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文檔簡介
ABI3100簡介
及
其常見問題解析姜艷艷2007.3.9主要內(nèi)容ABI遺傳分析儀簡介ABI3100相關(guān)簡介
ABI3100構(gòu)造及毛細(xì)管工作原理數(shù)據(jù)收集軟件的簡介數(shù)據(jù)分析軟件的簡介常見問題解析一.ABI遺傳分析儀系列ABI測序儀和遺傳分析儀系列:
377DNA測序儀
所采用的是板膠最多可同時檢測96個樣品,要人工手動上樣。采用Genescan和Genotyper進(jìn)行分析。310遺傳分析儀采用一道的毛細(xì)管進(jìn)行電泳。一支注射器注膠不能使用96孔板,使用48或96孔的模塊,0.5ml的離心管上樣。所使用的軟件及設(shè)置與377比較相像。3100和3100Avant基因分析儀3100為16道毛細(xì)管3100Avant為4道毛細(xì)管使用96孔板或384孔板進(jìn)行電泳使用注射器將膠注入毛細(xì)管,且有兩支注射器3130和3130xl基因分析儀
3130為四道,3130xl為16道。從膠瓶中自動吸膠注入毛細(xì)管。軟件方面與3100基本相同。3730和3730xl基因分析儀3730為48道毛細(xì)管3730XL為96道毛細(xì)管的其他與3130基本相同型號毛細(xì)管狀態(tài)膠的狀態(tài)備注377無聚丙稀酰胺凝膠使用板膠,人工上樣3101根POP-6和POP-4注射器自動灌膠3100Avant4根POP-6和POP-4
310016根POP-6和POP-4
31304根POP-6和POP-4自動排氣泡,灌膠3130xl16根POP-6和POP-4
373048根POP-6和POP-4
3730xl96根POP-6和POP-4
主要性能參數(shù):二.ABI3100構(gòu)造及毛細(xì)管工作原理1.結(jié)構(gòu)圖250μl此圖表示的是:氣泡沒有排出通道。注意96孔板的使用。3100是16道的,每個run使用兩排孔。若是4道的則是每個run4孔,注意與樣品名的對應(yīng)。
310是單道的毛細(xì)管,不能使用96孔板,而是使用0.5ml的離心管上樣。陽極有電極插在buffer中陰極沒有電極,而是在毛細(xì)管外包裹著一層金屬,插在buffer中。與3100不同,310在毛細(xì)管旁邊有一根金屬電極插在buffer中。2.毛細(xì)管工作原理毛細(xì)管兩端:電滲流:pH大于6時,石英帶負(fù)電荷,熔融的石英毛細(xì)管內(nèi)層帶負(fù)電,來自毛細(xì)管內(nèi)的溶液的正電荷產(chǎn)生電滲流,沿負(fù)電荷的毛細(xì)管壁形成雙層,在電場作用下,雙層中的陽離子向陰極移動,帶動可溶分子向同一方向移動。
為保證DNA片段分離的重復(fù)性,必須包埋毛細(xì)管內(nèi)壁以除去電滲流,ABI3100采用能進(jìn)行DNA分離的POP-4或POP-6膠線性包埋毛細(xì)管內(nèi)壁,阻止電滲流,使DNA從陰極到陽極沒有液體的流動。毛細(xì)管的包埋使之隨著時間而性能有所降低,影響使用壽命。電泳:檢測:一束激光被分成兩束從毛細(xì)管的兩側(cè)同時照亮16根毛細(xì)管,當(dāng)DNA片段經(jīng)過檢測室時,所帶熒光染料被激發(fā),熒光被檢測到,形成膠圖。
三.數(shù)據(jù)收集軟件的簡介1.開關(guān)機(jī)器順序:電腦,3100機(jī)器,收集軟件(關(guān)機(jī)相反)2.空間校正空間校正表明在CCD上呈現(xiàn)每一根毛細(xì)管發(fā)出熒光的正確位置,而不反應(yīng)毛細(xì)管的任何信息。更換毛細(xì)管,毛細(xì)管的被拆卸安裝后時要進(jìn)行空間校正。3.光譜校正
是為了校正熒光染料發(fā)射光譜的重疊,可以消除不同熒光染料間的相互影響。以下情況必需做校正:機(jī)器使用了新的dyeset,激光器或CCD更換,結(jié)果不好有pullup,pulldown的峰。進(jìn)行光譜校正遵循以下步驟新建Pvrotocol新建plate注意:進(jìn)行光譜校正時應(yīng)注意,4道的毛細(xì)管和16道甚至更多道的毛細(xì)管在檢測靈敏度上明顯不同,毛細(xì)管少靈敏度會明顯高一些,這里忽略毛細(xì)管使用次數(shù)的影響。校正不好的實(shí)例:1.軟件提示:
