液相色譜儀基礎(chǔ)知識(shí)-課件

液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)內(nèi)容提要一、色譜基礎(chǔ)知識(shí)二、液相色譜概述三、液相色譜基本構(gòu)造四、液相色譜基本工作原理五、液相色譜的用途及應(yīng)用領(lǐng)域一、色譜基礎(chǔ)知識(shí)

色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。

一、色譜基礎(chǔ)知識(shí)色譜法是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解,分配,吸附等化學(xué)作用性能的差異,當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離。兩相中有一相是固定的,叫作固定相,有一相是流動(dòng)的,稱為流動(dòng)相流動(dòng)相又叫洗脫劑，溶劑。一、色譜基礎(chǔ)知識(shí)色譜法：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。流動(dòng)相：攜帶樣品流過整個(gè)系統(tǒng)的流體。固定相：靜止不動(dòng)的一相，色譜柱。

色譜是一種分離技術(shù)。色譜的主要目的是對(duì)混合物中的目標(biāo)物分離和定量。一、色譜基礎(chǔ)知識(shí)按流動(dòng)相的物態(tài)分:

氣相色譜(GasChromatography,GC)

用氣體作為流動(dòng)相(又叫載氣)

液相色譜(LiquidChromatography,LC)

用液體作為流動(dòng)相(又叫洗脫劑)二、液相色譜概述

液相色譜：以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法。適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析。流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用。氣相色譜：以氣體作為流動(dòng)相的色譜分離方法。適用于沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子化合物的分析。流動(dòng)相只起運(yùn)載樣品分子的能力。二、液相色譜概述高效液相色譜-HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)-是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段:高性能色譜柱,高精度輸液泵,高靈敏度檢測(cè)器…-廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域:醫(yī)藥,環(huán)保,石化,生命科學(xué),食品工業(yè),農(nóng)業(yè)…-無論在技術(shù)上,理論上,還是在應(yīng)用上仍有較大的發(fā)展空間二、液相色譜概述超高效液相色譜–UPLC(UltraPerformanceLiquidChromatography)–是區(qū)別于HPLC的液相色譜新領(lǐng)域–基于小顆粒填料和LC原理的一種創(chuàng)新技術(shù)–實(shí)現(xiàn)超高分離度、靈敏度、分析速度三、液相色譜基本構(gòu)造主要組成部分如下：進(jìn)樣系統(tǒng)輸液系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)三、液相色譜基本構(gòu)造1.進(jìn)樣系統(tǒng)：

自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)（是否帶溫控）手動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)核心部件：六通閥

三、液相色譜基本構(gòu)造六通閥原理示意圖

取樣時(shí)，流動(dòng)相直接進(jìn)柱，進(jìn)樣口與定量管連接，樣品充滿定量管后，多余樣品從6流出。進(jìn)樣時(shí)，泵將流動(dòng)相壓入定量管，將樣品全部進(jìn)入色譜柱分析。三、液相色譜基本構(gòu)造進(jìn)樣前，進(jìn)樣，進(jìn)樣后3個(gè)過程示意圖三、液相色譜基本構(gòu)造三、液相色譜基本構(gòu)造2.輸液系統(tǒng)流路—單泵、雙泵、三元泵、四元泵、多泵壓力—低壓、中壓、高壓、超高壓控制方式—恒流、恒壓流動(dòng)相—等度、梯度混合方式—低壓、高壓流量—分析泵、半制備泵、制備泵材質(zhì)—金屬泵、非金屬泵（peek)三、液相色譜基本構(gòu)造

