熒光顯微鏡的原理和使用方法

特殊顯微鏡的使用（3）熒光顯微鏡的原理及其應(yīng)用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諢晒怙@微鏡的原理和使用方法二、實(shí)驗(yàn)原理熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)是熒光顯微術(shù)的基本裝置。熒光顯微術(shù)是利用一定波長(zhǎng)的光（通常是波長(zhǎng)短的紫外光和藍(lán)紫光）照射被檢樣品，激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出可見(jiàn)的熒光。通過(guò)物鏡和目鏡的成像、放大，以供檢視和拍攝。熒光顯微鏡具特殊光源，提供足夠強(qiáng)度和波長(zhǎng)的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。視場(chǎng)中所見(jiàn)的像，主要是樣品的熒光映像。2021/5/91某些物質(zhì)經(jīng)波長(zhǎng)較短的光線照射后，分子被激活，吸收能量后呈激發(fā)態(tài)。其能量部分轉(zhuǎn)化為熱量或用于光化學(xué)反應(yīng)外，相當(dāng)一部分則以波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光能形式輻射出來(lái)，這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的可見(jiàn)光稱作熒光。生物體內(nèi)有些物質(zhì)受激發(fā)光照射后可直接發(fā)出的熒光，稱為自發(fā)熒光（如葉綠體中的葉綠素分子受激發(fā)所發(fā)出的火紅色的熒光）；本身不發(fā)熒光，在吸收熒光染料之后所發(fā)出的熒光稱為次生熒光。常用的熒光染料包括丫啶橙、熒光素、羅丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。細(xì)胞內(nèi)大部分物質(zhì)經(jīng)短光波照射后，可發(fā)出較弱的自發(fā)性熒光。有些細(xì)胞成分與能發(fā)出熒光的有機(jī)化合物——熒光染料結(jié)合。激發(fā)后呈現(xiàn)一定顏色的熒光，借以對(duì)組織進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)的觀察和研究。2021/5/922.1熒光顯微鏡的基本裝置及其光路熒光顯微鏡因制造廠家、型號(hào)的不同，結(jié)構(gòu)各異，但主要構(gòu)件，基本相同。2.1.1光源:采用高壓汞燈。汞燈能以最小的表面發(fā)出最大數(shù)量的紫外光和藍(lán)光，且光亮度大，光度穩(wěn)定。汞燈的構(gòu)件，中間為一球形石英玻璃管，有兩個(gè)鎢電極，內(nèi)充汞滴和少量氬氖混合氣體。汞燈裝在牢固的燈室中，有調(diào)中、聚焦和集光裝置。使用中嚴(yán)禁頻繁啟閉，點(diǎn)亮后欲暫停使用時(shí)，不可切斷電源，可用光閥阻斷光路。當(dāng)汞燈熄滅后，不能立刻點(diǎn)亮，經(jīng)5～10min，汞燈冷卻后再通電點(diǎn)亮。

HBO200Ｗ汞燈的發(fā)射光譜為200～600nm，其中在365nm和435nm處有兩個(gè)高峰。2021/5/932.2.2濾色鏡系統(tǒng):熒光顯微術(shù)的濾色鏡，按用途或功能，主要分為下列兩類：

激發(fā)濾色鏡（exciterfilter）:激發(fā)濾色鏡的作用，在于為被檢樣品的熒光染料提供最佳波段的激發(fā)光。熒光染料均有一定的吸收光譜（激發(fā)峰值），利用濾色鏡對(duì)光線選擇吸收的能力，選用其透射光譜，恰為熒光染料的最大吸收光譜（激發(fā)高峰）的激發(fā)濾色鏡，以便從汞燈發(fā)出的廣譜光波中，選擇透過(guò)最宜波段的光線供用。激發(fā)濾色鏡加放于汞燈和二向色鏡（dichoticmirror）之間，物鏡之前。濾鏡的型號(hào)不同，數(shù)量較多，可按不同需要選用。2021/5/94阻斷濾色鏡（barrierfilter）:阻斷濾色鏡位于物鏡之上，二向色鏡和目鏡之間，用以阻斷或吸收光路中的激發(fā)光或某些波長(zhǎng)較短的光線，以防傷害眼睛，使熒光透過(guò)。選用的原則，以能完全阻斷或吸收波長(zhǎng)短于所需熒光的光線，并透過(guò)樣品發(fā)出的熒光。所以，阻斷濾色鏡的選用，應(yīng)視熒光染料的熒光光譜而定，以能最大限度地透過(guò)熒光和阻斷短波光。2021/5/95二向色鏡（chromaticbeamsplitter）:熒光顯微鏡中，除上述兩類濾色鏡外，尚有一重要的分色鏡系統(tǒng)——二向色鏡位于汞燈汞激發(fā)濾色鏡構(gòu)成的水平光軸與目鏡和物鏡構(gòu)成的豎直光軸的兩軸垂直相交處，斜向安裝于光路之中。由鍍膜的光學(xué)玻璃制成，其鏡面方位與上述兩光軸交角均呈45°，兼有透射長(zhǎng)波光線和反射短波光線的功能。在熒光顯微術(shù)中承當(dāng)色光的“分流”作用。2021/5/962.2.3熒光顯微鏡的光路熒光顯微鏡的光學(xué)原理圖根據(jù)照明方式的不同，熒光顯微鏡分為落射式熒光顯微鏡和透射式熒光顯微鏡兩種。目前常用的是落射式熒光顯微鏡，特點(diǎn)是光源通過(guò)物鏡落射于樣品，激發(fā)產(chǎn)生的熒光再通過(guò)物鏡進(jìn)入目鏡。透射熒光顯微術(shù)光路:透射熒光顯微術(shù)是激發(fā)光束通過(guò)聚光器自下而上的透射樣品，誘發(fā)的熒光從物鏡前方進(jìn)入物鏡。汞燈發(fā)出的強(qiáng)光經(jīng)集光透鏡、吸熱濾色鏡、鏡臂反光鏡、激發(fā)濾色鏡、光路轉(zhuǎn)換反光鏡后光線轉(zhuǎn)射向上，進(jìn)入視場(chǎng)光闌，暗視場(chǎng)聚光器，進(jìn)入樣品，激發(fā)出的熒光射入物鏡經(jīng)阻斷濾色鏡進(jìn)入目鏡。2021/5/97反射熒光顯微術(shù)的光路:反射熒光又稱落射熒光，因激發(fā)光由物鏡后部進(jìn)入物鏡，向下落射樣品，激發(fā)出熒光，熒光反射向上再進(jìn)入物鏡。其光路如圖3-1和3-2所示。汞燈發(fā)出高強(qiáng)的激發(fā)光，經(jīng)集光透鏡，吸熱玻璃，孔徑光闌，激發(fā)濾色鏡，視場(chǎng)光闌，通過(guò)二向色鏡，在此處一定波長(zhǎng)以上的長(zhǎng)波光線透過(guò)二向色鏡，脫離光路，一定波長(zhǎng)以下的短波光線反射向下進(jìn)入物鏡，透過(guò)物鏡射向樣品，激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出可見(jiàn)的熒光，熒光反射向上再次進(jìn)入物鏡，復(fù)經(jīng)二向色鏡其中波長(zhǎng)較短的光線反射至光源方向，熒光和長(zhǎng)波光線透射向上經(jīng)阻斷濾色鏡進(jìn)入目鏡。熒光顯微鏡的光學(xué)原理見(jiàn)圖3-3：

