色譜分離法課件

色譜分離法薄層色譜柱色譜紙色譜實驗內(nèi)容：色譜法的基本原理是利用混合物中各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該物質(zhì)時進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配等作用，從而將各組分分開。

流動的混合物溶液稱為流動相；固定的物質(zhì)稱為固定相（可以是固體或液體）。根據(jù)組分在固定相中的作用原理不同，可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、排阻色譜等；根據(jù)操作條件不同，可分為柱色譜、紙色譜、薄層色譜、氣相色譜及高效液相色譜等類型。返回固定相（吸附劑）的要求：具有較大的表面積和一定的吸附能力與流動相及試液中各組分不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并不溶于流動相應(yīng)粒度均勻，顆粒細(xì)小常見官能團(tuán)的極性常用流動相的極性薄層色譜(ThinLayerChromatography)常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于固－液吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點。它展開時間短（幾十分鐘就能達(dá)到分離目的），分離效率高（可達(dá)到300-400塊理論塔板數(shù)）。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面若在制作薄層板時，把吸附層加厚，將樣品點成一條線，則可分離多達(dá)500mg的樣品。因此又可用來精制樣品。

薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板（10×3cm左右）上均勻的涂一層吸附劑或支持劑，待干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細(xì)管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點線上，涼干或吹干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內(nèi)，浸入深度為0.5cm。待展開劑前沿離頂端約1cm附近時，將色譜板取出，干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。記下原點至主斑點中心及展開劑前沿的距離，計算比移值（Rf）：良好的分離，Rf值應(yīng)在0.15-0.75之間1、定性分析物質(zhì)。（通過與已知標(biāo)準(zhǔn)物對比的方法進(jìn)行未知物的鑒定，檢驗物質(zhì)是否純凈）2、快速分離少量物質(zhì)。

（幾到幾十微克，甚至0.01μg）

3、跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時，常利用薄層色譜觀察原料斑點的逐步消失，來判斷反應(yīng)是否完成。4、用薄層色譜法確定柱色譜的淋洗劑。

薄層色譜的用途：此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。薄層色譜吸附劑的選擇薄層板的制作展開劑的選擇點樣與展開顯色實驗關(guān)鍵步驟：定性與定量吸附劑的選擇薄層色譜用的吸附劑和支持劑：薄層吸附色譜的吸附劑最常用的是氧化鋁和硅膠；分配色譜的支持劑為硅藻土和纖維素。

其顆粒大小一般為260目以上。顆粒太大，展開劑移動速度快，分離效果不好；反之，顆粒太小，溶劑移動太慢，斑點不集中，效果也不理想。吸附劑的活性與其含水量有關(guān)，含水量越低，活性越高。

化合物的吸附能力與分子極性有關(guān)，分子極性越強(qiáng)，吸附能力越大?；衔锏奈叫耘c它們的極性成正比，化合物分子中含有極性較大的基團(tuán)時，吸附性也較強(qiáng)，各種化合物對氧化鋁的吸附性按以下次序遞減：酸和堿

>醇、胺、硫醇

>酯、醛、酮

>芳香族化合物

>鹵代物、醚

>烯

>飽和烴硅膠：常用吸附劑。氧化鋁：用于非極性化合物的分離，根據(jù)制備時的PH不同，又分為堿性、中性和酸性。聚酰胺；分離易生成氫鍵的極性化合物。纖維素：極性有機(jī)化合物及金屬陽離子、陰離子分離。吸附劑的選擇薄層板制備的好壞直接影響色譜的結(jié)果。薄層應(yīng)盡量均勻且厚度（0.25—1mm）要固定。否則，在展開時前沿不齊，色譜結(jié)果也不易重復(fù)。

（1）平鋪法：用薄層涂布器涂布，它適合于科研工作中數(shù)量較大要求較高的需要（2）浸漬法：把兩塊干凈的玻片疊合，浸入調(diào)制好的吸附劑漿料中，取出后分開、涼干。（3）簡易平鋪法（傾注法）：將配制好的漿料傾注到清潔干燥的載玻片上，拿在手中輕輕的左右搖晃，使其表面均勻平滑，在室溫下涼干后進(jìn)行活化。

本實驗用此法制備薄層板6片：吸附劑為硅膠G（4g），用0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液（8-10ml

