第章氨基酸與蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)種類與功能的多樣性1010-1012結(jié)構(gòu)蛋白貯藏蛋白收縮蛋白轉(zhuǎn)運蛋白當(dāng)前第1頁\共有65頁\編于星期六\9點第一節(jié)氨基酸180多種天然AA，大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組成的。這些AA被稱為非蛋白質(zhì)AA。參與蛋白質(zhì)組成的AA為蛋白質(zhì)AA，常見的只有20種

基本氨基酸，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸表達(dá)方式：三字母或單字母的簡寫符號當(dāng)前第2頁\共有65頁\編于星期六\9點（一）-氨基酸的結(jié)構(gòu)通式除脯氨酸外，其他19種均具有如下結(jié)構(gòu)通式。各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈R基的不同。-氨基酸可變部分不變部分一、基本氨基酸當(dāng)前第3頁\共有65頁\編于星期六\9點(二)常見的標(biāo)準(zhǔn)AA－20種1,按側(cè)鏈R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分為三類脂肪族氨基酸—15種C2:1C3:3C4:3C5:4C6:4芳香族氨基酸－3種雜環(huán)族氨基酸－2種當(dāng)前第4頁\共有65頁\編于星期六\9點脂肪族氨基酸當(dāng)前第5頁\共有65頁\編于星期六\9點芳香族氨基酸－3種當(dāng)前第6頁\共有65頁\編于星期六\9點雜環(huán)族氨基酸當(dāng)前第7頁\共有65頁\編于星期六\9點GlyAlaValLeuIlePheTyrTrpCysMetSS氨基酸的R基大小當(dāng)前第8頁\共有65頁\編于星期六\9點2，根據(jù)酸堿性分類:

酸性氨基酸:2個–COOH、1個-NH2

Asp，Glu

堿性氨基酸:1個–COOH、2個堿性基團(tuán)

（胍基、氨基、咪唑基）

Arg，Lys，His

中性氨基酸:1個–COOH、1個-NH2

當(dāng)前第9頁\共有65頁\編于星期六\9點3，按R基的極性性質(zhì)分為4類：非極性氨基酸：9

極性不解離：6極性氨基酸解離帶負(fù)電荷：2酸性極性解離解離帶正電荷：3堿性

當(dāng)前第10頁\共有65頁\編于星期六\9點POLARNON-POLARTyrHisGly酸性中性BasicAspGluGlnCysAsnSerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpPro氨基酸的極性分類極性或非極性，是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)鍵當(dāng)前第11頁\共有65頁\編于星期六\9點--+++SS有大有小有正有負(fù)有極性非極性

形形色色的氨基酸側(cè)基

當(dāng)前第12頁\共有65頁\編于星期六\9點特殊氨基酸含硫氨基酸含羥基氨基酸-Cβ帶分支氨基酸二羧基一氨基氨基酸二氨基一羧基氨基酸亞氨基酸當(dāng)前第13頁\共有65頁\編于星期六\9點三、氨基酸的構(gòu)型和旋光性*除甘氨酸外，皆含手性C，皆為L-構(gòu)型（蛋白中的氨基酸）；旋光方向不同。左或右旋。旋光儀測定。比旋光度[α]D25(單位濃度、單位長度下的旋光度，＝α/c*l)是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)。當(dāng)前第14頁\共有65頁\編于星期六\9點四：特征光吸收在近紫外區(qū)(200-400nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm，色氨酸的max＝280nm苯丙氨酸的max＝257nm當(dāng)前第15頁\共有65頁\編于星期六\9點五氨基酸的酸堿性質(zhì)一）氨基酸的兼性離子形式：氨基酸的兩個重要性質(zhì)：氨基酸晶體的熔點高（200C）；氨基酸使水的介電常數(shù)增高。AA是兩性電解質(zhì)當(dāng)前第16頁\共有65頁\編于星期六\9點COOHNH2

