浙科版選修1生物實(shí)驗(yàn)一：大腸桿菌的培養(yǎng)與分離課件

實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)與分離一、培養(yǎng)基的配置與滅菌取2個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。LB液體培養(yǎng)基——細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細(xì)菌的劃線分離封口膜：既通氣又不使菌進(jìn)入二、倒平板滅菌后的培養(yǎng)基在無(wú)菌操作臺(tái)上倒入4個(gè)培養(yǎng)皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動(dòng)，使培養(yǎng)基鋪滿(mǎn)平皿底部，待凝，使之形成平面注意事項(xiàng)：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板2.滅菌及消毒：無(wú)菌操作臺(tái)用超凈紫外燈和過(guò)濾風(fēng)滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作時(shí)右手無(wú)名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開(kāi)上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.三、大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床培養(yǎng)12小時(shí)。注意事項(xiàng):1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度實(shí)驗(yàn)完成后,接種過(guò)細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理?在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。例2．下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是（）操作時(shí)右手無(wú)名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開(kāi)上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作.需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰，灼燒滅菌一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；分離后,一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一四、大腸桿菌的劃線分離分離方法:劃線分離法和涂布分離法1、劃線分離法無(wú)菌操作臺(tái)上用接種環(huán)取菌后在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線.不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。問(wèn)題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。2、涂布分離法:是指將培養(yǎng)的菌液稀釋一定的倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.劃線分離法和涂布分離法哪個(gè)更好呢？劃線分離：方法簡(jiǎn)單，但單菌落較難分開(kāi)。涂布分離：?jiǎn)尉涓追珠_(kāi)，但操作復(fù)雜。分離后,一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一五、大腸桿菌分離后保存1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。2、長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?(1)膽大心細(xì)，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長(zhǎng)條件，如PH、滲透壓、溫度等。細(xì)菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度小結(jié)2.在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?（1）菌落的形態(tài)看，是否濕潤(rùn)，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（3）上述方法較難區(qū)別同類(lèi)的不同物種，需借助化學(xué)和進(jìn)一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。3.進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)為什么要將培養(yǎng)皿倒置?恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會(huì)落入培養(yǎng)基表面并擴(kuò)散開(kāi)。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會(huì)導(dǎo)致菌隨水?dāng)U散，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離目的。例1．關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（）五、大腸桿菌分離后保存為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。桌面及人手用酒精棉球消毒為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。滅菌及消毒：無(wú)菌操作臺(tái)用超凈紫外燈和過(guò)濾風(fēng)滅菌；答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；分離后,一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一劃線分離法和涂布分離法哪個(gè)更好呢？（3）注意微生物生長(zhǎng)條件，如PH、滲透壓、溫度等。4.實(shí)驗(yàn)完成后,接種過(guò)細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理?所有接觸過(guò)菌的器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（特別是培養(yǎng)基）；使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄（3）上述方法較難區(qū)別同類(lèi)的不同物種，需借助化學(xué)和進(jìn)一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。（4）表中營(yíng)養(yǎng)成分共有類(lèi)。桌面及人手用酒精棉球消毒在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。一、培養(yǎng)基的配置與滅菌三、大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)五、大腸桿菌分離后保存答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?5.如果分離的是轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌,如何保證不被普通的大腸桿菌所污染?轉(zhuǎn)基因用的質(zhì)粒不是細(xì)菌中原有的，而是經(jīng)過(guò)改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基對(duì)菌體進(jìn)行培養(yǎng)?！菊n堂練習(xí)】例1．關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（）

A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外的無(wú)機(jī)物只提供無(wú)機(jī)鹽

D.無(wú)機(jī)氮源也能提供能量D例2．下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是（）A.防止雜菌污染B.接種前菌種要進(jìn)行滅菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前B編號(hào)成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請(qǐng)據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類(lèi)型是

。（2）若不慎將過(guò)量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基，可再加入

.自養(yǎng)型微生物

含碳有機(jī)物

（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)

。（4）表中營(yíng)養(yǎng)成分共有