第八章免疫標記技術2

優(yōu)選第八章免疫標記技術Ppt1當前第1頁\共有135頁\編于星期三\10點2免疫標記技術免疫標記技術是指用熒光素、酶、同位素等標記抗體或抗原所進行的抗原抗體反應;三大標記技術:

同位素標記技術免疫熒光技術

酶免疫測定當前第2頁\共有135頁\編于星期三\10點3標記免疫技術1.免疫熒光法（immunofluorescence，IF）2.酶免疫測定（enzymeimmunoassay，EIA）3.放射免疫測定法（radioimmunoassay，RIA）4.化學發(fā)光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）

5免疫印跡法（immunoblotting,Westernblot)當前第3頁\共有135頁\編于星期三\10點4第一節(jié)放射免疫測定法

（radioimmunoassay,RIA）當前第4頁\共有135頁\編于星期三\10點5

放射性同位素(131I,或125I)標記Ag或Ab測定Ab或Ag,通過測定放射活性判斷結果。該法常用于測定微量物質:如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛等藥物以及l(fā)gE等。當前第5頁\共有135頁\編于星期三\10點6VeteransAdministrationHospitalBronx,NY,USA

當前第6頁\共有135頁\編于星期三\10點7

與此同時，Ekins利用競爭性蛋白結合分析技術測定甲狀腺素獲得成功；開創(chuàng)了生物活性物質微量測定技術的新時代，是微量分析方法學上的一個突破。當前第7頁\共有135頁\編于星期三\10點8優(yōu)點：①特異性強，即抗原抗體的特異性反應；②靈敏度高，結果精確，檢測范圍10-910-12g；③操作流程簡單易行，測量和數(shù)據(jù)處理自動化；④樣品用量少、無需復雜的提純步驟；⑤應用范圍廣泛，尤其是測量小分子半抗原。缺點：需要昂貴的檢測儀器；同位素污染。當前第8頁\共有135頁\編于星期三\10點9原理

是建立在標記抗原（或配體）和待測抗原（或配體）對有限量的特異性抗體（或受體）的競爭性抑制反應基礎上的，最終形成的放射性標記復合物與被測配體（或抗原）呈負相關，因而亦稱競爭性放射免疫技術。當前第9頁\共有135頁\編于星期三\10點10

Ag*+ Ab?Ag*-Ab

（F）（B）

+Ag ?Ag-Ab

當前第10頁\共有135頁\編于星期三\10點11RIA測定原理的定量示意圖

Ag*AgAbAgAb游離AgB/FB/T∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧6/26/83/53/82/62/84/44/8當前第11頁\共有135頁\編于星期三\10點12返回當前第12頁\共有135頁\編于星期三\10點13

第二節(jié)免疫熒光法

(immuno–fluorescencetechnique

)當前第13頁\共有135頁\編于星期三\10點14原理

免疫熒光技術又稱熒光抗體法。將抗體或抗原標記以熒光素，然后與相應抗原或抗體結合，形成的免疫復合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，借助熒光檢測儀（熒光顯微鏡或用流式細胞儀）測定或定位被檢抗原或抗體。

異硫氰酸熒光素(FITC)呈黃綠色熒光;

巰基化藻紅蛋白(PE)呈橙紅色熒光。當前第14頁\共有135頁\編于星期三\10點15當前第15頁\共有135頁\編于星期三\10點16激發(fā)光和發(fā)射光當前第16頁\共有135頁\編于星期三\10點17

抗原抗體反應的高度特異性熒光的敏感可測性顯微技術的高度精確性

準確、特異、靈敏、快速地檢測和定位微量物質。當前第17頁\共有135頁\編于星期三\10點18優(yōu)點：

特異性強，速度快，敏感性高，能準確檢測少量抗原或抗體在組織細胞內(nèi)的定位分布。缺點：

非特異性染色問題尚未完全解決,結果判定的客觀性不足。

返回當前第18頁\共有135頁\編于星期三\10點19建立技術的必備條件1．

熒光素2．熒光素與蛋白質結合物的制備3．熒光檢測儀返回當前第19頁\共有135頁\編于星期三\10點20熒光素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染色物質。當前第20頁\共有135頁\編于星期三\10點21

