在每次滴加樣品前應(yīng)洗凈鏡面，測完樣品后也要用丙酮或95％乙醇擦洗鏡面，待晾干后再關(guān)閉棱鏡。

第二十三頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期二8．阿貝折射儀的量程為1．3000一1．7000，精密度為土0．0001，通常用四位有效數(shù)字進行記錄。測量溫度應(yīng)控制在±0．1℃范圍內(nèi)。9．阿貝折射儀不能在較高溫度下使用。第二十