H+COO-R

-

C

-

HNH2

H+R

-

C

-

HCOO-NH2R

-

C

-

H酸性環(huán)境中性環(huán)境堿性環(huán)境+1-10pK1~2pK2~9.4等電點6.0等電點pI：所帶凈電荷為零。電場中不移動。當(dāng)前第17頁\共有65頁\編于星期六\9點此氨基酸在pH2或9附近，有緩沖作用。當(dāng)前第18頁\共有65頁\編于星期六\9點當(dāng)前第19頁\共有65頁\編于星期六\9點賴氨酸的解離及等電點計算HA2+A+A0A-當(dāng)前第20頁\共有65頁\編于星期六\9點等電點(isoelectricpoint,pI)：分子呈電中性時溶液的pH值。為兼性離子兩側(cè)解離基團(tuán)的算術(shù)平均值。中性氨基酸：酸性和堿性基團(tuán)的算術(shù)平均值：pI=(pK’-COO-+pK’-NH2)/2，pI～6

酸性氨基酸：兩個酸性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值pI=(pK’-COO-+pK’R-COO-

)/2，pI～2堿性氨基酸：兩個堿性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值pI=(pK’-NH2+pK’R-NH2)/2，pI>7

當(dāng)前第21頁\共有65頁\編于星期六\9點不同pH值時所帶電荷

pH=pI氨基酸呈電中性，電泳不移動

pH<pI氨基酸帶正電荷，向陰極移動

pH>pI氨基酸帶負(fù)電荷，向陽極移動在一定pH范圍中，溶液的pH離AA等電點愈遠(yuǎn)，AA帶凈電荷愈多，泳動速度越快。當(dāng)前第22頁\共有65頁\編于星期六\9點補充：化學(xué)性質(zhì)亞硝酸反應(yīng)烴基化反應(yīng)酰化反應(yīng)脫氨基反應(yīng)西佛堿反應(yīng)成鹽成酯反應(yīng)成酰氯反應(yīng)脫羧基反應(yīng)疊氮反應(yīng)側(cè)鏈反應(yīng)茚三酮反應(yīng)成肽反應(yīng)當(dāng)前第23頁\共有65頁\編于星期六\9點除Pro生成黃色化合物外,其它AA生成藍(lán)紫色化合物（570nm）;

與茚三酮反應(yīng)（27）用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。茚三酮水合茚三酮當(dāng)前第24頁\共有65頁\編于星期六\9點補充：含氮量穩(wěn)定氨基酸的結(jié)構(gòu)通式為α氨基酸。蛋白質(zhì)除含C,H,O外，還含有N。AA平均分子量為110。不同蛋白的含氮量皆在16%左右。只需測定N含量，N含量/16%即為蛋白含量。

----凱氏定氮法的理論基礎(chǔ)當(dāng)前第25頁\共有65頁\編于星期六\9點第二節(jié)、氨基酸的分離分析根據(jù)R基的極性。原理：分配層析。

①濾紙層析：②薄層層析：根據(jù)氨基酸的凈電荷及R基的極性：

③離子交換層析：陰離子交換樹脂-N(CH3)3OH，陽離子交換樹脂-SO3H根據(jù)氨基酸的凈電荷及質(zhì)點大?。?/p>

④電泳：當(dāng)前第26頁\共有65頁\編于星期六\9點分配層析的一般原理

層析法――色層分析法（色譜）

系統(tǒng)的組成固定相（靜相）

流動相（動相）分配定律――當(dāng)溶質(zhì)在兩種給定的互不相溶的溶劑中分配時，在一定的溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù).此比值即分配系數(shù)（kd）。當(dāng)前第27頁\共有65頁\編于星期六\9點一）紙層析固定相：纖維素上吸附的水

流動相：展層溶劑，有機(jī)相

層析時，混合AA在兩相中不斷分配，疏水性強(qiáng)的AA在固定相水中溶解度較小，與水的作用力也較小，隨展層劑的展層（移動）也移動較遠(yuǎn)距離（遷移率Rf大）。極性強(qiáng)的Rf值小，疏水性強(qiáng)的Rf大。分離、鑒定AA混合物的方法。當(dāng)前第28頁\共有65頁\編于星期六\9點將下列每組混合物分別用正丁醇-醋酸-水進(jìn)行紙層析，指出每組的相對遷移率。(1)Val和Lys;(2)Phe和Ser;(3)Leu、Ala、Ser當(dāng)前第29頁\共有65頁\編于星期六\9點第三節(jié)肽和蛋白質(zhì)一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。一、肽、肽鍵與肽鏈由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個到幾十個氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。當(dāng)前第30頁\共有65頁\編于星期六\9點在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序。方向性：一條多肽鏈有兩個末端，自由-氨基，稱為氨基端或N-端；游離-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序：N-端→C-端如上述五肽可表示為：Ser-Val-Tyr-Asp-Glu