熒光的種類

自發(fā)熒光

二次熒光當前第21頁\共有135頁\編于星期三\10點22常用的熒光素返回當前第22頁\共有135頁\編于星期三\10點23熒光檢測儀

（1）熒光顯微鏡（2）熒光分光光度計（3）流式細胞儀（4）熒光偏振光分析儀

當前第23頁\共有135頁\編于星期三\10點24熒光顯微鏡當前第24頁\共有135頁\編于星期三\10點25熒光顯微鏡的構造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈當前第25頁\共有135頁\編于星期三\10點26分類：（1）直接熒光法:

（2）間接熒光法:

（3）流式細胞術(flowcytometry):

樣品(細胞)經(jīng)各種熒光素標記的不同抗體染色后可同時分析細胞表達的多種分子。當前第26頁\共有135頁\編于星期三\10點27(1)免疫熒光法：

①直接法:

簡單、快速、特異;敏感性差。

將熒光素標記在特異性抗體上，直接檢測抗原。當前第27頁\共有135頁\編于星期三\10點28返回當前第28頁\共有135頁\編于星期三\10點29②間接法:

可檢測多種不同的抗原抗體復合物，具一定通用性；敏感性高;但操作流程長、干擾因素多。將熒光素標記在第二抗體（抗抗體）上或標記在SPA上，檢測與抗原結合的特異性抗體。當前第29頁\共有135頁\編于星期三\10點30當前第30頁\共有135頁\編于星期三\10點31③補體熒光染色法：

將熒光素標記在補體的抗體上（抗C3抗體），檢測抗原抗體復合物。可檢測所有的抗原抗體系統(tǒng)，具通用性；敏感性高；但操作流程長、干擾因素多、非特異性熒光多，補體易失活、需新鮮制備不方便。當前第31頁\共有135頁\編于星期三\10點32當前第32頁\共有135頁\編于星期三\10點33當前第33頁\共有135頁\編于星期三\10點34特殊染色法

①

雙標記免疫熒光技術②雙色免疫熒光技術③反襯染色法

返回當前第34頁\共有135頁\編于星期三\10點35①雙標記免疫熒光技術

在同一標本中，可用兩種不同顏色的熒光標記抗體進行免疫熒光染色，同時顯示兩種不同的細胞或同一細胞上不同類型的抗原。如：FITC（黃綠色熒光）和RB200或TRITC9（桔紅色熒光）。當前第35頁\共有135頁\編于星期三\10點36②雙色免疫熒光技術

如FITC標記抗體和細胞核染色劑PI（碘化丙錠）。

當前第36頁\共有135頁\編于星期三\10點37雙重染色標本的單色和雙色觀察

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI當前第37頁\共有135頁\編于星期三\10點38多重染色標本的多色觀察（FITC+TexasRed+DAPI）返回當前第38頁\共有135頁\編于星期三\10點39當前第39頁\共有135頁\編于星期三\10點40③反襯染色法

是用一種非特異染色來反襯一種免疫熒光試劑的特異性染色。如：用RB200標記牛血清白蛋白作為非特異性反襯標記，用FITC標記特異性抗體。當前第40頁\共有135頁\編于星期三\10點41當前第41頁\共有135頁\編于星期三\10點42流式細胞術(FlowCytometry,FCM)

是七十年代發(fā)展起來的高科學技術,它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于一體,同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA、RNA含量等,在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。

當前第42頁\共有135頁\編于星期三\10點43當前第43頁\共有135頁\編于星期三\10點44FACS組成示意圖當前第44頁\共有135頁\編于星期三\10點Fluorescence-activatedcellsorter(FACS)當前第45頁\共有135頁\編于星期三\10點46流式細胞儀實驗原理當前第46頁\共有135頁\編于星期三\10點47當前第47頁\共有135頁\編于星期三\10點48表達量檢測

