細胞培養(yǎng)教學

細胞培養(yǎng)教學第一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一本章學習項目內(nèi)容利用生物反應(yīng)器進行細胞因子的大規(guī)模生產(chǎn)——尿激酶原，EPO利用原代和傳代細胞生產(chǎn)狂犬疫苗利用CHO細胞生產(chǎn)乙肝疫苗利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆細胞株利用單克隆細胞株生產(chǎn)生物制品細胞培養(yǎng)在組織工程中的應(yīng)用第二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一項目教學生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲細胞制備尿激酶原THEPREPARATIONOFPRO-UKININSECT

CELLCULTRUREINBIOREACTORS第三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一使用美國N.B.S公司的籃式生物反應(yīng)器和Disk聚酯纖維片狀載體，對Sf9昆蟲細胞大規(guī)模高密度貼壁培養(yǎng)工藝以及昆蟲細胞-桿狀病毒AcMNPV表達尿激酶原(pro-UK)工藝進行初步研究

摘要第四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一摘要昆蟲細胞的貼壁適應(yīng)含小牛血清的TNM-FH培養(yǎng)液對片狀載體進行預(yù)處理降低攪拌速度、提高接種密度、采用罐流培養(yǎng)以及禁止CO2氣體的使用，使昆蟲細胞的培養(yǎng)密度能夠達到5.0×106/ml以上。第五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一在Sf9細胞培養(yǎng)了3天至5天達到較高密度時，接種一定量的AcMNPV，感染指數(shù)一般為4左右，并在病毒感染后，采用罐流收獲的方式，根據(jù)pro-UK的表達量，及時調(diào)整罐流速度，使收液保持在600～1200IU/ml相對較高的酶活性。摘要第六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一通過生物反應(yīng)器的收液與玻璃瓶的培養(yǎng)收液的電泳圖譜比較，反應(yīng)出生物反應(yīng)器收液的pro-UK表達量明顯高于瓶中培養(yǎng)收液，纖維蛋白瓊脂糖平板的測活也充分地證明了這一點。摘要第七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一關(guān)鍵詞：生物反應(yīng)器，昆蟲細胞，桿狀病毒，尿激酶原Keywords:bioreactor,insectcells,baculovirus,pro-UK第八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第一部分引言

1.1尿激酶原概述1.2昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)及其應(yīng)用1.3生物反應(yīng)器細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用1.4本研究的設(shè)計思路、意義和目的第九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一實驗材料與方法……………………...41.材料與儀器………………………...41.1材料…………….41.2主要儀器設(shè)備…………………...41.3主要試劑………………………...42.實驗方法………….62.1載體的處理……………………..62.2生物反應(yīng)器培養(yǎng)前的準備…………………….62.3生物反應(yīng)器昆蟲細胞培養(yǎng)時各種參數(shù)的調(diào)節(jié)……………….72.4細胞培養(yǎng)方法…………………..72.5病毒感染及收獲…………………82.6檢測方法……………

第十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一實驗設(shè)計、結(jié)果和分析………………131.感染前各因素的改變對昆蟲細胞培養(yǎng)影響實驗…………

….131.1載體的處理處理方法對昆蟲細胞貼壁影響的實驗…………131.2攪拌速度對昆蟲細胞貼壁于載體影響的實驗………………141.3昆蟲細胞批式培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)的比較實驗…………………141.4接種濃度對細胞生長的影響實驗……………151.5CO2對細胞生長影響的研究……………………161.6培養(yǎng)過程中細胞濃度與葡萄糖代謝的關(guān)系第十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一實驗設(shè)計、結(jié)果和分析………………131.感染前各因素的改變對昆蟲細胞培養(yǎng)影響實驗……………….131.1載體的處理處理方法對昆蟲細胞貼壁影響的實驗…………131.2攪拌速度對昆蟲細胞貼壁于載體影響的實驗………………141.3昆蟲細胞批式培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)的比較實驗…………………141.4接種濃度對細胞生長的影響實驗……………151.5CO2對細胞生長影響的研究……………………161.6培養(yǎng)過程中細胞濃度與葡萄糖代謝的關(guān)系第十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第二部分生物反應(yīng)器昆蟲細胞的培養(yǎng)2.2實驗儀器與材料2.2.1實驗儀器：籃式生物反應(yīng)器：2.5L和5L的，其中2.5L反應(yīng)器內(nèi)裝0.8L籃筐，能容納80g載體，工作容積1.6L；5L反應(yīng)器內(nèi)裝1.7L籃筐，能容納160g載體，工作容積3.5L，美國NBS生產(chǎn)，見圖1第十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一圖1.生物反應(yīng)器及灌流培養(yǎng)示意