絲氨酰纈氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酸肽單位主鏈：側(cè)鏈當(dāng)前第31頁\共有65頁\編于星期六\9點二、肽的解離性質(zhì)肽具有酸堿兩性性質(zhì)和等電點。肽的酸堿性質(zhì)主要來自游離末端-NH2和游離末端-COOH以及側(cè)鏈R上可解離的基團(tuán)。每一種肽都有其相應(yīng)的等電點。末端-NH2,-COOH比游離氨基酸的酸堿度降低。

當(dāng)前第32頁\共有65頁\編于星期六\9點當(dāng)前第33頁\共有65頁\編于星期六\9點三、生物活性肽在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。部分肽中含有D-氨基酸。當(dāng)前第34頁\共有65頁\編于星期六\9點

CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCH2CH2CHNH2COOHCH2SH

1.參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)2.作為輔酶參與氧化還原反應(yīng)保護(hù)巰基酶或含Cys的蛋白質(zhì)中

SH的還原性防止氧化物積累GSH+GSH----GSSG當(dāng)前第35頁\共有65頁\編于星期六\9點第四節(jié)、蛋白的分離根據(jù)：所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它蛋白（雜蛋白）的不同進(jìn)行分離?！鋈芙舛炔煌?反相柱層析；鹽析

■分子量不同:透析；凝膠過濾法■所帶電荷不同:電泳；離子交換層析

特有的親和力：親和層析當(dāng)前第36頁\共有65頁\編于星期六\9點一）鹽析法：溶解度不同不同的蛋白質(zhì)溶解度不同。且溶解度隨外界條件如鹽濃度，pH值，溫度等而變?！?/p>

鹽對蛋白質(zhì)濃度的影響●鹽溶

Salting-in:

加少量鹽使蛋白質(zhì)溶解度變大●鹽析

Salting-out:加大量鹽使蛋白質(zhì)由溶液中沉淀出來當(dāng)前第37頁\共有65頁\編于星期六\9點■

蛋白質(zhì)溶解度和pH值及鹽濃度有關(guān)0.0010.0050.01

0.02[NaCl](mol/L)pI4.85.05.25.45.6pH溶解度蛋白的穩(wěn)定因素：（1）帶電層（2）水化層加入少量鹽：增加帶電層，促進(jìn)溶解。

--------鹽溶當(dāng)前第38頁\共有65頁\編于星期六\9點Aggregate蛋白質(zhì)分子表面的疏水性區(qū)域，聚集許多水分子，當(dāng)加入鹽時，這些水分子被抽出，暴露出來的疏水性區(qū)域互相結(jié)合，形成沉淀?！?/p>

鹽析

Salting-out：Ionicstrength溶解度+-+++-----+AmmoniumsulfateSodiumsulfateAlittlesalting-ineffectNH4+SO42-=hydrophobic當(dāng)前第39頁\共有65頁\編于星期六\9點不同蛋白的溶解度曲線