泵系統(tǒng)為輸液系統(tǒng)中最為核心部分，也是整個(gè)液相色譜系統(tǒng)中最為核心的部分。關(guān)于泵系統(tǒng)中等度、梯度、高壓、低壓、二元、四元將做主要介紹。三、液相色譜基本構(gòu)造等度分析：針對(duì)單一樣品、或者簡(jiǎn)單樣品采用等度分析。示意圖如下三、液相色譜基本構(gòu)造梯度分析：對(duì)于復(fù)雜樣品，一般采用梯度分析，且必須是二元以上的泵系統(tǒng)。示意圖如下：三、液相色譜基本構(gòu)造高壓梯度：用兩臺(tái)高壓輸液泵將兩種溶劑輸入。低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓輸液泵將流動(dòng)相輸入到色譜柱中。（混合前高壓與混合后高壓）三、液相色譜基本構(gòu)造二元梯度---需2個(gè)泵-----高壓梯度四元梯度----需比例閥一個(gè)泵--低壓梯度三、液相色譜基本構(gòu)造3.分離系統(tǒng)3.1色譜柱色譜柱是HPLC分離系統(tǒng)的關(guān)鍵！色譜柱分類：可根據(jù)柱管、類型、規(guī)格大小、填料、分離類型進(jìn)行分類。色譜柱標(biāo)簽的識(shí)別：三、液相色譜基本構(gòu)造3.2柱溫箱柱溫箱的作用：

控溫系統(tǒng)大多數(shù)并不是HPLC的必須備件，凝膠系統(tǒng)一般是要求控溫的，采用示差檢測(cè)最好配置控溫箱，離子色譜也同樣。有些儀器除了加熱的控溫系統(tǒng)外，還自帶低溫冰箱。

液相色譜常規(guī)分析的柱溫在20-60度。不同溫度對(duì)樣品的保留時(shí)間有很大的影響。柱溫箱的優(yōu)點(diǎn)：分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測(cè)穩(wěn)定性三、液相色譜基本構(gòu)造4.檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度分級(jí)ppm級(jí)perpartsofmillionppb級(jí)perpartsofbillionppt級(jí)perpartsoftrillion如：濃度及濃度換算單位1ppm=1000ppb;1ppb=1000ppt1ppm即：mg/L1ppb即：ug/L1ppt即：ng/L三、液相色譜基本構(gòu)造

1、紫外-可見光檢測(cè)器（UV）2、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）用光電二極管取代了是傳統(tǒng)的光電倍增管，在一次色譜操作中可同時(shí)獲得多波長(zhǎng)的吸光度，并且可以采用現(xiàn)代微機(jī)技術(shù)將各組份的保留時(shí)間、吸收波長(zhǎng)和吸光度匯合一起，繪制三維譜圖，提供既定量又定性的色譜信息。

三、液相色譜基本構(gòu)造3、熒光檢測(cè)器（FLD）高靈敏度：10-12～10-13g/mL;高選擇性：對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)對(duì)溫度和流動(dòng)相的流速變化不敏感所需試樣少，適合恒量分析三、液相色譜基本構(gòu)造4、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）霧化蒸發(fā)散射光源光電倍增管流動(dòng)相載氣D0D蒸發(fā)光散射檢測(cè)原理是利用樣品組分霧化和蒸發(fā)形成固體微粒后對(duì)光的散射現(xiàn)象來檢測(cè)色譜流出組分的方法（可檢測(cè)任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品。碳水化合物，類脂化合物，表面活性劑，聚合物，藥物，氨基酸和天然產(chǎn)物。）三、液相色譜基本構(gòu)造ELSD的原理:霧化檢測(cè)溶劑的蒸發(fā)

檢測(cè)器的響應(yīng)值僅與光束中溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量有關(guān)。而與溶質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)無關(guān)。三、液相色譜基本構(gòu)造5、其他檢測(cè)器Refractiveindexdetectors（RI，示差檢測(cè)器）Massspectrometricdetectors（Ms，質(zhì)譜檢測(cè)器）CADdetectors（CAD，電噴霧檢測(cè)器）Electrochemicaldetecrors（ECD，電化學(xué)檢測(cè)器）

…………三、液相色譜基本構(gòu)造四、液相色譜工作原理五、液相色譜用途及應(yīng)用領(lǐng)域制藥：從藥物研制到開發(fā)、制造和QA/QC，為藥物制造提供支持。石油化工：液相色譜應(yīng)用包括添加劑化驗(yàn)、精細(xì)和專用化學(xué)分析以及使

用帶有有機(jī)溶劑或水性溶劑的大小排查色譜檢定聚合物。蛋白質(zhì)：識(shí)別、隔離和凈化細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)。環(huán)境：分析包