食品中微生物產(chǎn)物鑒定課件

第四十一講食品中微生物產(chǎn)物的鑒定1、阻抗測定法（impedance）阻抗：交流電路中導(dǎo)電物質(zhì)對電流所起的阻礙和抵抗作用，可由電導(dǎo)和電容計算。原理：微生物可使培養(yǎng)基中電惰性底物，如碳水化合物、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)代謝成為電活性產(chǎn)物（酸、堿等），當(dāng)微生物生長繁殖時，培養(yǎng)基中的電惰性分子即為許多電活性分子所取代，從而使培養(yǎng)基的電導(dǎo)性增大，培養(yǎng)基的阻抗降低。通過繪制培養(yǎng)基電阻抗隨時間變化的阻抗曲線圖，進(jìn)行微生物鑒定及微生物數(shù)量判斷。一、物理方法2、微量量熱法（Microcalorimetry）微量量熱法是基于自動、連續(xù)檢測熱效應(yīng)變化過程而建立的熱化學(xué)方法。原理：是利用量熱計測定微生物生長時的微小溫度變化來計算微生物的數(shù)量，并對微生物進(jìn)行鑒定。特點：靈敏、快速二、化學(xué)方法微生物在生長過程中能夠表現(xiàn)出一些特定的現(xiàn)象，產(chǎn)生一些特定的物質(zhì)，通過對它們的分析可以實現(xiàn)對微生物的快速檢測與分析1、測定熱穩(wěn)定性核酸酶（DNAse

）原理：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生特有的熱穩(wěn)定性核酸酶以及凝固酶，通過測定食物中的熱穩(wěn)定性核酸酶可以檢測食物金黃色葡萄球菌的數(shù)量。熱穩(wěn)定性核酸酶是S.aureus生長的標(biāo)志；凝固酵素是產(chǎn)腸毒素菌株的標(biāo)志研究表明：有0.34單位的熱穩(wěn)定性核酸酶存在時，表明有某種金黃色葡萄球菌生長，而此時相當(dāng)于金黃色葡萄球菌產(chǎn)生9.5×10－3ug腸毒素。熱穩(wěn)定性核酸酶檢測法可以作為指示金黃色葡萄球菌生長的方法。2、ATP的測定ATP測定計數(shù)法的原理：每個細(xì)菌細(xì)胞中的ATP含量恒定，含量為10-18-10-17mol，ATP在細(xì)胞死亡2h后消失。通過測定樣品中ATP的量就可以計算出微生物細(xì)胞數(shù)量。工作原理：ATP能與熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生特異性熒光，熒光強(qiáng)度與ATP含量成正比，所以通過分析熒光強(qiáng)度，計算樣品中微生物的ATP量，就可以推算出總活菌數(shù)。105cfu的細(xì)菌含有4×104mol/LATP。在106－109cfu/g范圍內(nèi)，微生物的ATP含量和細(xì)菌數(shù)呈線性關(guān)系。ATP法已經(jīng)用于雞肉、豬肉和牛肉的檢測。3、輻射測量法（Radiometric）原理：微生物在代謝過程中可以產(chǎn)生CO2，如果14C標(biāo)記培養(yǎng)基中的碳源，如若微生物利用，則會釋放14CO2，只需用放射能計數(shù)器檢測14CO2含量的有無及增加情況，便可確定樣品中微生物的存在及生長情況。不同微生物對各種物質(zhì)利用能力不同，放射性標(biāo)記的物質(zhì)也不同。常用的標(biāo)注物是14C-葡萄糖，對于一些特殊的微生物也可使用14C-甲酸鹽或14C-谷氨酸鹽。優(yōu)點：速度快：通常只需6︿18h。使用范圍：主要用于醫(yī)用微生物的檢測。例如，醫(yī)用上常采用13C尿素呼氣質(zhì)譜儀診斷體內(nèi)幽門螺旋桿的感染情況。亦可用于食品和水中微生物的檢測。三、食品微生物的指紋識別和鑒定

“指紋”概念：由于每種微生物的化學(xué)組分（DNA、蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)、性能有差別及其特異性代謝產(chǎn)物等通過分析技術(shù)出現(xiàn)的特征性的圖譜。1、血清學(xué)方法血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗中，常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測結(jié)果。血清學(xué)反應(yīng)的特點：抗原抗體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原存在時，會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。因此，可利用特殊的抗體鑒定同源抗原

2、噬菌體（phage）類型原理：根據(jù)噬菌體和它的宿主細(xì)菌之間的特殊關(guān)系，用已知的噬菌體鑒定其特定的宿主細(xì)菌。3、分子生物學(xué)方法

基因探針技術(shù)