硫酸銨分級沉淀當(dāng)前第40頁\共有65頁\編于星期六\9點二）凝膠過濾法：分子量不同又稱為分子篩層析。依蛋白質(zhì)分子量的差異，通過具有分子篩性質(zhì)的凝膠而分離。葡聚糖凝膠G10-G200瓊脂糖凝膠2B,4B,6B聚丙烯酰胺凝膠S100－S600當(dāng)前第41頁\共有65頁\編于星期六\9點■凝膠顆粒當(dāng)前第42頁\共有65頁\編于星期六\9點小分子進(jìn)入凝膠分子內(nèi)，被滯留大分子在凝膠顆粒間移動，較快流出溶劑流動方向按分子量從大到小依次流出當(dāng)前第43頁\共有65頁\編于星期六\9點問題：已知下列蛋白的分子量。問以凝膠過濾法洗脫時蛋白質(zhì)的洗脫順序如何？（凝膠分級范圍為5000～400，000）④②⑤①③當(dāng)前第44頁\共有65頁\編于星期六\9點三）親和層析法：特定親和力如兩分子間有專一性親和力（特別的結(jié)合和識別能力，具有針對性），以其中一種作為“魚餌”，可把另外一種“釣”出來。其它蛋白不被吸引而結(jié)合不上。當(dāng)前第45頁\共有65頁\編于星期六\9點■親和層析法的作用機(jī)理：固相載體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團(tuán)的配體XBAA當(dāng)前第46頁\共有65頁\編于星期六\9點四）蛋白電泳在外電場的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)有各自的等電點。在非等電點時，蛋白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動的速度（v）取決于電場強(qiáng)度(E)，所帶的凈電荷(q)以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)(f，即顆粒大小及形狀)。當(dāng)前第47頁\共有65頁\編于星期六\9點SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基按大約12比例結(jié)合，使蛋白以一條無構(gòu)型的長條分子存在，且分子表面均勻結(jié)合一層負(fù)的SDS的電荷，蛋白質(zhì)分子原有電荷間的差別則可以忽略。用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。當(dāng)前第48頁\共有65頁\編于星期六\9點當(dāng)前第49頁\共有65頁\編于星期六\9點第五節(jié)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定定義——1969年，國際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)委員會（IUPAC）規(guī)定：蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽連中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。當(dāng)前第50頁\共有65頁\編于星期六\9點F.Sanger

(1953,CambridgeU)

Insulin胰島素(A,Bchains)以傳統(tǒng)氨基酸定序法決定蛋白質(zhì)序列SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT

B-chain

A-chain當(dāng)前第51頁\共有65頁\編于星期六\9點一）、Edmandegradation降解法測定氨基酸順序的一般測定步驟（1）測定多肽鏈的數(shù)目，拆分多肽鏈，分析多肽鏈的N末端和C末端殘基（2）斷裂多肽鏈內(nèi)、間的二硫鍵（3）測定每條多肽鏈的AA組成（4）多肽鏈斷裂成小肽段

（5）測定各個肽段的AA順序（6）確定肽段在多肽鏈中的次序

（7）確定原多肽鏈中二硫鍵的位置當(dāng)前第52頁\共有65頁\編于星期六\9點Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-肽）。酸解，得黃色DNP-氨基酸，用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。（一）N末端分析法二硝基氟苯（DNFB）法是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個反應(yīng)當(dāng)前第53頁\共有65頁\編于星期六\9點用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨基酸.DNS

+

AA多肽蛋白弱堿DNS-AA多肽蛋白酸DNS-AA

+游離AA（乙醚抽提，有熒光）丹磺酰氯法當(dāng)前第54頁\共有65頁\編于星期六\9點(二)二硫鍵的斷裂在可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍（使蛋白變性，亞基分開）存在下，使用過量的-巰基乙醇，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。當(dāng)前第55頁\共有65頁\編于星期六\9點(三)氨基酸組成的分析：酸，堿解后氨基酸分析儀測定當(dāng)前第56頁\共有65頁\編于星期六\9點（四）多肽鏈的部分水解1、酶裂解法

胰蛋白酶

蛋白水解酶（蛋白酶）：糜蛋白酶（肽鏈內(nèi)切酶）

嗜熱菌蛋白酶

胃蛋白酶

當(dāng)前第57頁\共有65頁\編于星期六\9點胰蛋白酶Trypsin

：R1=賴氨酸Lys和精氨酸Arg側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水解速度快）。胰凝乳（糜）蛋白酶：專一性﹤胰蛋白酶

斷裂Phe,Trp,Tyr等芳香族AA的羧基形成的肽鍵。水解位點2、化學(xué)試劑法：溴化氰。R1=甲硫氨酸。當(dāng)前第58頁\共有65頁\編于星期六\9點五）氨基酸序列的測定1、Edman化學(xué)降解法Edman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實際上也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。當(dāng)前第59頁\共有65頁\編于星期六\9點

用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨基酸。亦稱Edman反應(yīng)弱堿

AAPITC+多肽蛋白

AAPTC—多肽蛋白無水甲酸或HFPTH-AA+少一個AA的多肽或蛋白（乙酸乙酯抽提）苯異硫氰酸酯（PITC）