實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞器的分離與觀察

實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞器的分離與觀察第一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞器的分離原理掌握差速離心和密度梯度離心技術(shù)第二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞器是細(xì)胞中維持細(xì)胞復(fù)雜生命活動的功能性器官，為了研究各種細(xì)胞器的功能，首先就要將這些細(xì)胞器從細(xì)胞中分離出來。利用各種物理方法（研磨、超聲波振蕩、低滲等將組織制成勻漿，細(xì)胞中的個中亞組分即從細(xì)胞中釋放出來。細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器大小密度存在差異，因此不同細(xì)胞器在介質(zhì)中的沉降系數(shù)各不相同。根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法來分離不同的細(xì)胞器。分級分離的方法有差速離心和密度梯度離心兩種。第三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。第四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二

(1)細(xì)胞勻漿(Homogenization)：低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)(即0.25mol／L蔗糖)進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。第五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二

(2)分級分離(Fractionation)：由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時均勻分布在整個離心管中，所以每級離心得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化.第六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二

(3)分析：分級分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。第七頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二Unna染色法（甲基綠-派洛寧染色）

細(xì)胞核分析：甲基綠-派洛寧對DNA和RNA有選擇性的染色效果。核酸是酸性的，它們對于堿性染料甲基綠和派洛寧的親和力不同，而使這兩種染料對兩類核酸具有了選擇性。DNA被甲基綠染成綠色，RNA被派洛寧染成紅色，這樣就能使細(xì)胞中兩種核酸分布顯示出來。

第八頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二第九頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二

活體染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表現(xiàn)帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。第十頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二中性紅-詹納斯綠染色線粒體分析：詹納斯綠（JanusgreenB）是對線粒體專一的活細(xì)胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。由于線粒體內(nèi)具有細(xì)胞色素氧化酶系，能使詹納斯綠保持在氧化狀態(tài)（淡藍(lán)綠色）。中性紅為弱堿性染料，對液泡系(即高爾基體)的染色有專一性，將活細(xì)胞中的液泡系染紅色。

第十一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的線粒體分布第十二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二植物根尖液泡的中性紅染色第十三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二三、材料和試劑材料：小鼠的肝臟器材：高速冷凍離心機(jī)、天平、顯微鏡、Eppendorf管、冰塊、冰盒、載玻片、蓋玻片、玻璃勻漿器試劑：生理鹽水、0.25mol/L蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、甲基綠-派洛寧染液、中性紅-詹納斯綠染液。第十四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.細(xì)胞核的分離（1）組織勻漿:將饑餓24h的大白鼠處死,立即剪開腹部,迅速取出肝組織浸入預(yù)冷的生理鹽水,洗去血污,用濾紙吸干。稱取0.5g肝組織,在小燒杯中剪碎,用預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗滌數(shù)次。將燒杯中的懸浮肝組織倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿,勻漿過程要在冰浴中進(jìn)行。勻漿完畢,移入1.5ml離心管中。第十五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二（2）離心：低溫離心機(jī)（4℃）中進(jìn)行。每次離心前一定要在天平（托盤天平）上將兩離心管配平。第一次以600g(3005rpm)離心10min。將其上清夜移入Eppendorf管中，蓋好蓋子置于冰浴中，留待后面使用（分離線粒體）。沉淀使用1ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液離心洗滌2次，每次1000g(3880rpm)離心10min。第十六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二（3）純化：將沉淀用5倍體積0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混懸，用長針頭注射器再混懸液下輕輕加入4倍體積0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。盡量使兩種溶液明顯分層。以1500g(4752rpm)離心15～20min。棄上清液，沉淀即為經(jīng)過純化的細(xì)胞核，用PBS溶液懸浮，4?C保存。第十七頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二細(xì)胞經(jīng)甲基綠-派洛寧混合液處理后，其中的DNA和RNA出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng)，一般認(rèn)為這是由于帶有負(fù)電荷的核酸對堿性染料派洛寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的DNA呈藍(lán)綠色，派洛寧染低聚分子的RNA呈紅色。

第十八頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二下次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

（4）鑒定：將分離純化的細(xì)胞核制成涂片，空氣干燥。將干燥的涂片浸入95％乙醇溶液固定5min，晾干，滴加甲基綠-派洛寧染液染色20～30min，丙酮分色30s，蒸餾水漂洗，濾紙吸干水，鏡檢。核DNA呈藍(lán)綠色，核仁和混雜的細(xì)胞質(zhì)RNA呈紅色。第十九頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.線粒體提取分離過程中，為什么要在0～4℃進(jìn)行？2.要獲得高活性的線粒體，在線粒體提取、分離和活性鑒定的過程中需注意哪些問題？根據(jù)你的實(shí)際體會，寫出操作注意事項(xiàng)及改進(jìn)方法。3.分離介質(zhì)0.34mol/L及0.88mol/L緩沖蔗糖溶液哪一種在下層?有什么作用?第二十頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二2.線粒體的分離(1)分離:將分離細(xì)胞核時收集的上清液以10000g(12270rpm)離心10min。沉淀用預(yù)冷0.25mol/L蔗糖溶液懸浮,10000g離心10min,反復(fù)2次。(2)鑒定:在干凈的載玻片中央滴加1～2滴中性紅-詹納斯綠染液,用牙簽挑取沉淀物均勻涂片。蓋上蓋片,染色5min,鏡檢。線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或圓形。

第二十一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果核DNA呈藍(lán)綠色，核仁和混雜的細(xì)胞質(zhì)RNA呈紅色。線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或圓形。觀察每個視野中所見完整細(xì)胞核和線粒體的數(shù)量及純度。第二十二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二差速離心

（differentialcentrifugation）主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的。第二十三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二第二十四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二沉淀轉(zhuǎn)速x時間內(nèi)

容

物

A150gx20min完整細(xì)胞

B1000gx20min細(xì)胞核，細(xì)胞碎片C3000gx6min葉綠體

D10000gx20min線粒體、溶酶體、微體

E105000gx120min微粒體

F105000gx20min0.26%脫氧膽酸納

核糖體

第二十五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二密度梯度離心

（densitygradientcentrifugation）

用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。第二十六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期二如果分離的顆粒在