蛋白折疊及折疊中間體的研究

提綱開展本項(xiàng)研究的意義當(dāng)前相關(guān)研究綜述幾種常用的預(yù)測(cè)方法我們的研究興趣與思路虛擬實(shí)驗(yàn)室1當(dāng)前第1頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)1研究概述蛋白質(zhì)是生命的重要分子，幾乎在所有的生物學(xué)過程中都扮演著重要的角色。因此，關(guān)于其結(jié)構(gòu)與功能方面的研究一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。蛋白質(zhì)生物功能的關(guān)鍵在于其空間構(gòu)象，一個(gè)伸展開來或隨機(jī)排布的肽鏈?zhǔn)菦]有生物活性的。雖然X射線晶體學(xué)和NMR技術(shù)是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的有效手段，但卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上飛速發(fā)展的DNA測(cè)序，它使得蛋白質(zhì)氨基酸序列的信息以爆炸的方式增長，由此迫切需要直接由蛋白質(zhì)的氨基酸序列出發(fā)進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。目前，對(duì)一定氨基酸序列的多肽鏈折疊形成特定空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的機(jī)制了解甚少。雖然已經(jīng)發(fā)展了多種經(jīng)驗(yàn)和理論的計(jì)算方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并取得了某些成功，但總體來說仍是一個(gè)尚未解決的難題。

2當(dāng)前第2頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)

...Scientifically,thefoldingofaproteininall-atomdetailisaholygrailofmoderncomputationalbiology

...

-VijayPande,StanfordUniversity3當(dāng)前第3頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)的4級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)（Primary）-氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)（Secondary）-螺旋（alphahelix）-片層（betasheet）-盤繞（旋轉(zhuǎn)）三級(jí)結(jié)構(gòu)（Tertiary）-3D構(gòu)象四級(jí)結(jié)構(gòu)（Quaternary）-多肽鏈組合4當(dāng)前第4頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)了解3D結(jié)構(gòu)的重要意義幫助我們了解蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系幫助我們了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系幫助我們發(fā)現(xiàn)新藥物和改進(jìn)藥物的設(shè)計(jì)5當(dāng)前第5頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)影響3D結(jié)構(gòu)的幾個(gè)要素氨基酸的物理化學(xué)性質(zhì)氨基酸的相對(duì)位置二面角的限制性氨基酸的親水、疏水性局部二級(jí)結(jié)構(gòu)傾向內(nèi)部穩(wěn)定化因子氫鍵,二硫鍵,鹽橋6當(dāng)前第6頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定X-ray晶體衍射需要生長蛋白質(zhì)晶體（這對(duì)一部分蛋白質(zhì)幾乎是不可能的，總之，不容易）衍射圖樣能進(jìn)行反傅立葉變換來表征電子密度（這有“相”的問題）核磁共振譜（NMR）

能提供距離約束，但很難發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)只適用于相對(duì)較小的蛋白質(zhì)7當(dāng)前第7頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理論預(yù)測(cè)晶體衍射（X-ray）和核磁共振（NMR）實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了需要在人體蛋白中，只有3571

個(gè)可在PDB數(shù)據(jù)庫中找到30-50%的讀碼框（OpenReadingFrames）無法找到已知同源相似物理論預(yù)測(cè)可以用于結(jié)構(gòu)相似性研究，進(jìn)而有助于蛋白質(zhì)功能分析8當(dāng)前第8頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)溶液中的蛋白質(zhì)是一個(gè)受到各種力作用的原子系統(tǒng)：化學(xué)鍵力、氫鍵力、庫侖力、范德華力等。在適當(dāng)?shù)臈l件下，這些作用力將促使幾乎任意初始構(gòu)形的蛋白質(zhì)折疊成為穩(wěn)定的、良好定義的3D結(jié)構(gòu)（nativestate）（在毫秒到秒的時(shí)間量級(jí)）。這是蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)abinitio（denovo）預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)。9當(dāng)前第9頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)另一方面，經(jīng)過百萬年的演變，蛋白質(zhì)形成了一族類，具有相似的序列、相似的結(jié)構(gòu)、以及相關(guān)的功能。這是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的另一類方法－同源性比較方法的基礎(chǔ)。10當(dāng)前第10頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理論預(yù)測(cè)11當(dāng)前第11頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的基本要求

