免疫病原微生物學進展

基因工程疫苗制備原理與產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀Lecture19重組疫苗（基因缺失疫苗）重組載活體疫苗重組亞單位疫苗基因疫苗轉(zhuǎn)基因植物疫苗基因工程疫苗種類“標記”疫苗

基因添加疫苗

野病毒基因弱毒病毒基因非毒力基因鑒定克隆該關鍵基因至質(zhì)粒將該關鍵基因與野毒株基因結合穩(wěn)定低毒力基因

重組病毒構建原理（I)1.該類疫苗安全性好、不易返祖；2.免疫接種與強毒感染相似，機體可對病毒多種抗原產(chǎn)生免疫應答；3.免疫力堅實，免疫期長，局部接種，誘導產(chǎn)生粘膜免疫力;。4.缺失的基因及其編碼的產(chǎn)物可作為一種檢測標志用于免疫與感染動物的鑒別診斷。

基因缺失疫苗genedeletedvaccines優(yōu)點:缺失與毒力相關基因及病毒復制非必需的基因常被缺失基因：胸腺激酶基因(TK)

痘苗病毒TK基因缺失單純皰疹病毒(HSV)的22毒力基因缺失、TK基因缺失牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)TK基因缺失疫苗缺點是疫苗病毒具有潛伏性偽狂犬病病毒TK基因缺失苗

1986年獲美國農(nóng)業(yè)部批準投放市場缺失非必需基因

單復制周期病毒(Single-cycleviruses)

缺失的基因只是在病毒進入細胞時所必需病毒可完成其復制周期，也可從感染細胞釋放出來，但釋放的病毒無感染性缺失糖蛋白H基因的單純皰疹病毒

復制缺陷型病毒(replicationdefectivevirus)

流產(chǎn)性感染（如：雞痘病毒與金絲雀痘病毒）病毒復制早期蛋白基因，E1a缺失的腺病毒

缺失必需基因

如缺失gH糖蛋白的HSV突變株在免疫宿主的細胞中能完成一個復制周期，但在體內(nèi)還是體外均不在細胞間傳染，將此疫苗用于鼠模型中，可產(chǎn)生與野毒株感染一樣強的免疫反應。能抵抗HSV-1強毒攻擊，該疫苗的保護效果、細胞免疫水平比滅活苗高。單復制周期病毒產(chǎn)生的病毒特異性CTLs與野毒感染相同?；蛉笔缂嬗腥醵疽呙缂皽缁钜呙绲膬?yōu)點。偽狂犬病毒缺失疫苗：缺失gD基因的PRV雖可在動物體內(nèi)細胞間傳染，但不會在畜群間傳播。

缺失越是后期必需的基因，誘發(fā)的免疫反應越強從cDNA克隆拯救感染性病毒

病毒全長感染性cDNA克隆技術反向遺傳操作技術(ReverseGenetics)

“病毒拯救(rescueofvirus)

重組病毒構建原理（II)“分段克隆”策略：將病毒基因組各片段順次克隆。低拷貝載體：復制嚴謹性較高沉默突變：在構建cDNA克隆時，一般均在一處或幾處合適的位置上進行沉默突變，便于鑒定拯救出的病毒。基因組3’末端和5’末端的克隆采用cDNA末端快速擴增法(RACE)

基因組全長片段的克隆Menlenbarg等（2000，2003）NSPGP2GP3GP4GP5MN

FMDV蛋白酶2A基因

人A型流感病毒HA基因抗原表位

感染性cDNA克隆舉例

mRNABHK21細胞病毒子接點插入位點PRRSVNDV--微型基因組的構建與共轉(zhuǎn)染啟動子病毒基因組片段病毒前導序列尾隨序列輔助重組質(zhì)粒NP、P和L蛋白共轉(zhuǎn)染微型基因組流感病毒:NP、PB1、PB2、PA

Menlenbarg等（2000，2003）NSPGP2GP3GP4GP5MN

FMDV蛋白酶2A基因

人A型流感病毒HA基因抗原表位

感染性cDNA克隆舉例

mRNABHK21細胞病毒子接點插入位點PRRSV病毒復制非必需片段基因鑒定病毒復制非必需片段基因克隆外源基因插入非必需片段基因中間(即重組載體)將病毒基因和重組載體基因共轉(zhuǎn)染至細胞，同源重組，產(chǎn)生感染性病毒粒子篩選穩(wěn)定的重組病毒重組病毒活載體研制原理重組病毒載體

痘病毒載體

(fowlpox,canarypox)

皰疹病毒載體桿狀病毒載體腺病毒載體

RNA病毒

NDV，PRRSV，PoliovirusSindbisvirus(Alphaviruses)