）調(diào)成漿料。薄層板的制作薄層板的活化將涂布好的薄層板置于室溫涼干后，放在烘箱內(nèi)加熱活化，活化條件根據(jù)需要而定。硅膠板一般在烘箱中漸漸升溫，維持105—110℃活化30min。。氧化鋁板在200℃烘4h可得到活性為Ⅱ級的薄板，在150—160℃烘4h可得活性為Ⅲ—Ⅳ級的薄板。展開劑的選擇薄層色譜展開劑的選擇，主要根據(jù)樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素來考慮。凡溶劑的極性越大，則對一化合物的洗脫能力也越大，即Rf值也越大（如果樣品在溶劑中有一定溶解度）。薄層色譜用的展開劑絕大多數(shù)是有機(jī)溶劑，

常用展開劑的極性按如下次序遞增：己烷和石油醚

<

環(huán)己烷

<

四氯化碳

<

三氯乙烯

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二硫化碳

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甲苯

<

苯

<

二氯甲烷

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氯仿

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乙醚

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乙酸乙酯

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丙酮

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丙醇

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乙醇

<

甲醇

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水

<

吡啶

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乙酸所用展開劑必須純粹和干燥，否則會影響吸附劑的活性和分離效果。

展開劑的選擇微量圓圈法點樣與展開定性分析用玻璃毛細(xì)管點樣，定量用微量注射器樣品溶液應(yīng)為均一體系通常將樣品溶于低沸點溶劑（丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚和四氯化碳）配成1%的溶液，用內(nèi)徑小于1mm管口平整的毛細(xì)管點樣：（1）先用鉛筆在距薄層板一端1cm處輕輕劃一橫線作為起始線，然后用毛細(xì)管吸取樣品，在起始線上小心點樣，斑點直徑一般不超過2mm。（2）若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點樣，但應(yīng)待前次點樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點樣，以防樣點過大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響分離效果。（3）若在同一板上點幾個樣，樣點間距離應(yīng)為1—1.5cm。（4）點樣要輕，不可刺破薄層。在薄層色譜中，樣品的用量對物質(zhì)的分離效果有很大影響，所需樣品的量與顯色劑的靈敏度、吸附劑的種類、薄層的厚度均有關(guān)系。樣品太少，斑點不清楚，難以觀察，但樣品量太多時往往出現(xiàn)斑點太大或拖尾現(xiàn)象，以至不易分開。薄層色譜的展開，需要在密閉容器中進(jìn)行。為使溶劑蒸氣迅速達(dá)到平衡，可在展開槽內(nèi)襯一濾紙。常用的展開槽有：長方形盒式和廣口瓶式

展開方式有：（1）上升法

將色譜板垂直于盛有展開劑的容器中，適合于含粘合劑的色譜板。（2）傾斜上行法

色譜板傾斜10—15°角【適用于干板或無粘合劑軟板的展開】；色譜板傾斜45—60°角，適用于含有粘合劑的色譜板。（3）下降法

用濾紙或紗布等將展開劑吸到薄層板的上端，使展開劑沿板下行，這種連續(xù)展開的方法適用于Rf值小的化合物。（4）雙向色譜法

將樣品點在方形薄層板的角上，先向一個方向展開，然后轉(zhuǎn)動90°角的位置，再換另一種展開劑展開。適合于成分復(fù)雜的化合物分離。顯色凡可用于紙色譜的顯色劑都可用于薄層色譜。薄層色譜還可使用腐蝕性的顯色劑如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸等（化學(xué)法）對于含有熒光劑（硫化鋅鎘、硅酸鋅、熒光黃）的薄層板在紫外光下觀察，展開后的有機(jī)化合物在亮的熒光背景上呈暗色斑點（紫外-熒光法）。也可用鹵素斑點試驗法（碘熏法）來使薄層色譜斑點顯色。呈現(xiàn)的斑點一般在2-3s消失，因此必須立即用鉛筆標(biāo)出化合物的位置。顯色方法：紫外-熒光法，碘熏法、化學(xué)法顯色硅膠是無定形多孔性物質(zhì)，略具酸性，適用于酸性物質(zhì)的分離和分析。薄層色譜用的硅膠分為：“硅膠H”—不含粘合劑；“硅膠G”—含煅石膏粘合劑；“硅膠HF254”—含熒光物質(zhì)，可用于波長為254nm紫外光下觀察熒光；“硅膠GF254”—既含煅石膏又含熒光劑等類型。