要求優(yōu)先度難度精確性55快速3－42－3自我校正42－3一致性42程序易用性2－3212當(dāng)前第12頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)2相關(guān)研究綜述（分子動(dòng)力學(xué)，MD）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的折疊－解折疊蛋白質(zhì)－配體識(shí)別酶核酸（DNA,RNA）水化（溶劑化）生物膜雙分子脂質(zhì)層離子通道13當(dāng)前第13頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)溶液中，蛋白質(zhì)是一個(gè)受到各種力作用的原子系統(tǒng)：化學(xué)鍵力、氫鍵力、庫侖力、范德華力等。在這個(gè)綜合力場(chǎng)中，運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬，得到蛋白質(zhì)分子的各種可能構(gòu)象（軌跡）。通過對(duì)各種可能構(gòu)象進(jìn)行全局自由能最小搜索，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)。特點(diǎn)：建立在物理原理（定律）的基礎(chǔ)上。僅從蛋白質(zhì)的氨基酸序列出發(fā)。不依賴模型化序列與任何已知結(jié)構(gòu)在折疊水平上的相似性。14當(dāng)前第14頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)1－40A多肽，水溶液，沿著優(yōu)化的過渡路徑的結(jié)構(gòu)變化，從折疊的線圈（coil）結(jié)構(gòu)到-螺旋結(jié)構(gòu)15當(dāng)前第15頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)1－40A多肽，水溶液，沿著優(yōu)化的過渡路徑的結(jié)構(gòu)變化，從折疊的線圈狀態(tài)到折疊的-片層目標(biāo)構(gòu)型16當(dāng)前第16頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)的折疊－解折疊關(guān)于蛋白質(zhì)熱變性的解折疊過程的MD模擬研究表明：解折疊的總體路徑與溫度無關(guān)。溫度升高，只不過過程加速。折疊的過程與解折疊過程有直接的關(guān)系。這兩點(diǎn)與以往的認(rèn)識(shí)截然不同。理由：模擬觀測(cè)到的再折疊（refolding）過程正好與在高溫解折疊模擬中所觀察到的相反。17當(dāng)前第17頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)一些蛋白質(zhì)的本性結(jié)構(gòu)（N）和過渡態(tài)結(jié)構(gòu)（TS）的MD模擬結(jié)果18當(dāng)前第18頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)溶菌酶解折疊過程的MD模擬，經(jīng)過了一系列的中間態(tài)（I），這些不同于螺旋的填充（packing）。D表示變性體。19當(dāng)前第19頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)通過MD模擬Barnase的解折疊過程反過來研究其可能的折疊路徑。D表示變性體。20當(dāng)前第20頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)－配體識(shí)別蛋白質(zhì)－配體識(shí)別與生物分子的自由能模擬得益于一些重要方法的改進(jìn)（和計(jì)算機(jī)能力的提高）。分子識(shí)別的研究能夠幫助人們理解超出相互作用本身所涉及的更多信息，是對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的重要補(bǔ)充。Poisson-Boltzmann靜電模型提供了一個(gè)較快又較簡單的自由能模擬方法，這種情況下靜電相互作用是主要的。研究了天冬氨酸