DNA擴(kuò)增法限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)脈沖場凝膠電泳（1）基因探針技術(shù)探針（Probe）：經(jīng)過標(biāo)記的一段短核苷酸，用于檢測與之同源的核苷酸序列?？蓹z測的細(xì)胞數(shù)量：106-107

必須進(jìn)行細(xì)胞富集！細(xì)胞數(shù)量為108，檢測需要10-12h

（2）DNA擴(kuò)增法又稱多聚酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction，PCR1985年，美國PE-Cetus公司人類遺傳學(xué)研究室的KaryMullis發(fā)明

1993年，Mullis獲得諾貝爾化學(xué)獎PCR的基本原理PCR是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。在環(huán)境檢測中，靶核酸序列往往存在于—個復(fù)雜的混合物如細(xì)胞提取液中，且含量很低，對于探測這種復(fù)雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術(shù)可將靶序列放大幾個數(shù)量級，再用探針雜交探測對被擴(kuò)增序列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。Step1：雙鏈DNA熱變性（94℃）；Step2：引物與模板單鏈DNA退火（55℃）；Step3：DNA的聚合延伸反應(yīng)（72℃）；Step4：擴(kuò)增的雙鏈DNA再次熱變性（返回Step1）。（3）脈沖場凝膠電泳技術(shù)

是近年發(fā)展起來的一種重要的分離大分子量線性DNA分子的電泳技術(shù)。原理：對要分離的大分子量線性DNA分子采用交變脈沖電場瓊脂糖凝膠電泳技術(shù),脈沖電場方向、時間和電流大小交替改變,每當(dāng)電場方向發(fā)生改變時,大分子DNA便滯留在凝膠孔內(nèi),直至沿新的電場軸重新定向后,才能繼續(xù)向前泳動,DNA分子越大,重新定向需要的時間越長,當(dāng)DNA分子改變方向的時間小于脈沖時間時,DNA便分子量大小分開,經(jīng)EB（溴化乙錠）染色后在凝膠上出現(xiàn)按分子大小排列的電泳帶型。1、熒光抗體法（FA）1942年創(chuàng)立，在食品和醫(yī)學(xué)微生物中應(yīng)用廣泛。原理：抗體與熒光物質(zhì)結(jié)合而帶有熒光，與相應(yīng)抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可以觀察，也可計數(shù)。熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）若丹名B（RhodamineB）四、免疫學(xué)方法2、沙門氏菌1-2實驗（1-2Test）原理：抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的免疫帶在一個特殊的含兩個容器的塑料設(shè)備中進(jìn)行：一個容器中裝有選擇性液體培養(yǎng)基，另一個中裝有非選擇性運(yùn)動性培養(yǎng)基（半固體），并含有鞭毛抗體。恒溫培養(yǎng)時，運(yùn)動性沙門氏菌經(jīng)選擇性培養(yǎng)后進(jìn)入非選擇性培養(yǎng)基，并與其中的抗體結(jié)合形成免疫帶。一種快速檢測有動力的沙門氏菌的方法Inoculationchamber優(yōu)點：將血清學(xué)反應(yīng)和生化增菌過程結(jié)合起來，特異性強(qiáng)；不需特殊實驗室條件，簡便；

8-14小時內(nèi)得出結(jié)果，快速。缺點：不能檢測非運(yùn)動型沙門氏菌，免疫條帶的判斷有主觀因素。待將酶標(biāo)記的抗原或抗體結(jié)合在固相載體上，滴加樣品后，若樣品中含有酶反應(yīng)的底物，則底物會被酶催化生成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與樣品中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。原理：3、酶聯(lián)免疫吸附劑測定

ELISA可用于測定抗原或抗體。測定中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物（substrate）。固相載體固相載體作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。最常用的是聚苯乙烯，具較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，且價格低廉，故被普遍采用。載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最常用，稱為ELISA板，國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。4、鱟(后）試劑測定法

目前最靈敏的測定G-菌細(xì)胞壁中內(nèi)毒素的方法原理：內(nèi)毒素與鱟溶解物之間發(fā)生生化反應(yīng)，一小時后形成一種膠狀物。革蘭氏陰性菌可通過產(chǎn)生的內(nèi)毒素進(jìn)行鑒定，內(nèi)毒素是由菌體外膜裸露的脂多糖和被外膜包圍的類脂A構(gòu)成的。鱟變形細(xì)胞溶解物實驗采用來自馬蹄蟹血液的血細(xì)胞溶菌蛋白。溶菌蛋白是已知的對內(nèi)毒素最敏感的物質(zhì)。在少量的溶菌液中加入待測樣品，并在37℃培養(yǎng)1h。內(nèi)毒素的存