圖2.片狀載體照片

Fig1.PictureofbioreactorcultureFig2.Pictureofdiskcarrier

第十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一超凈工作臺：蚌埠凈化設(shè)備廠生產(chǎn)。二氧化碳培養(yǎng)箱：美國熱電公司生產(chǎn)。倒置顯微鏡：型號CKX41，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)。分光光度計：型號UV-2201,日本島津公司生產(chǎn)。2.2.2實驗用載體：Disk片狀載體（見圖2）：主要由聚酯纖維構(gòu)成，圓片狀，直徑為5.5mm，表面固著一層聚丙烯網(wǎng)，美國N.B.S公司提供。2.2.3實驗試劑：2.2.3.1細胞培養(yǎng)基：Grace’s培養(yǎng)基、酵母粉、乳白蛋白，均為GIBCO產(chǎn)品。2.2.3.2新生牛血清：購自杭州四季青生物材料有限公司。2.2.3.3葡萄糖檢測試劑盒：購自南京建成生物工程研究所。第十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.2.3.4.1無鈣、鎂的磷酸鹽緩沖液（PBS）：

Na2HPO412H2O25.98gNaH2PO42H2O4.36gNaCl8.78g將上述鹽類依次溶于900ml蒸餾水中，定容至1000ml。2.2.3.4.2TNM-FH培養(yǎng)液：Grace’s培養(yǎng)基粉460g酵母粉33g乳白蛋白33gNaHCO33.5g第十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一將上述粉末依次溶于9500ml蒸餾水中，平衡2小時，用5N的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至6.1，并定容至10000ml，除菌過濾后，2～8℃保存?zhèn)溆谩?.2.3.4.3細胞生長液：含有8%～10%小牛血清的TNM-FH培養(yǎng)液。2.2.3.4.4細胞維持液：含有1%～3%小牛血清的TNM-FH培養(yǎng)液。2.2.4實驗用的細胞株：Sf9細胞株：一種昆蟲細胞，從草地夜蛾IPLB-Sf21-AE細胞克隆分離出來的第9號細胞株（Spodopterafrugiperda9，Sf9），購于ATCC。第十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3實驗操作2.3.1載體的處理[9]新載體直接用于培養(yǎng)細胞，而用過的載體再用時，先用清水洗滌3次，然后用0.1N醋酸浸泡4～6小時，再用清水洗滌3～5次，烘干滅菌后備用。2.3.2生物反應(yīng)器培養(yǎng)前的準備2.3.2.1罐體處理用清水洗滌幾次后用0.1N的NaOH溶液浸泡4～6小時，再用清水洗滌2次后用0.1N醋酸浸泡過夜，倒出酸液，用清水洗滌后備用。第十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3.2.1空罐滅菌將載體裝入罐內(nèi)的籃筐中，加量為170-190克/5L反應(yīng)器，蓋好罐蓋，用紙包好所有罐蓋上的開口以及管道的開口，放到高壓滅菌柜中滅菌（121℃，45分鐘）。2.3.2.2實罐滅菌將新配好的PBS加入到滅好菌的罐體中，加量為2/3罐體容積，安裝上溶氧電極以及校對好的pH電極，關(guān)閉與罐內(nèi)液體接觸的管道，放到高壓滅菌柜中滅菌（121℃，45分鐘）。第十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3.3電極和蠕動泵的校準2.3.3.1pH電極的校對檢查pH電極沒有損傷后，用電纜與生物反應(yīng)器的主機連接，將顯示屏打倒pH的窗口，用pH為4.003的標準液校對“0”點；即在屏幕上不管顯示是不是4.003，只要穩(wěn)定了，即可在設(shè)定欄處設(shè)定為4.00。同樣方法，用pH為6.86的標準液校對“span”點。第二十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3.3.2溶氧電極的校對實罐滅菌后校對溶氧電極，即將主機打開，顯示屏打到溶氧窗口，斷開電極與主機，此時窗口顯示的值設(shè)定為“0”點；用電纜連接電極與主機，開動反應(yīng)器攪拌，使之達最大轉(zhuǎn)速，通空氣的情況下攪拌10～20分鐘，顯示屏上的數(shù)值基本穩(wěn)定不再上升，將此值設(shè)定為“100”點。第二十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3.3.2蠕動泵流量校正蠕動泵的液體流速與硅膠管道的直徑大小有關(guān)。