痘病毒載體基因組容量大、含多個非必需區(qū)基因，適于插入多個外源基因(可達40kb)，易于構建，表達水平高。宿主范圍廣、增殖滴度高、抗原性穩(wěn)定，免疫原性持久，能夠同時誘發(fā)體液和細胞免疫，相對安全。

缺點：種痘后局部反應較大。(百萬分之一)

抗原性強，不能多次使用。禽類痘病毒，引起頓挫型感染，但卻可以持續(xù)表達外源基因，并且不影響再次接種

痘病毒載體①啟動子②外源病毒結構蛋白基因③終止子④非必需區(qū)同源序列痘病毒載體構建時，應考慮的主要因素①啟動子痘病毒與其他大多數(shù)DNA病毒不同，是在胞漿內(nèi)復制，病毒DNA轉(zhuǎn)錄時，必須靠其自身合成的RNA聚合酶，因此在痘病毒內(nèi)表達外源基因時，必須使用痘病毒自身的啟動子。在痘苗病毒和禽痘病毒載體構建時，外源基因前多使用來自于痘苗病毒的早期啟動子P7.5，或晚期啟動子PL11。②外源病毒結構蛋白基因由于痘病毒不具有編接機制，外源病毒結構蛋白基因應為其連續(xù)編碼區(qū)，不能有內(nèi)含子或間隔區(qū)。③終止子為了不影響痘病毒載體基因的正常表達，在使用早期啟動子時，在3′末端加上早期基因轉(zhuǎn)錄終止子T5NT；采用晚期啟動子時不必考慮終止子問題，晚期啟動子的轉(zhuǎn)錄可在痘病毒基因組中被終止。痘病毒不識別其他真核基因的轉(zhuǎn)錄終止子。④非必需區(qū)同源序列由于將外源性病毒基因?qū)攵徊《镜臋C制是同源重組，因此，在構建載體時，必須在外源目的基因及啟動子兩側帶有痘病毒基因組的同源序列。同源序列一般取自于病毒復制非必需區(qū)，這樣可以保證病毒的復制能力不受影響。痘病毒載體中表達的外源基因V.VHIVgag/pol，core，gp160，envFPVNDVHA/NA，F(xiàn)usion，F(xiàn)usion/HA/NPV.VPRVgp50/gp63,gp50/63/I/XCPVMeaslesF/HA,FusionV.V/CPVRabiesGV.V.InfluenzaHAFPVIBDVVP2V.V.FLVenv表達狂犬病病毒G蛋白的重組痘苗病毒表達牛瘟病毒F和HA蛋白的重組痘苗病毒疫苗表達新城疫病毒F和HN蛋白表達禽流感病毒的HA和NP蛋白馬立克氏病毒SB糖蛋白禽白血病囊膜蛋白傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白牛白血病病毒膜蛋白貓白血病毒膜蛋白牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒囊膜蛋白痘病毒活載體疫苗舉例

人Ad2和Ad5：外源基因容量為20kb左右。

E3：病毒復制的非必須區(qū)，允許插入的外源基因的最大長度為4.0Kb。外源基因一般不需要加基因表達調(diào)控元件，利用腺病毒本身的調(diào)節(jié)元件，即外源基因可插在E3啟動子后,在感染早期有效表達。[HSsAg、HIV-1、狂犬病毒]E1：為病毒復制必須區(qū)。缺失E1區(qū)的人腺病毒必須在特殊的工程細胞中（比如293細胞系（人胚腎細胞））或非缺失的腺病毒輔助下才能復制增殖，因此稱為病毒缺陷型載體。腺病毒載體腺病毒載體優(yōu)點

腺病毒比較安全。腺病毒的靶細胞范圍廣:復制分裂細胞、非復制分裂細胞。腺病毒容易制備，對熱不敏感，高滴度增殖。腺病毒可以在腸道及呼吸道繁殖，能誘導粘膜免疫，能制成藥囊經(jīng)口服途徑接種以預防消化道及呼吸道感染。

Ad2、Ad5等啟動子較強，能高水平表達外源基因，特別是換以更強的啟動子如CMV早期啟動子后，更可明顯提高外源基因的表達水平。常規(guī)的構建方法：

在E1區(qū)插入一個表達盒：包括啟動子、外源基因和polyA序列

啟動子：巨細胞病毒(CMV)早期啟動子

Rous肉瘤病毒(RSV)長末端重復(ITR)/增強子序列，腺病毒主要晚期啟動子(MLP)和三聯(lián)先導序列(TPL)。表達盒的方向?qū)τ诒磉_不太重要，但有文章報道以CMV早期啟動子的表達盒右向表達β-gal比反向的表達的高7倍。缺失E1的病毒載體安全E3區(qū)編碼的gp19蛋白降低感染細胞MHC-I類抗原的表達，因而缺失該基因的載體可以更有效地將外源基因提供給宿主免疫系統(tǒng)B型肝炎病毒、呼吸道合胞體病毒

