第十六章-基因診斷技術(shù)及其應(yīng)用課件

第十六章基因診斷技術(shù)及其應(yīng)用

基因診斷是利用DNA分子雜交等分子生物學(xué)技術(shù)，直接探查人體基因組DNA存在的缺陷或是基因表達(dá)產(chǎn)物的異常，從而對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷?；蛟\斷也稱DNA診斷或DNA探針技術(shù)或基因探針技術(shù)，是20世紀(jì)70年代末迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)應(yīng)用技術(shù)?？焖凫`敏、準(zhǔn)確可靠的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)是基因診斷的先決條件。1第一節(jié)基因診斷的策略第二節(jié)基因診斷的常用技術(shù)方法第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用

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第一節(jié)基因診斷的策略一、基因突變的檢測(cè)當(dāng)致病基因已和分子機(jī)制均確知時(shí)，直接檢測(cè)和分析突變是分子診斷最有力和最準(zhǔn)確的方法?；蛲蛔儥z測(cè)法可檢測(cè)基因大片段缺失和插入、小片段缺失和插入、點(diǎn)突變(只有一種類型的點(diǎn)突變，或像N-ras突變那樣，突變類型很多但只有一兩種占優(yōu)勢(shì)，或發(fā)生在限制酶識(shí)別位點(diǎn)上使酶切位點(diǎn)消失，或發(fā)生在隱蔽位點(diǎn)上使酶切位點(diǎn)增加、異?；蛑嘏藕彤惓；蛉诤系鹊臋z測(cè)。較大片段用Southern印跡法或PCR法。單個(gè)外顯子突變采用雙3引物PCR法，多個(gè)外顯子突變采用multiplexPCR進(jìn)行電泳條帶分析，單個(gè)突變點(diǎn)采用PCR-SSCP法。測(cè)mRNA用RT-PCR法。二、基因連鎖分析由于同一染色體上相鄰近的基因一起被遺傳而相互存在連鎖關(guān)系，在只知致病基因在染色體上的大概位置而不知確切位置的情況下，只要鑒定與致病基因相連鎖的有關(guān)基因的存在與否，就可以判斷受檢者是否帶有致病基因。常采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）遺傳標(biāo)志進(jìn)行多態(tài)性分析。4三、感染性疾病外源基因的檢測(cè)這類檢測(cè)一般根據(jù)已知病原生物基因組外源DNA或RNA順序，采用PCR或RT-PCR的方法就可以進(jìn)行快速、簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的診斷。因此，這類疾病的基因診斷應(yīng)用性極強(qiáng)，在嚴(yán)格掌握質(zhì)控的前提下，可在臨床廣泛運(yùn)用。四、基因異常表達(dá)的檢測(cè)用mRNA作標(biāo)本，采用RT-PCR法進(jìn)行半定量和定量分析判斷基因表達(dá)異常。5第二節(jié)基因診斷的常用技術(shù)方法一、核酸分子雜交技術(shù)㈠限制性內(nèi)切酶酶譜分析法(圖16-1)

6此方法是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來(lái)檢測(cè)是否存在基因變異。當(dāng)待測(cè)DNA序列中發(fā)生突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致某些限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的改變，其特異的限制性酶切片段的狀態(tài)(片段的大小或多少)在電泳遷移率上也會(huì)隨之改變，借此可作出分析診斷。㈡DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragnentlengthpolymor-phism,RFLP)分析在人類基因組中，平均約200對(duì)堿基可發(fā)生一對(duì)變異(稱為中性突變)，中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸序列的差異，稱為DNA多態(tài)性。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，酶解該DNA片段就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片段，稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。7㈢等位基因特異寡核苷酸探針(allelespecificoligonucleotide,ASO)雜交法根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合成兩種寡核苷酸探針，一種是相應(yīng)于突變基因堿基序列的寡核苷酸(M)，一種是相應(yīng)于正?；驂A基序列的寡核苷酸(N)，用它們分別與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交。8二、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(圖16-2)根據(jù)待測(cè)基因兩端的DNA順序設(shè)計(jì)出一對(duì)引物，經(jīng)PCR反應(yīng)將目的基因片段擴(kuò)增出來(lái)，即可進(jìn)一步分析判斷致病基因的存在與否，并了解其變異的形式。9三、基因測(cè)序分離出患者的有關(guān)基因，測(cè)定出其堿基排列順序，找出其變異所在，這是最為確切的基因診斷方法。10第四節(jié)基因診斷的應(yīng)用一、基因診斷在惡性腫瘤中的應(yīng)用㈠惡性腫瘤的特異性基因診斷在慢粒白血病中，具有t(9;22)染色體的易位及所產(chǎn)生的bcr-abl融合基因，因此可用檢測(cè)特殊融合基因的方法進(jìn)行某些白血病的診斷。在淋系白血病中存在大的Ig或TCR基因的V-(D)-J組合可作為B、T白血病的克隆標(biāo)志。應(yīng)用Southern雜交或PCR方法可檢測(cè)這些標(biāo)志。11㈡惡性腫瘤相關(guān)基因分析因此，通過(guò)對(duì)腫瘤相關(guān)基因的分析如癌基因，抑癌基因，凋亡和抗凋亡基因缺失，插入，擴(kuò)增突變，表達(dá)過(guò)量。同樣可對(duì)臨床起到鑒別診斷、判斷預(yù)后的作用，如對(duì)兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)上皮瘤所進(jìn)行的鑒別診斷。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤神經(jīng)上皮瘤N-myc-mRNA表達(dá)高極低C-myc-mRNA表達(dá)無(wú)高12㈢惡性腫瘤的分子病理學(xué)診斷原位雜交在腫瘤病理診斷中的應(yīng)用至少包括如下幾個(gè)方面：1.

腫瘤病毒的檢出：肝穿刺查乙肝病毒2.腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)改變的檢測(cè):FISH查標(biāo)記染色體3.

細(xì)胞內(nèi)基因結(jié)構(gòu)和量的改變的檢測(cè)：4.

基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)RT-PCR原位雜交5.腫瘤分化程度的確定：RT-PCR定量分析查轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù)6.

實(shí)體瘤中抗藥性腫瘤細(xì)胞的定位檢測(cè)多重耐藥基因（MDR1）基因擴(kuò)增與表達(dá)的檢測(cè)13提問(wèn)與解答環(huán)節(jié)QuestionsAndAnswers14謝謝聆聽·學(xué)習(xí)就是為了達(dá)到一定目的而努力去干,是為一個(gè)目標(biāo)去戰(zhàn)勝各種困難的過(guò)程,這個(gè)過(guò)程會(huì)充滿