校正蠕動泵流量時把硅膠管道連接在蠕動泵上，啟動校正程序，一定時間后終止校正程序，并輸入量筒中流入的蒸餾水的體積數(shù)，控制器自動計算蠕動泵的流速并儲存結(jié)果，校正完成。第二十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3.4生物反應(yīng)器昆蟲細胞培養(yǎng)時各種參數(shù)的調(diào)節(jié)2.3.4.1攪拌速度培養(yǎng)初期使用35～45rpm，培養(yǎng)后視培養(yǎng)液的溶氧值（DO值）情況適當調(diào)節(jié)攪拌速度，最大轉(zhuǎn)速可達80rpm。2.3.4.2溫度細胞增殖培養(yǎng)時控制溫度設(shè)定為26.5℃～27.5℃，維持培養(yǎng)時，溫度調(diào)節(jié)為25.5℃～26.5℃。第二十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3.4.3pH值細胞增殖培養(yǎng)時控制pH設(shè)定為6.0～6.2，維持培養(yǎng)時，控制pH設(shè)定為6.2～6.4。2.3.4.4DO值培養(yǎng)初期,使用壓縮空氣維持DO值，并將DO設(shè)定為30%～50%；培養(yǎng)中后期，一般在4～5天，當細胞迅速生長時，使用氧氣和氮氣調(diào)節(jié)溶氧值，并將DO設(shè)定為60%～80%。2.3.4.5灌流量每天取樣測定反應(yīng)器內(nèi)的細胞密度、葡萄糖濃度，以之為參考調(diào)整液體的灌流量。第二十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3.5細胞培養(yǎng)方法2.3.5.1細胞復(fù)蘇(1)從液氮罐中取出細胞凍存管，迅速放入盛有37℃水中，輕輕搖動凍存管，盡快解凍；(2)解凍后，用75%酒精擦試消毒凍存管，在超凈工作臺上開蓋，用吸管吸出細胞懸液輕輕加入已裝有5ml生長液的25cm2一次性細胞培養(yǎng)瓶中（生長液事先4℃預(yù)冷），室溫放置30分鐘后，置27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(3)27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3小時后，細胞基本貼于瓶下面，輕輕吸出上清液，加入8ml的新鮮生長液，再置27℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第二十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3.5.2細胞傳代取生長良好的Sf9細胞，輕輕吸出大部分上清液，補加適當?shù)纳L液，輕輕吹散貼在瓶壁上的細胞制成均勻細胞懸液，按1：2或1：3移入滅菌的細胞瓶，每瓶補加適量生長液，置27℃恒溫培養(yǎng)。第二十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3.5.3細胞接種于反應(yīng)器及培養(yǎng)一般6～7個生長良好搖瓶中的Sf9細胞（100～120ml的細胞懸液/瓶），收集到滅菌后的接種瓶中，并將收集瓶與反應(yīng)器用滅菌的管道進行連接，用蠕動泵緩地將細胞懸液泵入反應(yīng)器中，一般細胞接種密度為1.0×105～5.0×105/ml。設(shè)定培養(yǎng)條件，即轉(zhuǎn)速：35～80rpm，溫度：27℃，pH：6.2，DO：50%，進行生物反應(yīng)器的細胞培養(yǎng)，一般培養(yǎng)12小時后開始灌流培養(yǎng)。第二十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.3.6細胞取樣通過反應(yīng)器上的取樣器抽取載體，消化上面的細胞并計數(shù)，計算每片載體上的細胞，再核算出反應(yīng)器中的細胞濃度；取培養(yǎng)液，用試劑盒測定培養(yǎng)液的葡萄糖含量。第二十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.4結(jié)果與討論

2.4.1載體的處理方法對昆蟲細胞貼壁的影響A為載體未用培養(yǎng)基浸泡；B為載體用培養(yǎng)基浸泡24小時；C為載體用含10%牛血清的培養(yǎng)基浸泡

接種的細胞濃度均在1.40～1.55×105/ml，并分別在接種后的第1、第2、第3、第4、第5、第6小時取反應(yīng)器中的培養(yǎng)液第二十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第三十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一