HIV、SIV

水皰性口炎病毒狂犬病病毒牛副粘病毒3型牛皰疹病毒I型牛冠狀病毒豬傳染性胃腸炎病毒

重組腺病毒構建成功舉例基因組較大，約150kb，含70個編碼基因，其中至少20%的基因是非必需基因，可容納多個外源基因的插入。大多數(shù)皰疹病毒的宿主范圍很窄，其重組病毒的使用不會產(chǎn)生流行病學方面的不良后果(偽狂犬病毒除外)

。許多皰疹病毒經(jīng)粘膜途徑感染，構建的載體活疫苗可經(jīng)粘膜途徑提呈抗原，誘導特異性粘膜免疫。皰疹病毒作為活載體表達外源基因作為疫苗的研究：

皰疹病毒載體火雞皰疹病毒活載體

NDVF和HN基因，

HVT/MDVgB重組病毒:CEF:2.2×105PFU/ml。

HVT/緩發(fā)型NDVHitchnerB1株的F和HN基因

HVT/IBDVVP2基因。皰疹病毒活載體的應用

豬偽狂犬病病毒弱毒株構建活載體疫苗口蹄疫病毒VPl基因豬瘟病毒E2基因豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因豬流感病毒HA基因牛I型皰疹病毒

FMDVVP1基因、PRV的gⅢ基因雞傳染性喉氣管炎病毒禽流感病毒HA基因皰疹病毒活載體的應用

脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)疫苗安全、可口服，易增殖，滴度高。

PV表達的外源性病毒蛋白以嵌合的形式存在于病毒顆粒表面可以構建成多價載體疫苗病毒基因組容量較小，插入的外源基因片段大小有限插入不當會造成致死性突變形成的嵌合體病毒增殖較慢外源性病毒抗原的免疫原性較弱

PV-人免疫缺陷病毒、PV-人乳頭瘤病毒嵌合體病毒

PV-FMDV嵌合體病毒小RNA病毒載體

負鏈RNA病毒，RNA沒有感染性，不能自行復制。流感病毒核糖核蛋白體(RNP)的重組及轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，可以使重組的RNA能夠復制并具有感染性，即用提純的病毒轉(zhuǎn)染進已被輔助病毒感染的細胞。流感病毒可以同時誘導體液免疫和細胞免疫，并能產(chǎn)生

IgA介導的粘膜免疫流感病毒載體

反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期中，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為前病毒DNA，并整合到宿主細胞的染色體中，因此，同其它RNA病毒相比，構建感染性前病毒分子克隆相對容易。基因組8～10kb，非必需區(qū)很小，外源基因的容量很小?？勺鳛閷⑼庠椿?qū)塍w細胞的工具，用于基因治療。表達禽流感病毒的血凝素(H7)基因，免疫雞用強毒株H7N7

攻擊后完全獲得保護。

反轉(zhuǎn)錄病毒載體①生產(chǎn)成本和接種使用成本低，類似于常規(guī)弱毒疫苗；②能真實地再現(xiàn)外源基因編碼蛋白后的抗原性，并能全方位地激發(fā)免疫應管，包括細胞介導免疫，體液免疫以及局部規(guī)模免疫；③提呈免疫的單一性類似亞單位疫苗，但不需佐劑，如果載體病毒安全，則不會引起疾??；④免疫接種和自然感染動物，用特異性診斷試劑可進行鑒別；⑤在同一病毒載體中插入多種免疫原基因，可構建多價疫苗。具備活疫苗的免疫效力和低成本及滅活疫苗的安全性。病毒活載體疫苗優(yōu)缺點小結優(yōu)點病毒活載體疫苗的缺點：使用同一載體的不同疫苗不能同時使用解決辦法：①構建多價疫苗②構建多種可用的載體③建立合理的免疫程序病毒活疫苗、滅活疫苗及病毒活載體疫苗配合應用。

格氏鏈球菌、木糖鏈球菌：人的皮膚共棲菌，可作為表面定居的融合蛋白載體乳酸桿菌：腸道和陰道內(nèi)的共棲菌，但出現(xiàn)時間很短。腸道菌（大腸桿菌、霍亂弧菌、結腸耶耳森氏菌、志賀氏菌）