Insufficientnumberofdyespectradetected!Checkrawdata...表現(xiàn):(1)實(shí)際原因:泳道沒有收集到信號,即沒有檢測到目的峰,或目的峰信號過低,低于750rfu。解決方案:如有必要重新校正則減少與甲酰胺的比例,或增大進(jìn)樣時間。(2)實(shí)際原因:引物峰過高,檢測范圍包括引物峰部分。解決方案:調(diào)整檢測范圍到引物峰之后,包括所有目的峰。2.軟件提示:Saturateddatadetected.Calibrationfailed.表現(xiàn):實(shí)際原因:氣泡引起的峰使信號達(dá)到飽和,顯示不通過。解決方案:盡量保證膠及通道中沒有氣泡。(下圖是放大圖)3.軟件提示:Baddyeorderdetected.表現(xiàn):實(shí)際原因:引物峰過高,檢測范圍包括引物峰部分。解決方案:調(diào)整檢測范圍到引物峰之后,包括所有目的峰。4.軟件提示:Failedqualitycheck:q=0.93807islessthanminQthreshold(0.95000)表現(xiàn):實(shí)際原因:各顏色之間引起的putup和putdown峰導(dǎo)致Q值低于設(shè)定值。解決方案:權(quán)宜之計是降低Q值設(shè)定值,徹底解決就是重新生產(chǎn)matrix。4.檢測樣品目前檢測樣品是marker0.2μl,上樣量1.0μl,總體積10μl
樣品的準(zhǔn)備:甲酰胺與marker混合均勻分裝,加入樣品后振蕩,離心,95℃變性5min,冰浴3min,離心,上樣。5.結(jié)果的存儲先在“我的電腦”的E盤上建一個文件夾用于儲存結(jié)果,在數(shù)據(jù)收集軟件中有可以進(jìn)行設(shè)定。結(jié)果的重新導(dǎo)出:結(jié)果可以重新導(dǎo)出,或?qū)⑺枰牟糠纸Y(jié)果重新導(dǎo)出到指定文件夾。6.手動控制注意:手動控制oven時要“send”兩次,一次設(shè)定溫度一次打開oven。四.數(shù)據(jù)分析軟件的簡介應(yīng)用GeneMapper進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析,下面進(jìn)行簡單的介紹。1.Panel及bin的導(dǎo)入
2.分析數(shù)據(jù)添加要分析的文件夾:panelSizestandardAnalysismethod分析后如果如下圖所示:不通過,查找原因。查看原始數(shù)據(jù):查看內(nèi)標(biāo):結(jié)果所得圖形:分析工具欄:→常見問題的解析1.所有毛細(xì)管沒有數(shù)據(jù)原因:毛細(xì)管或block通路中有氣泡沒有樣品進(jìn)入自動進(jìn)樣器不在正確位置,使毛細(xì)管頭吸入氣泡或接觸不到樣品措施:重新正確上樣,排氣泡,拆毛細(xì)管清洗block,syring,更換膠2.個別毛細(xì)管無信號原因:自動進(jìn)樣器不在正確位置(用20μl樣品試驗(yàn))樣品管是中空的(離心)毛細(xì)管有彎曲或有損壞(更換毛細(xì)管)3.信號過飽和原因:上樣量過大(稀釋樣品,減少進(jìn)樣時間)4.信號過低表現(xiàn)為信號很弱,內(nèi)標(biāo)只有幾十rfu。原因:甲酰胺質(zhì)量不高使用的水中鹽離子濃度過高(更換超純水)沒有足夠的樣品(增加上樣量,校正自動進(jìn)樣器)樣品稀釋倍數(shù)過大混合的不充分(充分混合,離心)
自動進(jìn)樣器不在最佳位置5.基線不平,峰形明顯異常原因:膠中可能有污染物(清洗block,syring,更換膠)膠中有結(jié)晶或沉淀物(將膠在室溫放置30min使之達(dá)到室溫,旋動使沉淀物溶解)光譜校正的不好6.信號凌亂,有倒峰原因:所選的dyeset不適合光譜校正的不好7.無電流或電流異常原因:使用的水質(zhì)量不好(更換超純水)
buffer槽中是水或buffer稀釋的倍數(shù)不對陽極沒有足夠的bufferblock或毛細(xì)管中有氣泡(排氣泡)膠已失效整個體系中有泄漏的地方