tRNA合成酶對(duì)氨基酸的識(shí)別，這些特征對(duì)于保持遺傳密碼的完整性是非常重要的。21當(dāng)前第21頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)Asp和Asn對(duì)天冬氨酸t(yī)RNA合成酶（AspRS）成鍵的熱力學(xué)循環(huán)成鍵自由能變化的計(jì)算有兩種方法ΔΔG=ΔG1－ΔG2（Alchemical）ΔΔG=ΔG4－ΔG3（Chemical）22當(dāng)前第22頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)－配體間相互作用以力場(chǎng)能為基礎(chǔ)來確定配體與蛋白質(zhì)之間的相互作用和熱力學(xué)構(gòu)象所進(jìn)行的簡單自由能計(jì)算在配體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)方面是非常有用的工具。線性相互作用能方法計(jì)算配體鍵自由能的MD模擬。優(yōu)勢(shì)：在配合物中僅僅考慮配體之間的相互作用就可確定鍵合能。應(yīng)用在leadoptimization方面有前景蛋白質(zhì)之間的相互作用離子通道23當(dāng)前第23頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)酶MD模擬正在引導(dǎo)我們對(duì)酶的生物活性有一個(gè)更深入的了解。模擬可以告訴我們反應(yīng)物（配體）是如何從酶的表面運(yùn)動(dòng)到內(nèi)藏的活性部位的，以及這種運(yùn)動(dòng)的逼真圖像。提出了酶活性調(diào)節(jié)的可能模式?；就ǖ榔款i的張合運(yùn)動(dòng)影響反應(yīng)物與活性中心的鍵合。動(dòng)力學(xué)選擇性：酶在正常狀態(tài)下瓶頸的張合可能不會(huì)明顯影響與反應(yīng)物的鍵合，但較大的反應(yīng)物分子可能會(huì)在有一個(gè)足夠大的張開前即由于擴(kuò)散而逃走。動(dòng)力學(xué)選擇性可能代表生物分子識(shí)別中的一種更普遍的現(xiàn)象。24當(dāng)前第24頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)乙酰膽堿酯酶（AChE），配體到達(dá)活性部位的幾率由基本通道（喉）頸寬度的波動(dòng)所控制。也可能在很短暫的時(shí)間內(nèi)活性部位和蛋白質(zhì)表面會(huì)出現(xiàn)一個(gè)第二通道（后門）。25當(dāng)前第25頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)AChE通道（喉）“開”與“關(guān)”的構(gòu)象比較（模擬結(jié)果）。Ser203位于活性中心。26當(dāng)前第26頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)核酸（DNA,RNA）核酸的MD模擬，數(shù)皮秒的時(shí)間標(biāo)度?？梢垣@取核酸序列以及各種溶劑條件對(duì)結(jié)構(gòu)和分子的運(yùn)動(dòng)的影響信息。大到象tRNA這樣的分子。在非常詳細(xì)的層面上跟蹤構(gòu)型變化的過程。核酸形成的大的生物分子配合物研究。時(shí)間尺度提升至數(shù)百皮秒。全溶劑化的核酸系統(tǒng)的分子模擬已逐步面向?qū)嶋H體系。算法的改進(jìn)已使得高度變化的核酸體系的精確MD模擬成為可能。更復(fù)雜的反應(yīng)，如RNA催化及折疊等，仍依賴于更強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)。27當(dāng)前第27頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)ApA二聚體的自由能、基礎(chǔ)角、可到達(dá)表面積對(duì)反應(yīng)坐標(biāo)作圖ApA的堆疊構(gòu)型28當(dāng)前第28頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)水化（溶劑化）描述生物大分子周圍的溶劑（水）分子分布。V.Makarov等人從實(shí)驗(yàn)、理論和模擬等方面綜述了這一領(lǐng)域近5年的研究進(jìn)展。結(jié)論大多數(shù)情況下，生物大分子在溶劑中不僅僅是一般的溶解，在與周圍水分子的作用方式上，局域水化模式下水分子的分布更加切合實(shí)際，而不同于游離的水分子。在溶液中，局域化的水分子往往是與大分子締合在一起的。描述了接近DNA和蛋白質(zhì)分子表面的界面溶劑分子的結(jié)構(gòu)（分布）。