從表1的結(jié)果可以看出：載體經(jīng)含血清的培養(yǎng)基浸泡后，載體對細胞的吸附力增強，含10%血清的培養(yǎng)基浸泡了2到24小時，細胞的貼壁率效果基本相同，說明載體經(jīng)10%血清的培養(yǎng)基浸泡了2小時后接種細胞，細胞在5小時后，5%細胞已貼壁于載體。第三十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.4.2攪拌速度對昆蟲細胞貼壁于載體的影響A組：30rpmB組：50rpmC組：100rpmD組：150rpm利用2.5L籃式生物反應(yīng)器，將細胞的接種濃度控制在1.40～1.50×105/ml，并分別在4次的接種細胞后，設(shè)定攪拌速度為30rpm、50rpm、100rpm、150rpm，分別在接種后的30、60、120、180、240以及300分鐘的時候取培養(yǎng)液，計數(shù)此時的細胞濃度。第三十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第三十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一從表2不難看出，昆蟲細胞在生物反應(yīng)器的初期，攪拌速度對細胞的貼壁有一定的影響，攪拌速度越大，越不利于細胞貼壁于載體。當攪拌速度達到150rpm時，接種后300分鐘，細胞幾乎沒有貼壁于載體。第三十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.4.3昆蟲細胞批式培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)的比較細胞的批次培養(yǎng)是指細胞接種后，收獲之前，培養(yǎng)液不進行換液，最后一次性收獲系統(tǒng)制備的產(chǎn)物罐流培養(yǎng)是指在細胞培養(yǎng)過程中，不斷地更換培養(yǎng)液，使培養(yǎng)環(huán)境處于一個動態(tài)的健康的培養(yǎng)狀態(tài)。為了比較和驗證兩種培養(yǎng)方式對昆蟲細胞生長的不同影響，特此進行以下試驗

第三十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一兩次的細胞接種濃度均為1.0×105cells/ml。批次培養(yǎng)5天不更換培養(yǎng)液；灌流培養(yǎng)是在接種后12小時開始灌流，灌流速度為0.2V/day，48小時后改變灌流速度為0.5V/day，一直到120小時（5天）。每天取載體進行消化計數(shù)細胞，算出此時的細胞濃度，從而比較相同的培養(yǎng)時間不同的培養(yǎng)方式的昆蟲細胞生長狀況，見圖3

批次培養(yǎng)方式和灌流培養(yǎng)方式第三十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第三十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一批次培養(yǎng)過程中的第4天，細胞密度緩慢地達到最大值1.54×106/ml。灌流培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分不斷地更新，細胞很快進入了對數(shù)生長期。在培養(yǎng)的第4天，細胞密度達到最大值5.06×106/ml，是批次培養(yǎng)細胞密度最高值的3.3倍。此時灌流速度為0.5V/day，如果灌流培養(yǎng)的第4天繼續(xù)增大灌流速度，細胞密度有可能還會繼續(xù)提高。第三十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.4.4接種濃度對細胞生長的影響本實驗利用灌流培養(yǎng)，分別采用接種濃度為0.5×105cells/ml、1.0×105cells/ml、5.0×105cells/ml，3次培養(yǎng)均在接種后12小時開始灌流培養(yǎng)，灌流速度為0.2V/day，48小時后改變灌流速度為0.5V/day，一直到120小時（5天）并且每天取載體進行消化計數(shù)細胞，算出此時的細胞濃度，比較不同的細胞接種密度，在培養(yǎng)過程中的相同培養(yǎng)時間點上昆蟲細胞生長的狀況，見圖4。第三十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第四十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一在圖4中，可以很清楚地看出，細胞接種量越低，細胞生長的延遲期越長，細胞很長時間才能達到密度最高；細胞接種越大，細胞就會在短時間內(nèi)達到最高密度，但由于培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液營養(yǎng)成分的限制，細胞達到最大密度后，細胞密度會很快降低；根據(jù)培養(yǎng)情況，及時加大灌流培速度，使營養(yǎng)成分的更新速度加快，從而使細胞密度會大大地增大。第四十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.4.5CO2對細胞生長的影響動物細胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)時，一般均采用空氣、氧氣、氮氣和CO2等四種氣體為培養(yǎng)系統(tǒng)維持罐內(nèi)壓和供氧，甚至協(xié)同地起到調(diào)節(jié)培養(yǎng)酸堿度的作用第四十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一利用兩次籃式生物反應(yīng)器的批次培養(yǎng)，一次批次培養(yǎng)的接種濃度為1.0×105cells/ml；采用3種氣體（空氣、氧氣和氮氣）來維持培養(yǎng)過程中罐內(nèi)的壓力和供氧；另一次批次培養(yǎng)的接種濃度為1.2×105cells/ml，采用4種氣體（空氣、氧氣、氮氣和二氧化碳）來維持培養(yǎng)過程罐內(nèi)的壓力和供氧第四十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第四十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一沒有使用CO2氣體的批次培養(yǎng)中細胞密度則可以達到1.54×106/ml，而使用了CO2氣體的批次培養(yǎng)過程中，自接種到第5天。細胞密度基本沒變，甚至有下降的趨勢。說明CO2氣體對昆蟲細胞具有一定的毒性，不利于昆蟲細胞的生長第四十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一2.4.6培養(yǎng)過程中細胞濃度與葡萄糖代謝的關(guān)系本實驗分別采用批次培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)的方式培養(yǎng)昆蟲細胞，并連續(xù)取樣監(jiān)測和觀察5天。其中批次培養(yǎng)5天一直不更換培養(yǎng)液；灌流培養(yǎng)則從接種后12小時開始灌流，灌流速度為0.2V/day，48小時后改變灌流速度為0.5V/day，一直到120小時。每天取樣測定細胞濃度和葡萄糖濃度，并繪制成曲線圖，見圖6、圖7。第四十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第四十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第四十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第四十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一從上面兩圖中，可以發(fā)現(xiàn)細胞在對數(shù)生長期的時候，培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度急劇下降。而在圖6中的細胞對數(shù)生長率（曲線的陡度）遠不如圖7中的細胞對數(shù)生長率，但葡萄糖濃度的下降程度卻遠大于圖7中的下降程度從兩圖的曲線中可以看出，灌流培養(yǎng)的細胞最大濃度遠遠高于批次培養(yǎng)的細胞最大濃度。在灌流培養(yǎng)過程的后期，葡萄糖也能維持較高的濃度，一般在100～200ug/ml。所以灌流培養(yǎng)有助于昆蟲細胞的高密度培養(yǎng)。結(jié)果分析討論第五十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第三部分昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)對尿激酶原的表達3.4結(jié)果與討論3.4.1接毒時間對pro-UK表達的影響A：細胞培養(yǎng)了3天感染病毒B：細胞培養(yǎng)了4天感染病毒C：細胞培養(yǎng)了5天感染病毒第五十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一結(jié)果分析討論這三種培養(yǎng)，均在細胞培養(yǎng)階段，細胞的接種濃度均為1.0×105cells/ml，均采用相同方式的灌流培養(yǎng)，培養(yǎng)條件保持一致。病毒的接毒時的感染指數(shù)（MOI）均為4，感染后分別每天取樣進行pro-UK生物活性的測定，將測定的結(jié)果用EXCEL文件繪制成曲線圖，從而觀察接毒時間對系統(tǒng)pro-UK表達的影響。第五十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第五十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一實驗結(jié)果（見圖8）可以看出，在昆蟲細胞接種后的3天到5天期間接種AcMNPV病毒，其對感染后的表達pro-UK基本沒有影響，僅僅是A，也就是3天接毒的，到表達最高峰下降的較快。在灌流培養(yǎng)過程，細胞在3天到5天期間已經(jīng)達到了細胞對數(shù)生長期的后期，為細胞密度最大值的前后，細胞密度不會相差很大

