高三生物多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段課件

高三生物多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段課件第一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二一、基礎(chǔ)知識（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二一、基礎(chǔ)知識1、組成元素（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二一、基礎(chǔ)知識C、H、O、N、P1、組成元素（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二一、基礎(chǔ)知識C、H、O、N、P1、組成元素2、基本單位（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二一、基礎(chǔ)知識C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、基本單位（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二一、基礎(chǔ)知識C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、基本單位3、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式第八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’堿基脫氧核糖磷酸基團堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖第九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二連接第十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二連接ATGC第十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二連接ATGCATGC第十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二連接ATGCATGC第十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二連接ATGCATGC3'端（含羥基）第十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二連接ATGCATGC5'端含磷酸基團3'端（含羥基）第十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二連接ATGCATGC5'端含磷酸基團3'端（含羥基）3'端第十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二連接ATGCATGC5'端含磷酸基團3'端（含羥基）3'端5'端第十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)第十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)①DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)第十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)①DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)②脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè)第二十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二③兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對。5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)第二十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（三）DNA的復(fù)制2、時期3、場所1、概念第二十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（三）DNA的復(fù)制2、時期3、場所1、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程第二十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（三）DNA的復(fù)制2、時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場所1、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程第二十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（三）DNA的復(fù)制2、時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場所細胞核（主）、線粒體、葉綠體1、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程第二十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、原材料6、基本條件4、模板第二十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、原材料6、基本條件4、模板DNA母鏈第二十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、原材料脫氧核苷酸6、基本條件4、模板DNA母鏈第二十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、原材料脫氧核苷酸6、基本條件酶、ATP、原料、模板4、模板DNA母鏈第二十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二7、復(fù)制過程第三十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二7、復(fù)制過程①DNA的解旋第三十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二7、復(fù)制過程①DNA的解旋親代DNA分子利用細胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈第三十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA聚合酶的特性

DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。

第三十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二②RNA引物的合成第三十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二②RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物第三十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二②RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成第三十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二②RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。第三十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二④切掉引物生成岡崎片斷第三十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時的DNA片斷稱為岡崎片斷第三十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時的DNA片斷稱為岡崎片斷⑤DNA片斷的連接第四十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時的DNA片斷稱為岡崎片斷⑤DNA片斷的連接在DNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的DNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的DNA第四十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第四十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA合成的方向從子鏈由5’端向3’端延伸第四十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二思考：DAN復(fù)制的前提是什么？體外擴增DNA如何打開雙鏈？第四十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA復(fù)制的前提是______________；用_________________方法思考：DAN復(fù)制的前提是什么？體外擴增DNA如何打開雙鏈？第四十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA復(fù)制的前提是______________；用_________________方法思考：DAN復(fù)制的前提是什么？體外擴增DNA如何打開雙鏈？雙鏈的解開第四十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA復(fù)制的前提是______________；用_________________方法思考：DAN復(fù)制的前提是什么？體外擴增DNA如何打開雙鏈？雙鏈的解開控制溫度第四十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二4.DNA分子的熱變性原理：第四十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA雙鏈4.DNA分子的熱變性原理：第四十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA雙鏈變性（加熱80-100℃）4.DNA分子的熱變性原理：第五十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）4.DNA分子的熱變性原理：第五十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）4.DNA分子的熱變性原理：第五十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：4.DNA分子的熱變性原理：第五十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：解開雙鏈4.DNA分子的熱變性原理：第五十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈4.DNA分子的熱變性原理：第五十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ與兩條單鏈的結(jié)合4.DNA分子的熱變性原理：第五十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二思考：高溫使DNA解旋，但普通DNA聚合酶會失活，__________________找到耐高溫DNA聚合酶。第五十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二思考：高溫使DNA解旋，但普通DNA聚合酶會失活，__________________找到耐高溫DNA聚合酶。托馬斯.布魯克第五十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)第五十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；第六十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；第六十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；③四種脫氧核苷酸；第六十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；③四種脫氧核苷酸；④耐高溫的聚合酶；第六十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；③四種脫氧核苷酸；④耐高溫的聚合酶；⑤控制溫度，但不需解旋酶。第六十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（五）

PCR的反應(yīng)過程1、PCR的反應(yīng)步驟第六十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（五）

PCR的反應(yīng)過程1、PCR的反應(yīng)步驟

PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復(fù)性和延伸第六十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二①變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備。2、循環(huán)過程第六十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性第六十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二②復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合第六十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火第七十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二③延伸

DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈第七十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸第七十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二靶序列

靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個拷貝的靶序列第七十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二3、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量第七十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二3、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量第七十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量第七十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二4、PCR循環(huán)的結(jié)果第七十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二4、PCR循環(huán)的結(jié)果①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行DNA的延伸第七十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二4、PCR循環(huán)的結(jié)果②DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行DNA的延伸第七十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二95℃變性（1）PCR循環(huán)——變性第八十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（1）PCR循環(huán)——變性95℃變性第八十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二95℃變性（1）PCR循環(huán)——變性第八十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二55℃復(fù)性（2）PCR循環(huán)—復(fù)性第八十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（3）PCR循環(huán)—延伸第八十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（3）PCR循環(huán)—延伸第八十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（3）PCR循環(huán)—延伸第八十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（3）PCR循環(huán)—延伸第八十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第八十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第八十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第九十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第九十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二4、循環(huán)特點：①上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板②結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無引物存于兩個子代DNA分子中③其它子代DNA分子都為雙引物分子式④處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長1×2N第九十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二二、實驗步驟第九十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二①準備好PCR反應(yīng)體系的配方二、實驗步驟第九十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二①準備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分二、實驗步驟第九十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二①準備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分③蓋嚴蓋子，用手指輕輕彈擊管壁二、實驗步驟第九十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二①準備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分③蓋嚴蓋子，用手指輕輕彈擊管壁④離心10分鐘二、實驗步驟第九十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二①準備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分③蓋嚴蓋子，用手指輕輕彈擊管壁④離心10分鐘⑤將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序二、實驗步驟第九十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二①準備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分③蓋嚴蓋子，用手指輕輕彈擊管壁④離心10分鐘⑤將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序⑥電泳檢測PCR結(jié)果二、實驗步驟第九十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二

1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌。

2．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。三、操作提示第一百頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二

3．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心管放在離心機上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中進行反應(yīng)。第一百零一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二目的：避免外源性DNA大量擴增造成假陽性反應(yīng)。第一百零二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1、原理：DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰(圖5-11)?？梢岳肈NA的這一特點進行DNA含量的測定。四、結(jié)果分析與評價第一百零三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二四、結(jié)果分析與評價(了解)2、具體方法如下。1）將樣品進行50倍稀釋：取2μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水。2）以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光

光度計(圖5-12)的讀數(shù)

調(diào)節(jié)至零。第一百零四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二3）加入步驟1中的DNA稀釋液100L至比色杯中，測定260nm處的光吸收值。4）根據(jù)下面的公式計算DNA含量。

DNA含量(μg/ml)=50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)第一百零五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二五、課題延伸第一百零六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1、PCR優(yōu)點：五、課題延伸第一百零七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二原理雖然復(fù)雜，但操作卻十分簡單?？焖佟⒏咝?、靈活和易于操作。1、PCR優(yōu)點：五、課題延伸第一百零八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二原理雖然復(fù)雜，但操作卻十分簡單?？焖?、高效、靈活和易于操作。1、PCR優(yōu)點：2、PCR技術(shù)的意義五、課題延伸第一百零九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二復(fù)習：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別第一百一十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二復(fù)習：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；第一百一十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二復(fù)習：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時會變性；第一百一十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二復(fù)習：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時會變性；3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。第一百一十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1.DNA單鏈的________末端為3'端，________末端為5'端，在DNA復(fù)制時，引物從模板鏈的______端配對結(jié)合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子鏈向下延伸。2.每次循環(huán)可以分為_________________這三個過程，對應(yīng)溫度分別為_______________________。練習第一百一十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1.DNA單鏈的________末端為3'端，________末端為5'端，在DNA復(fù)制時，引物從模板鏈的______端配對結(jié)合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子鏈向下延伸。2.每次循環(huán)可以分為_________________這三個過程，對應(yīng)溫度分別為_______________________。羥基練習第一百一十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1.DNA單鏈的________末端為3'端，________末端為5'端，在DNA復(fù)制時，引物從模板鏈的______端配對結(jié)合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子鏈向下延伸。2.每次循環(huán)可以分為_________________這三個過程，對應(yīng)溫度分別為_______________________。磷酸基團羥基練習第一百一十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1.DNA單鏈的________末端為3'端，________末端為5'端，在DNA復(fù)制時，引物從模板鏈的______端配對結(jié)合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子鏈向下延伸。2.每次循環(huán)可以分為