8.小于100runs毛細(xì)管檢測結(jié)果不好原因:樣品本身不好
甲酰胺質(zhì)量不好
buffer稀釋的倍數(shù)不對9.檢測的結(jié)果異常,移動的快或慢原因:注射器中有水導(dǎo)致膠被稀釋
block或膠中有大氣泡整個體系中有泄漏的地方
甲酰胺的質(zhì)量不好
10.有一根毛細(xì)管電泳時背景有熒光,導(dǎo)致基線不平,影響結(jié)果。原因:毛細(xì)管中有污染物,會隨電泳次數(shù)增多逐漸消失。處理辦法:不加甲酰胺,每次加10μl的蒸餾水,電泳幾次。11.每次電泳時并不是全部泳道信號都很好信號弱或無信號的泳道主要集中在兩端解決方法:換成20μl體系試試,調(diào)整自動進(jìn)樣器尤其是Z軸。連續(xù)多次上樣看是否是某根固定毛細(xì)管,或者是毛細(xì)管有題?;蛟S與所用的96孔板有關(guān),更換96孔板。12.泳道中間基線明顯形成一個臺階說明:屬于正?,F(xiàn)象??赡苁菢悠分杏幸恍┪镔|(zhì)導(dǎo)致的,與樣品的純度有關(guān),但并不影響判型。
分析樣品是會計算調(diào)整基線。13.電泳導(dǎo)致大片段峰形變寬說明:屬于正常現(xiàn)象,是電泳的一個特點(diǎn)。與電泳時片段大小有關(guān),隨著時間的推移片段越來越大,所形成的峰變寬。注:電泳時膠圖注:分析時圖像14.電泳時易出現(xiàn)尖銳的四種顏色都有的峰(多顯示為紅色)說明:膠中有氣泡,離子,雜質(zhì)顆粒或其他有機(jī)物不透光,發(fā)生全反射導(dǎo)致的。解決方案:灌膠前放置室內(nèi)半小時平衡室溫,離心,注意排凈氣泡,注意環(huán)境的潔凈程度,注意操作,以減少雜質(zhì)進(jìn)入。15.電泳時出現(xiàn)目的片斷以外的其他雜峰原因:主要原因是甲酰胺質(zhì)量不好,或者是甲酰胺長期在4度放置有降解。解決方案:更換質(zhì)量好的甲酰胺。(確定不是擴(kuò)增產(chǎn)物。)16.出現(xiàn)電泳峰說明:所出現(xiàn)的尖銳的小峰實(shí)際上是四種顏色都有的,位置不固定,雜亂無章,內(nèi)標(biāo)中相對明顯,影響分析結(jié)果。當(dāng)室溫過高時明顯會增多,可能是膠中有氣泡,受熱膨脹,易形成。嚴(yán)重影響分析結(jié)果的建議重新電泳。16.其他常見的電泳不好的現(xiàn)象說明:內(nèi)標(biāo)峰值很低,樣品峰值低不能作為擴(kuò)增不好的依據(jù)。需要重新上樣以確定原因。說明:內(nèi)標(biāo)并不均勻,大片段明顯變低,可見是電泳結(jié)果不好,樣品的峰形不能作為擴(kuò)增好壞的依據(jù),需要重新上樣來確定。說明:可見所有峰的峰形異常,不能正確進(jìn)行分型,是電泳異常的表現(xiàn),需重新上樣。說明:變性不完全現(xiàn)象。更換質(zhì)量好的甲酰胺,在上樣前變性95°C3min說明:如果校正時跑出如圖的峰型,是電泳現(xiàn)象,與產(chǎn)品質(zhì)量無關(guān)。更換質(zhì)量好的甲酰胺,重新進(jìn)行校正。說明:上圖現(xiàn)象是電泳中出現(xiàn)的現(xiàn)象,在校正正常且多數(shù)通過情況下,更換質(zhì)量好的甲酰胺,上樣前變性,重新電泳。與產(chǎn)品質(zhì)量無關(guān)總體說明:檢測結(jié)果不好時,對照現(xiàn)象查找原因,主要要注意:使用超純水有足夠的buffer,且稀釋倍數(shù)正確保證block通路中沒有氣泡,如需要請儀器負(fù)責(zé)人解決加入適量樣品如要加微量則有必要稀釋,進(jìn)樣時間要適當(dāng),如不能更改則調(diào)整上樣量,使峰高在1000-3000rfu
左右。使用96孔板上樣時如樣品太多又復(fù)雜則應(yīng)事先寫好記錄,加樣后振蕩,離心變性后立即冰浴3min
注意毛細(xì)管的使用次數(shù)(在instrumentprotocol處可見),注意毛細(xì)管不要脫離buffer超過30min
如
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