第五十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一3.4.3批次收獲與灌流收獲過程中pro-UK表達的比較實驗設(shè)計是根據(jù)收液方式的不同將實驗分成兩組：批次收獲組和灌流收獲組。兩組的均在細胞培養(yǎng)了96小時，接種AcMNPV病毒，且MOI均為4。批次收液方式為5天為一次換液單位，灌流收液方式為感染后24小時開始進行灌流收液，收液速度為0.5V/day。兩組收液的過程中每天從反應(yīng)器中取樣進行pro-UK生物活性的測定，將測定的結(jié)果用EXCEL文件繪制成曲線圖，從而反應(yīng)出系統(tǒng)的pro-UK表達情況。第五十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第五十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一

本實驗結(jié)果如圖10。批次收獲方式由于培養(yǎng)液在一定的時間內(nèi)不更換，細胞得不到充足的營養(yǎng)，系統(tǒng)的表達水平明顯較低，最高的表達時間為感染后的第4天，pro-UK的生物活性為631IU/ml。而灌流收獲方式，由于細胞是在一個動態(tài)平衡的培養(yǎng)系統(tǒng)中，營養(yǎng)豐富，有害物質(zhì)及時被排走，所以系統(tǒng)的表達水平相對較高，最高的表達活性出現(xiàn)在感染后的第5天，活性為1021IU/ml，并在很長時間內(nèi)維持在600IU/ml以上（見圖11）。因此灌流收獲方式有利于系統(tǒng)pro-UK的表達。第五十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一第五十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期一3.4.4灌流收獲過程中細胞密度、灌流量與pro-UK表達的關(guān)系利用籃式生物反應(yīng)器進行灌流培養(yǎng)昆蟲細胞，當細胞密度到一定密度后（一般超過5.0×106cells/ml）