與硅膠相似，氧化鋁也因含粘合劑或含熒光劑而分為氧化鋁G、氧化鋁GF254及氧化鋁HF254。

粘合劑除上述的煅石膏（半水合硫酸鈣：2CaSO4·H2O）外，還可用淀粉、羧甲基纖維素鈉。通常將薄層板分為硬板（加粘合劑）和軟板（不加粘合劑）實驗關(guān)鍵步驟：1、薄層板的制備應(yīng)注意兩點：載玻片應(yīng)干凈且不被手污染及吸附劑在玻片上應(yīng)均勻平整。2、點樣與展開應(yīng)按要求進(jìn)行：點樣不能戳破薄層板面；展開時，不要讓展開劑前沿上升至底線。否則，無法確定展開劑上升高度，即無法求得Rf值和準(zhǔn)確判斷粗產(chǎn)物中各組分在薄層板上的相對位置。

定性與定量分析定性：測定比移值R,洗脫后用其他方法定性定量：溶劑洗脫-分光光度測定，板上原位直接定量（測定斑點面積法），薄層掃描。柱色譜將固定相均勻填在金屬或玻璃制成的管中做成色譜柱，并以此進(jìn)行分離的方法叫柱色譜。吸附柱色譜通常在玻璃管中填入表面積很大經(jīng)過活化的多孔性或粉狀固體吸附劑。當(dāng)待分離的混合物溶液流過吸附柱時，各種成分同時被吸附在柱的上端。當(dāng)洗脫劑流下時，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脫的速度也不同，于是形成了不同層次，即溶質(zhì)在柱中自上而下按對吸附劑的親和力大小分別形成若干色帶，再用溶劑洗脫時，已經(jīng)分開的溶質(zhì)可以從柱上分別洗出收集；或?qū)⒅?，擠出后按色帶分割開，再用溶劑將各色帶中的溶質(zhì)萃取出來。

常見層析柱硅膠填料柱氧化鋁填料柱聚酰胺填料柱離子交換柱凝膠色譜柱紙層析參考書目：1、韓廣甸

趙樹緯

李述文

等編譯《有機(jī)制備化學(xué)手冊》上卷2、曾昭瓊

主編《有機(jī)化學(xué)實驗》（第二版）3、黃濤

主編《有機(jī)化學(xué)實驗》（第一版）4、周科衍

呂俊民主編《有機(jī)化學(xué)實驗》（第二版）5、谷亨杰（主編）《有機(jī)化學(xué)實驗》為柱色譜選擇合適的淋洗劑如果某種溶劑對某一組分Rf值很大，而對另一組分Rf值較小，該溶劑就能使兩種組分在柱上獲得良好的分離效果?；蛘?，也可選擇兩種溶劑進(jìn)行分離。一種溶劑對某一組分Rf值很大，對另一組分Rf值很小，這樣，該溶劑可使前一組分很快從柱上洗脫，然后用另一種對兩種組分Rf值都很大的溶劑，洗脫剩下的組分。

一般來說，用兩種溶劑進(jìn)行淋洗，可節(jié)約溶劑和時間。本實驗用此法制備薄層板6片：吸附劑為硅膠G（4g），用0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液（8-10ml

）調(diào)成漿料。樣品溶劑改用乙醚。（原為二甲苯）實驗內(nèi)容：1、合成乙酰二茂鐵（以二茂鐵為原料,將干燥后的粗產(chǎn)物用石油醚（60—90℃）重結(jié)晶。）2、薄層色譜試驗（以純凈的二茂鐵為標(biāo)準(zhǔn)，檢驗產(chǎn)品中是否含有未反應(yīng)完的二茂鐵，同時為確定柱色譜的溶劑提供實驗基礎(chǔ)）3、柱色譜試驗（提純乙酰二茂鐵，樣品粗乙酰二茂鐵乙醚溶液，3：1石油醚/乙醚混合溶劑）4、產(chǎn)品表征：測熔點、紅外光譜實驗關(guān)鍵步驟：1、滴加磷酸時一定要在振搖下用滴管慢慢加入。2、燒瓶要干燥，反應(yīng)時應(yīng)用干燥管，避免空氣中的水進(jìn)入燒瓶內(nèi)。。3、用碳酸氫鈉中和