C放射免疫技術(shù)曾霞課件

免疫標(biāo)記技術(shù)免疫學(xué)教研室曾霞...概念：利用多種標(biāo)記技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合而建立的分析技術(shù)體系。特點(diǎn)：高度特異性，高度靈敏性優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)便、易于商品化和自動(dòng)化。分類：固相測(cè)定，液體測(cè)定

標(biāo)記免疫技術(shù)...按標(biāo)記（示蹤）物分類：放射免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、金免疫技術(shù)等。...第六章放射免疫技術(shù)...

放射免疫技術(shù)——是利用放射性核素可探測(cè)的靈敏性、精確性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合而創(chuàng)建的免疫測(cè)定技術(shù)。同位素......一、放射性核素γ射線：主要為131I、125I、57Cr和60Co；β射線：主要有14C、3H和32P。第一節(jié)放射性核素與放射性標(biāo)記物的制備...放射性核素的選擇原則：

（1）比活性（首要）。例如125I比活性為1.74×104Ci/g，14C比活性為4.5Ci/g，則1mol125I或14C結(jié)合到抗原上，125I的敏感度約比14C大3900倍。（2）合適的半衰期。（3）易于標(biāo)記：低能量的γ射線易于標(biāo)記。因而125I是目前常用的RIA標(biāo)記物。...三、標(biāo)記物的制備及鑒定1.標(biāo)記方法：標(biāo)記125I的方法可分兩大類，即直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法。（1）直接標(biāo)記法：是將125I直接結(jié)合于蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基的酪氨酸殘基或組氨酸殘基上。最常用的是氯胺T直接標(biāo)記法。優(yōu)點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)便；②標(biāo)記物具有高度比放射性。缺點(diǎn)：①只能用于標(biāo)記含酪氨酸或組氨酸的化合物；②含酪氨酸的殘基如具有蛋白質(zhì)的特異性和生物活性，則該活性易因標(biāo)記而受損傷。...優(yōu)點(diǎn)：①可標(biāo)記缺乏酪氨酸或組氨酸的肽類及某些蛋白質(zhì)；②標(biāo)記反應(yīng)較為溫和，可以避免因蛋白質(zhì)直接加入125I液引起的生物活性的喪失。缺點(diǎn)：由于操作較復(fù)雜，標(biāo)記蛋白質(zhì)的比放射性顯著低于直接法。（2）間接標(biāo)記法（又稱連接法）：是以125I標(biāo)記在載體上，純化后再與蛋白質(zhì)結(jié)合。...（二）標(biāo)記物的純化1.凝膠過濾法（分子篩）2.離子交換層析法3.PAGE4.高效液相色譜法（HPLC）...（三）標(biāo)記物的鑒定

1.放射化學(xué)純度：一般要求大于95％2.比放射活性：指單位質(zhì)量標(biāo)記物中所含的放射強(qiáng)度。用mCi/mg（或mCi/mmol）表示。比度越高，測(cè)定越敏感。3.免疫活性：B/T在80％以上，該值越大，表示抗原損傷越少。...1959年Yalow和Berson創(chuàng)建，1977年Yalow獲諾貝爾獎(jiǎng)金。第二節(jié)放射免疫分析radioimmunoassay，RIA顯著特點(diǎn)：具有高度的敏感性（高達(dá)ng甚至pg水平）、特異性和精確性，特別適用于微量蛋白質(zhì)、激素和多肽的定量測(cè)定。...一、基本原理

標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）對(duì)特異性抗體（Ab）的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。...放射免疫分析——是以核素標(biāo)記的抗原與受檢標(biāo)本中抗原競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體來測(cè)定待檢樣品中抗原含量的方法。為經(jīng)典模式。

...由于標(biāo)記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標(biāo)記免疫復(fù)合物的量就隨著待檢抗原的量而改變。...（二）實(shí)驗(yàn)方法Ag*AgAb反應(yīng)條件體積溫度時(shí)間pH平衡法非平衡法★抗原抗體反應(yīng)...抗原抗體反應(yīng)

如受檢標(biāo)本抗原含量較高，抗血清的親和常數(shù)較大，可選擇較高的溫度（15～37℃）進(jìn)行較短時(shí)間的溫育，反之應(yīng)在低溫（4℃）作較長時(shí)間的溫育，形成的抗原抗體復(fù)合物較為牢固。...★免疫復(fù)合物（B）與游離標(biāo)記物（F）的分離聚乙二醇沉淀法雙抗體法雙抗體-PEG法是一種將雙抗體與PEG二法相結(jié)合的方法。此法保持了兩者的優(yōu)點(diǎn)，節(jié)省了兩者的用量，而且分離快速、簡(jiǎn)便。...晶體閃爍計(jì)數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計(jì)數(shù)器測(cè)量的放射性信號(hào)是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)計(jì)算參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)擬合注：T即是B與F的總和標(biāo)準(zhǔn)曲線放射強(qiáng)度測(cè)定數(shù)據(jù)處理...

IC中的放射性強(qiáng)度與受檢標(biāo)本中抗原的濃度呈反比。

Ag的量反應(yīng)式B/F值04Ag*+0Ag+3Ab3Ag*Ab+Ag*3/124Ag*+2Ag+3Ab2Ag*Ab+1AgAb+2Ag*+1Ag2/284Ag*+8Ag+3Ab1Ag*Ab+2AgAb+3Ag*+6Ag1/3......免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）——是用放射性核素標(biāo)記的過量抗體與待測(cè)抗原直接結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離結(jié)合與游離標(biāo)記抗體的非競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析。第二節(jié)免疫放射分析Ag-*Ab復(fù)合物的放射性強(qiáng)度與待測(cè)抗原的量成正比關(guān)系...（待測(cè)）（已知）一、基本原理

單位點(diǎn)IRMA：（1）放射性核素標(biāo)記的過量抗體+待測(cè)抗原，形成抗原抗體復(fù)合物；（2）反應(yīng)平衡后，采用固相抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離；（3）測(cè)定上清液的放射量。...雙位點(diǎn)IRMA：先用固相抗體跟抗原反應(yīng)結(jié)合，然后再用放射性核素標(biāo)記的過量抗體與已結(jié)合于固相抗原的另一抗原決定蔟結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物（雙抗體夾心），洗棄反應(yīng)液中剩余的標(biāo)記抗體，測(cè)定固相上的放射性。

（待測(cè)）...不論是單位點(diǎn)還是雙位點(diǎn)IRMA，最后測(cè)得的放射性與受檢抗原的量呈正比。...四、IRMA與RIA比較...應(yīng)用常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。由于其具有放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長，以及具有不易快速、靈活的自動(dòng)化分析等諸多不足，終將會(huì)別其他非放射性標(biāo)記免疫測(cè)定所取代。...思考題名詞解釋：

RIA、IRMA簡(jiǎn)答題：

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