29當(dāng)前第29頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)抹香鯨肌紅蛋白的水化水化位置（藍(lán)，實(shí)驗(yàn)），水化數(shù)密度最大值（黃，MD模擬）30當(dāng)前第30頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)肌紅蛋白周圍溶劑數(shù)的3D密度分布，由MD軌跡切片計(jì)算得到。溶劑密度由肌紅蛋白的平均結(jié)構(gòu)覆蓋。等密度線：0.005（藍(lán)），0.01（綠），0.02（黃），0.035（紅）（a）由模擬結(jié)果得到（b）由模型預(yù)測(cè)31當(dāng)前第31頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)由MD模擬得到的DNA周圍的溶劑化密度。最大值（實(shí)線）和最小值（虛線）黃點(diǎn)為X射線分析結(jié)果。二者符合良好。32當(dāng)前第32頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)生物膜與雙分子脂質(zhì)層最近10年，計(jì)算機(jī)模擬已經(jīng)深入到能夠認(rèn)識(shí)生物膜性質(zhì)的水平，包括DNA與脂質(zhì)體的相互作用、形成微孔的跨膜肽對(duì)脂質(zhì)體環(huán)境的影響、以及揮發(fā)性麻醉分子的分配等。這些模擬中，所有的原子都是受限在小于10nm的空間內(nèi)，這個(gè)模型搭起了全原子細(xì)節(jié)與介觀區(qū)域之間的橋梁。以磷脂體中的麻醉劑分子為例進(jìn)行了研究。DNA與脂質(zhì)體混合物作為重要的生物物質(zhì)，是因?yàn)樗鼈兪腔虻臄y帶者。33當(dāng)前第33頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)MD模擬5.5ns后DMPC（中性脂質(zhì)體）/DMTAP（陽離子脂質(zhì)體）與DNA的聯(lián)合體構(gòu)型。（a）垂直于DNA軸（b）平行于DNA軸。DNA和脂質(zhì)體的“頭”P、N用球表示，“尾（疏水鏈）”用棍表示。各原子的顏色：N,藍(lán)色；O,紅色；P,黃色;C（DNA）,灰色；C（脂質(zhì)體）,綠色；H,暗灰色。34當(dāng)前第34頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)形成微孔的跨膜肽對(duì)脂質(zhì)體環(huán)境的影響。5_M2-DMPC的構(gòu)型。MD模擬2ns后。脂質(zhì)體分子用球和棍表示。頭端的N和P原子用藍(lán)色和黃色的球表示。各原子的顏色：M2螺旋的N,藍(lán)色；O,紅色；C,灰色；S,黃色。35當(dāng)前第35頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)兩種麻醉劑分子進(jìn)入雙磷脂層的分配情況。MD模擬2ns后的構(gòu)型。水分子和SDPC用球棍模型表示，脂質(zhì)體中的N和P原子表示為藍(lán)色和綠色的球。F,黃色；Cl,亮綠色；Br,暗綠色；H,灰色。36當(dāng)前第36頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)離子通道離子通道允許無機(jī)金屬離子選擇性地穿過膜脂質(zhì)層。通過基于原子模型和外部溶劑與膜脂質(zhì)體之間的微觀相互作用的MD模擬，使我們得以窺探到這類復(fù)雜體系的內(nèi)部過程，允許人們?cè)谖⒂^水平上觀察離子的滲入（透過）。在過去的近十年中，隨著計(jì)算方法的改進(jìn)，短桿菌肽A離子通道的模擬研究從較簡單的僅含有蛋白質(zhì)和少數(shù)水分子的模型過渡到復(fù)雜的含有大的生物分子和脂質(zhì)體的體系。現(xiàn)在，用真實(shí)的原子模型來模擬一些重要的生物通道幾乎是比較常規(guī)的工作，如：Escherichiacoliporin的OmpFporin,機(jī)械敏感通道MscL,Streptomyceslividans的KcsAK+通道。37當(dāng)前第37頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)MD模擬中的被2個(gè)Na＋離子占據(jù)的短桿菌肽A通道38當(dāng)前第38頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)短桿菌肽A通道在50皮秒時(shí)間間隔內(nèi)沿MD軌跡的5個(gè)構(gòu)形的疊合圖39當(dāng)前第39頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)3幾種常用的預(yù)測(cè)方法Abinitio