當前第48頁\共有135頁\編于星期三\10點49細胞凋亡研究

PI染色當前第49頁\共有135頁\編于星期三\10點50AV-PI雙染色當前第50頁\共有135頁\編于星期三\10點51血液學應用：包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞群測定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，紅細胞疾病診斷，血小板功能分析和血小板病診斷，微小殘留白血病檢測，白細胞吞噬功能測定，NK和LAK細胞活性測定，造血干/祖細胞測定等當前第51頁\共有135頁\編于星期三\10點52胞內(nèi)細胞因子的檢測當前第52頁\共有135頁\編于星期三\10點53T細胞亞群分析當前第53頁\共有135頁\編于星期三\10點54第三節(jié) 免疫酶技術

（enzymeimmunoassaytechnique）

1971年Engrail和Penlmann以及Vanweemen和Schuurs兩組學者分別用酶代替放射性同位素制備了酶標記試劑，創(chuàng)立了酶免疫分析技術（enzymeimmunoassay，EIA）。當前第54頁\共有135頁\編于星期三\10點55第三節(jié)酶免疫測定法

(enzymeimmunoassay，EIA)酶免疫技術是通過適當?shù)拿复倩瘜W反應和免疫反應，使抗體（或抗原）與酶蛋白分子結合，形成酶標抗體（或抗原）,該結合物保留免疫學活性的酶活性,因而既有抗原抗體反應特異性,又有酶促反應的特異性。酶分解底物后的顯色深淺可反映標本中抗原或抗體的含量。常用酶：辣根過氧物酶、堿性磷酸酶。常用方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗――ELISA當前第55頁\共有135頁\編于星期三\10點56一、原理E：酶；S:底物；P:有色產(chǎn)物；D1：供氫體；D2：D1的氧化型有色化合物

將抗原和抗體的特異性免疫反應與酶的催化反應相結合而建立的一種免疫檢測技術。當前第56頁\共有135頁\編于星期三\10點57優(yōu)點：①靈敏度高，特異性強；②可定性、定量檢測可溶性抗原和抗體；③試劑穩(wěn)定，保存時長，無同位素污染；④可肉眼半定量，也可儀器（低廉）定量檢測；⑤操作簡便，易于掌握和使用，且重復性好；⑥可用于定位組織細胞上的抗原或抗體成分。缺點：

標記反應較難掌握，在操作過程中容易引起酶、抗原或抗體的失活。當前第57頁\共有135頁\編于星期三\10點58

建立技術的條件

1．標記酶2．免疫酶結合物的制備3．酶標檢測儀當前第58頁\共有135頁\編于星期三\10點59常用的標記酶

①辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）②堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）③葡萄糖氧化酶（glucooxidase，Glu）④-D-半乳糖苷（-D-galactosidase，-D-Gal）當前第59頁\共有135頁\編于星期三\10點60當前第60頁\共有135頁\編于星期三\10點61當前第61頁\共有135頁\編于星期三\10點62二、基本類型均相酶免疫測定法酶增強免疫技術；酶減弱免疫技術；輔基標記技術2.非均相酶免疫測定法

ELISA(直接法、間接法、夾心法、競爭法、抗酶抗體法）1971年建立，稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）當前第62頁\共有135頁\編于星期三\10點63直接ELISA間接ELISA（用于檢測Ab）當前第63頁\共有135頁\編于星期三\10點64directELISA（forAg）當前第64頁\共有135頁\編于星期三\10點65directELISA（forAb）返回當前第65頁\共有135頁\編于星期三\10點66當前第66頁\共有135頁\編于星期三\10點67當前第67頁\共有135頁\編于星期三\10點68返回當前第68頁\共有135頁\編于星期三\10點69

（3）夾心法

（sandwichassay）當前第69頁\共有135頁\編于星期三\10點70夾心法當前第70頁\共有135頁\編于星期三\10點71雙夾心法返回當前第71頁\共有135頁\編于星期三\10點72當前第72頁\共有135頁\編于星期三\10點73當前第73頁\共有135頁\編于星期三\10點74ELISA雙抗體夾心法(測Ag)間接法(測Ab)加Ab,清洗加Ag形成復合物，洗滌加該Ag的另一Ab（酶標），洗滌加底物，讀數(shù)加Ag，清洗加Ab形成復合物，洗滌加酶標二抗加底物，讀數(shù)聚苯乙烯微量反應板當前第74頁\共有135頁\編于星期三\10點75當前第75頁\共有135頁\編于星期三\10點76抗酶抗體法（PAP）當前第76頁\共有135頁\編于星期三\10點77血清IgE的檢測實驗材料酶標板（聚苯乙烯微量板）馬抗人抗體—（購自北京中山公司）辣根過氧化物酶（）標記的馬抗人抗體—待檢血清包被緩沖液：碳酸鈉碳酸氫鈉洗滌液封閉液：溶液反應終止液：當前第77頁\共有135頁\編于星期三\10點78實驗方法包被酶標反應板：加馬抗人抗體（），孔℃孵育小時后洗滌次，分鐘次，孔，℃過夜孔