2021/5/98圖3-1落射熒光顯微鏡光路圖2021/5/99圖3-2落射熒光顯微鏡光路圖2021/5/910

圖3-3熒光顯微鏡的光學(xué)原理 2021/5/911熒光的種類自發(fā)熒光（固有熒光）

二次熒光2021/5/912熒光顯微鏡的類型1、透射式熒光顯微鏡：激發(fā)光源是通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱．所以對(duì)觀察較大的標(biāo)本材料較好。

2021/5/913透射式熒光顯微鏡效果圖2021/5/914透射式熒光顯微鏡光路圖2021/5/9152．落射式熒光顯微鏡

：這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡(圖2―6)。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45°角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開(kāi)，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)2021/5/9162021/5/917熒光顯微鏡內(nèi)部構(gòu)2021/5/918落射熒光顯微鏡光路圖2021/5/919使用方法(1)高壓汞燈的調(diào)中：汞燈調(diào)中檢驗(yàn)器似物鏡狀，使用時(shí)將其全部旋入物鏡轉(zhuǎn)換器，中部有一圓形屏，能映現(xiàn)汞燈的電弧像，用以觀察調(diào)中。按通電源，按壓?jiǎn)?dòng)鈕，點(diǎn)亮汞燈。完全開(kāi)放視場(chǎng)光闌和孔徑光闌。轉(zhuǎn)動(dòng)汞燈室右側(cè)的水平和垂直調(diào)中螺旋，通過(guò)調(diào)中器圓形屏觀察，至調(diào)中器內(nèi)部被充分照明止。旋轉(zhuǎn)集光透鏡調(diào)焦鈕，使汞燈電弧像聚焦，再用調(diào)中螺旋將電弧像驅(qū)于水平對(duì)稱位置（調(diào)中）。2021/5/920(2)光吸收器的組裝：反射式熒光裝置無(wú)需聚光器，由一底部封閉的圓筒狀的光吸收器取代，用以吸收射入的光線，防止四射。組裝方法：降下聚光器架，將光吸收器插入楔形神內(nèi)，固緊、回升最高位。2021/5/921(3)操作程序轉(zhuǎn)動(dòng)鏡臂旋轉(zhuǎn)臺(tái)，至相應(yīng)的標(biāo)志位。旋轉(zhuǎn)臺(tái)為一圓盤狀結(jié)構(gòu)，上有5個(gè)定位標(biāo)志：U、V、B、G、O，分別代表不同的熒光激發(fā)方法及其不同的濾色鏡系統(tǒng)組合。點(diǎn)亮汞燈，接通電源，按壓?jiǎn)?dòng)器按鈕，使汞燈點(diǎn)亮。將鏡臂左側(cè)的DIA轉(zhuǎn)換鈕調(diào)至EPI位。確認(rèn)汞燈點(diǎn)亮，照明系統(tǒng)正確，燈位調(diào)中，電弧像聚焦準(zhǔn)確。用熒光染料染色的樣品，放在載物臺(tái)上，用10×物鏡聚焦。孔徑光闌的調(diào)整使用：光闌位于鏡臂中，用外露手桿操縱。在汞燈調(diào)中、聚焦時(shí)，光闌應(yīng)全開(kāi)。熒光顯微時(shí)，孔徑應(yīng)縮小，使之小于視場(chǎng)。2021/5/922

視場(chǎng)光闌的調(diào)整使用：視場(chǎng)光闌位于孔徑光闌之后，亦由外露手桿操縱。視場(chǎng)光闌用于限定樣品表面的照明區(qū)域，其開(kāi)度一般應(yīng)與孔徑光闌的開(kāi)孔相當(dāng)。輔助激發(fā)濾色鏡滑動(dòng)閥的使用:滑動(dòng)閥位于鏡臂專用槽中，可拉出或推入。有三個(gè)擋位供不同使用。全拉出位：供常規(guī)使用；中間位：用于Ｂ激發(fā)法，輔助濾色鏡進(jìn)入光路；全推入位：用作光閥，阻斷全光線．激發(fā)方法：共有四