大腸桿菌/TGEVS蛋白的融合蛋白，CS31A:腹腔注射免疫鼠（加佐劑）刺激產(chǎn)生顯著的血清抗體應答。大腸桿菌/艾美球蟲子孢子蛋白的118氨基酸與β-半乳糖苷酶融合:接種雞，可產(chǎn)生保護性免疫應答。4.沙門氏菌

細菌性活載體

能運送抗原至腸道的淋巴組織，并引起分泌免疫反應，其中分泌性IgA浸潤所有的粘膜表面及外分泌腺體的分泌物中。傷寒沙門氏菌在人體、鼠傷寒沙門氏菌在小鼠能在寄主腸道中定居，并在腸道淋巴組織、肝和脾中增殖。沙門氏菌人工突變后，它們?nèi)阅茉谀c道淋巴組織中定居。可用于表達各種定居因子、毒性抗原基因的載體，以遞呈這些抗原到腸道淋巴組織。沙門氏菌活疫苗載體

基本特性營養(yǎng)缺陷質(zhì)粒補救系統(tǒng)

該系統(tǒng)的寄主是某一營養(yǎng)代謝物的染色體突變株，而轉(zhuǎn)移質(zhì)粒則帶有與寄主突變互補的非同源基因。整合表達系統(tǒng)細胞表面表達系統(tǒng)鞭毛表達系統(tǒng)。

沙門氏菌活載體表達系統(tǒng)FMDVVP1基因的10個氨基酸殘基的DNA片段嵌合到

E.coli.K-12菌株的外膜蛋白基因中，實現(xiàn)融合蛋白表達

E.coli外膜蛋白(Lamb)-乳多空病毒的VPl抗原決定簇乙肝病毒的S2的兩個抗原決定簇DNA片段-E.coli菌體

FMDV多肽-E.coliP4菌株纖毛大腸桿菌載體疫苗腸毒素性大腸桿菌(ETEC)-產(chǎn)氣莢膜梭菌p—毒素(羔羊痢疾、犢牛腸毒血癥等)的基因工程重組細菌毒素疫苗寧夏大學王玉炯已完成全部實驗室試驗和田間試驗在寧夏、內(nèi)蒙、遼寧、山東和吉林等省進行區(qū)域性試驗，受試羊53000只，受試牛12000頭免疫保護率達到90％以上該疫苗正在申請新獸藥證書，即將進行規(guī)?；a(chǎn)。幼畜腹瀉雙價基因工程苗

轉(zhuǎn)基因植物表達的抗原蛋白經(jīng)純化后仍保留了免疫學活性，注入動物體內(nèi)能產(chǎn)生特異性抗體；用轉(zhuǎn)基因植物組織飼喂動物，轉(zhuǎn)基因植物表達的抗原遞呈到動物的腸道相關淋巴組織，產(chǎn)生粘膜和體液免疫應答。

轉(zhuǎn)基因植物疫苗（transgenicplantvaccine）食用疫苗（ediblevaccine）

1.整合表達系統(tǒng)：把編碼病原體保護性抗原基因?qū)胫参锛毎麅?nèi)，并整合到細胞染色體上，形成表達疫苗的植物品系。2.瞬時表達系統(tǒng)：用植物病毒為載體，將編碼疫苗抗原的基因插入植物病毒基因組中。再用此重組病毒感染植物，抗原基因隨病毒在植物體內(nèi)復制、裝配而得以高效表達。轉(zhuǎn)基因植物基因工程疫苗的表達系統(tǒng)安全性好：疫苗中不含傳染性材料，接種后不會發(fā)生急性、持續(xù)或潛伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情況。減少或消除了常規(guī)疫苗有害的反應原：熱原、變應原、免疫抑制原等穩(wěn)定性好：便于保存和運輸，產(chǎn)生的免疫應答可以與感染產(chǎn)生的免疫應答相區(qū)別，因此更適合于疫病的控制和消滅計劃。將高度危險和致病的病原體的免疫原性蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)移到不致病而且無害的微生物，用于大量生產(chǎn)，安全性更好。可用于外來病病原體和不能培養(yǎng)的病原體。優(yōu)點：重組亞單位疫苗構建原理

保護性抗原的基因原核或真核表達載體

原核或真核細胞

保護性抗原肽鏈

重組亞單位疫苗佐劑

表達系統(tǒng)：

原核生物：E.coli；枯草桿菌（Bacillussubtilis）酵母真菌昆蟲細胞(桿狀病毒)

哺乳類細胞關鍵：研究和了解在各種表達系統(tǒng)中基因表