↓℃孵育后，洗滌同上酶標記抗體：加入適當稀釋度的酶標抗體，孔℃孵育后，洗滌同上底物：加入（鄰苯二胺）溶液，孔

↓室溫分鐘終止液：加入，孔

↓內(nèi)，用酶標儀測定各孔值，測定波長實驗結果

用待測標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均吸收值的比值（）

表示，當大于某一數(shù)值時（如）判斷為陽性，數(shù)值的大小依具體檢測要求而定。當前第78頁\共有135頁\編于星期三\10點79（4）競爭法 a．固相抗體競爭法

b．固相抗原競爭法 當前第79頁\共有135頁\編于星期三\10點80

a．固相抗體競爭法當前第80頁\共有135頁\編于星期三\10點81

b．固相抗原競爭法返回當前第81頁\共有135頁\編于星期三\10點82夾心ELISA競爭ELISA（用于檢測大分子Ag）（用于檢測小分子Ag）當前第82頁\共有135頁\編于星期三\10點83返回（5）抗體橋聯(lián)法

（immunobridge）當前第83頁\共有135頁\編于星期三\10點84（6）抗酶抗體法

（peroxidase-antiperoxidase，PAP）當前第84頁\共有135頁\編于星期三\10點85PO

抗

PO法返回當前第85頁\共有135頁\編于星期三\10點86酶聯(lián)免疫斑點法(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

在研究免疫應答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。

當前第86頁\共有135頁\編于星期三\10點87當前第87頁\共有135頁\編于星期三\10點88ELISPOT&ELISAELISA通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。

ELISPOT通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體為BD、R&D、Mabtach生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。當前第88頁\共有135頁\編于星期三\10點89原理

細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結果。當前第89頁\共有135頁\編于星期三\10點90DirectandIndirectElISPOT

可在已包被抗體的孔中直接刺激細胞（直接法），或在24孔板或燒瓶中先刺激細胞，然后放入已包被的孔中（間接法）。方法選擇基于：1）檢測細胞的類型；2）希望得到的細胞量。若只需少量的細胞因子生成細胞，使用直接法；反之，最好使用間接法。其它步驟一致。當前第90頁\共有135頁\編于星期三\10點91ElISPOT操作過程當前第91頁\共有135頁\編于星期三\10點92當前第92頁\共有135頁\編于星期三\10點93當前第93頁\共有135頁\編于星期三\10點94當前第94頁\共有135頁\編于星期三\10點95操作過程

1.用100ul70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。2.倒去酒精，用100ulPBS洗滌3次。3.將100ul捕獲抗體加入10mlPBS中，混合，每孔加100ul，蓋上板蓋，4℃過夜。4.倒去液體，100ulPBS洗滌一次。5.每孔加入100ul2%脫脂乳PBS（見試劑準備），蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。7.用100ulPBS洗滌一次。8.每孔加入100ul細胞懸浮液（含適當量的細胞和相應濃度的刺激劑）。細胞可預先在體外接受刺激（間接Eli-spot）。蓋上標準的96孔板塑料板蓋，37℃CO2孵育箱中孵育一定的時間（15-20小時）。這期間不要晃動或移動孔板。9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。當前第95頁\共有135頁\編于星期三\10點9611.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次12.于10mlPBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時30分。13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。14.每板以10mlPBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時。15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。16.每孔加入100ulBCIP/NBT。17.室溫下反應5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應的盤中。18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點數(shù)。4℃下放置一夜，點會比較明顯。當前第96頁\共有135頁\編于星期三\10點97當前第97頁\共有135頁\編于星期三\10點98當前第98頁\共有135頁\編于星期三\10點99當前第99頁\共有135頁\編于星期三\10點100返回當前第100頁\共有135頁\編于星期三\10點101當前第101頁\共有135頁\編于星期三\10點102四、通用與放大技術1．SPA通用系統(tǒng)2．ABC放大系統(tǒng)返回當前第102頁\共有135頁\編于星期三\10點103（1）SPA的發(fā)現(xiàn)