預(yù)測(cè)不依賴已知結(jié)構(gòu)的同源相似物信息，直接預(yù)測(cè)一個(gè)序列對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)（3D構(gòu)象）線段模型（Threading）通過研究同已知線段序列的吻合度得到結(jié)構(gòu)信息同源性（Homology）建模根據(jù)序列同源性分析、調(diào)整已知結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)40當(dāng)前第40頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)比較成功的工具和技術(shù)Abinitio

預(yù)測(cè)Rosetta,RAMPThreading3D-PSSM,PhD,123D

Homology建模Modeller,SWISS-MODEL41當(dāng)前第41頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)幾種abinitio

預(yù)測(cè)方法分析分子動(dòng)力學(xué)模擬基于格子的方法基于局域模型的方法理論難點(diǎn)：缺少精確的勢(shì)能函數(shù)構(gòu)形空間太大，缺少有效的能量最小化計(jì)算策略

42當(dāng)前第42頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)分子動(dòng)力學(xué)模擬優(yōu)點(diǎn)“真正的”abinitio

預(yù)測(cè)實(shí)時(shí)的動(dòng)力學(xué)信息良好的理論基礎(chǔ)缺點(diǎn)耗時(shí)，計(jì)算成本高對(duì)大分子溶液中勢(shì)函數(shù)的研究不足

43當(dāng)前第43頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)基于格子模型的方法格子模型（Latticemodels）用格子作為蛋白質(zhì)的建造單位Ising模型離散態(tài)偏離格子模型（DiscreteStateOff-LatticeModels）允許氨基酸擁有有限的運(yùn)動(dòng)自由度44當(dāng)前第44頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)基于格子模型的方法優(yōu)點(diǎn)物理圖像簡單降低了計(jì)算復(fù)雜度缺點(diǎn)無法描述復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)分辨率低于格子大小，限制了研究的精確度45當(dāng)前第45頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)基于局域模型的方法局域預(yù)測(cè)方法（NarrowingthesearchwithLocalStructurePrediction）片段可以獨(dú)立地進(jìn)行折疊折疊的細(xì)節(jié)依賴于上下文序列成功應(yīng)用DavidBaker等的Rosetta46當(dāng)前第46頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)基于局域模型的方法如運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型、決策樹模型等機(jī)器學(xué)習(xí)算法來提高計(jì)算效率優(yōu)點(diǎn)計(jì)算速度快精度高結(jié)合了

Homology方法的優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)非實(shí)時(shí)信息物理圖像不明顯47當(dāng)前第47頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)通過機(jī)器學(xué)習(xí)提高效率基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法SilvioTosatto等基于決策樹模型的方法ShawnM.Douglas等基于SVM的方法Xu等（PROSPECT）48當(dāng)前第48頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)CASP競(jìng)賽

CriticalAssessmentofStructurePrediction94年起每兩年進(jìn)行一次分為三類對(duì)已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),abinitio,homology,folding,etc.部分自動(dòng)與全自動(dòng)方法發(fā)表大量相關(guān)信息、評(píng)價(jià)和展望預(yù)測(cè)結(jié)果逐年得到改進(jìn)49當(dāng)前第49頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)Rosetta的預(yù)測(cè)結(jié)果

左側(cè)為實(shí)測(cè)結(jié)構(gòu)，右側(cè)為預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)50當(dāng)前第50頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)Rosetta對(duì)T0116262-322

的預(yù)測(cè)結(jié)果實(shí)際預(yù)測(cè)51當(dāng)前第51頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)Abinitio

預(yù)測(cè)發(fā)展趨勢(shì)更高的預(yù)測(cè)精度（大于60%－70%）更加自動(dòng)化的預(yù)測(cè)，盡量減少人為的干預(yù)與其他方法相結(jié)合52當(dāng)前第52頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)4我們的思路－雞尾酒方法

（Semi-abinitio

方法）分子動(dòng)力學(xué)模擬優(yōu)點(diǎn)：實(shí)時(shí);良好的理論基礎(chǔ)缺點(diǎn)：計(jì)算成本高;精確度不夠高基于模型的方法優(yōu)點(diǎn)：計(jì)算速度快;精確度高缺點(diǎn)：不實(shí)時(shí);物理圖像不夠明確53當(dāng)前第53頁\共有57頁\編于星期三\15點(diǎn)Semi-