1940年Verwey發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的某些菌株，可與人正常血清在雙相免疫擴散試驗中出現(xiàn)沉淀線。1958年Jensen用離子交換樹脂分析證明，該成分是一種細菌胞壁上不含糖的蛋白質，命名為金黃色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA，SPA)當前第103頁\共有135頁\編于星期三\10點104Forsgren等證明SPA與IgG分子的Fc段結合，為非特異免疫反應。生產(chǎn)SPA的國際標準菌株:CowanⅠ株（NcTc8530和ATCC12598）不生產(chǎn)SPA的標準株:Wood46

返回當前第104頁\共有135頁\編于星期三\10點105（2）顆粒SPA的應用

協(xié)同凝集試驗SPA吸收IgG試驗應用IgG-SPA制備抗IgG的抗體返回當前第105頁\共有135頁\編于星期三\10點106（3）SPA的標記和應用

熒光素標記SPA及應用酶標記SPA及應用

當前第106頁\共有135頁\編于星期三\10點107酶標SPA法返回當前第107頁\共有135頁\編于星期三\10點108ABC放大系統(tǒng)

生物素-親合素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem）

高度特異性高度靈敏性簡單快速安全穩(wěn)定

當前第108頁\共有135頁\編于星期三\10點109（1）生物素、親合素、

鏈霉親合素的特性

生物素（biotin，B）又稱維生素H、輔酶R（羧基轉化酶的輔酶）

MW244.31，pI3.5

分子式為C10H16O3N2S當前第109頁\共有135頁\編于星期三\10點110當前第110頁\共有135頁\編于星期三\10點111Biotin當前第111頁\共有135頁\編于星期三\10點112親合素（avidin，A）

又稱卵白蛋白、抗生物素。

MW68,000，pI10～10.5，為堿性蛋白，含糖量高達10%；

1個親合素可與4個生物素結合；

Ka=1015mol/L當前第112頁\共有135頁\編于星期三\10點113鏈霉親合素（streptavidin，SA）：

是Streptomycesavidin菌分泌的一種蛋白質。

MW65000，pI6.0，為略偏酸性的蛋白，不含任何糖基

1個鏈霉親合素可與4個生物素結合

Ka=1015mol/LSA比A在實際應用中靈敏度要高、非特異性反應要少。返回當前第113頁\共有135頁\編于星期三\10點114（2）生物素的標記技術

生物素的活化活化生物素結合物的制備活化生物素可結合或偶聯(lián)抗體、酶、蛋白質、多肽、激素、凝集素、糖類及DNA、RNA等

當前第114頁\共有135頁\編于星期三\10點115（4）生物素-親合素系統(tǒng)的應用當前第115頁\共有135頁\編于星期三\10點116返回當前第116頁\共有135頁\編于星期三\10點117四、ELISA方法的發(fā)展1.酶聯(lián)免疫熒光測定法當前第117頁\共有135頁\編于星期三\10點1182.IgM型抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗（IgMantibodycaptureELISA,MAC-ELISA)當前第118頁\共有135頁\編于星期三\10點1193.斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA)當前第119頁\共有135頁\編于星期三\10點120當前第120頁\共有135頁\編于星期三\10點121三、免疫金溶膠技術當前第121頁\共有135頁\編于星期三\10點122

膠體金試紙條診斷是采用斑點免疫層析技術研制而成，該技術是90年代初在免疫滲濾技術的基礎上建立的一種簡易快速的免疫學檢測技術，最先用于人絨毛膜促性腺激素（HCG）的測定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等檢測。（4）斑點免疫層析試驗

（dotimmunochromatographicassay,DICA)當前第122頁\共有135頁\編于星期三\10點123

膠體金（Collo