第二章動物細胞工程演示文稿

第二章動物細胞工程演示文稿當前第1頁\共有124頁\編于星期三\9點優(yōu)選第二章動物細胞工程當前第2頁\共有124頁\編于星期三\9點

1.貼附型

大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能按照體內(nèi)組織學標推判定，大致分成以下四型：

一、培養(yǎng)細胞的形態(tài)特征當前第3頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）成纖維細胞型

胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。當前第4頁\共有124頁\編于星期三\9點名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的。來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細胞，心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內(nèi)皮。形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)。生長特點：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起。當前第5頁\共有124頁\編于星期三\9點（2）上皮型細胞細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。當前第6頁\共有124頁\編于星期三\9點名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全相同。來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤。形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核。生長特點：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀

生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動。當前第7頁\共有124頁\編于星期三\9點（3）游走細胞型呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。（4）多型細胞型有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。Hepatocytes當前第8頁\共有124頁\編于星期三\9點2.懸浮型見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。當前第9頁\共有124頁\編于星期三\9點概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長。來源：血，脾或骨髓，尤以血中白細胞，癌腫細胞。特點：在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團。優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，

易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)。缺點：觀察不方便，很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞)。當前第10頁\共有124頁\編于星期三\9點1.培養(yǎng)細胞生命期（LifeSpanofCultureCells）所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。二、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程

當前第11頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）原代培養(yǎng)期

也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。當前第12頁\共有124頁\編于星期三\9點（2）傳代期

原代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系（DiploidCellLine）。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當前第13頁\共有124頁\編于星期三\9點（3）衰退期

此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）。轉(zhuǎn)化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系（InfiniteCellLine），也稱連續(xù)細胞系（ContinuousCellLine）。當前第14頁\共有124頁\編于星期三\9點2.組織培養(yǎng)細胞一代生存期

所謂細胞“一代”，指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：當前第15頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）潛伏期（LatentPhase）

細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。當前第16頁\共有124頁\編于星期三\9點（2）指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）

這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂指數(shù)（MitoticIndex：MI）表示。當前第17頁\共有124頁\編于星期三\9點

在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3-5天后，隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（ContactInhibition）。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（DensityInhibition），導致細胞分裂停止。當前第18頁\共有124頁\編于星期三\9點（3）停滯期（StagnatePhase）

細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。當前第19頁\共有124頁\編于星期三\9點三、動物細胞體外培養(yǎng)動物組織器官切碎或酶解原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)當前第20頁\共有124頁\編于星期三\9點1.原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)是從機體取得材料開始，在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)至第一次傳代前的這一過程。主要方法有組織塊培養(yǎng)、酶解培養(yǎng)法。2.傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。當前第21頁\共有124頁\編于星期三\9點1.腫瘤細胞/細胞系的培養(yǎng)腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養(yǎng)的細胞。當前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學極其重要的手段。腫瘤細胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。

四、特殊組織細胞的培養(yǎng)當前第22頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）培養(yǎng)腫瘤細胞生物學特性

腫瘤細胞與體內(nèi)正常細胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。當前第23頁\共有124頁\編于星期三\9點①形態(tài)和性狀

培養(yǎng)中腫瘤細胞無光學顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規(guī)則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關(guān)。正常上皮極向消失排列紊亂層次增多當前第24頁\共有124頁\編于星期三\9點14～6核∶漿=1∶4～611.1～1.2核∶漿=1∶1.1～1.2當前第25頁\共有124頁\編于星期三\9點間期

前期

中期

后期

末期

正常細胞的有絲分裂過程

惡性腫瘤細胞的病理性核分裂像

當前第26頁\共有124頁\編于星期三\9點②生長增殖

腫瘤細胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。腫瘤細胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細胞培養(yǎng)時，形成集落（克隆）的能力比正常細胞強。腫瘤細胞增殖數(shù)量增多擴展時，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。

肺癌細胞當前第27頁\共有124頁\編于星期三\9點③永生性

永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養(yǎng)中的腫瘤細胞系或細胞株都表現(xiàn)有這種性狀，體內(nèi)腫瘤細胞是否如此尚無直接證明。乳腺癌細胞當前第28頁\共有124頁\編于星期三\9點④浸潤性

浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養(yǎng)癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。原發(fā)瘤血道轉(zhuǎn)移淋巴道轉(zhuǎn)移種植性轉(zhuǎn)移直接蔓延浸潤性生長當前第29頁\共有124頁\編于星期三\9點⑤異質(zhì)性

所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細胞的活力有差別的瘤組織。正常腸粘膜結(jié)腸癌（與正常組織交界）當前第30頁\共有124頁\編于星期三\9點⑥細胞遺傳

大多數(shù)腫瘤細胞有遺傳學改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成，有干細胞系和數(shù)個亞系，并不斷進行著適應(yīng)性演變。當前第31頁\共有124頁\編于星期三\9點（2）培養(yǎng)方法

腫瘤細胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細胞培養(yǎng)與正常組織細胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。當前第32頁\共有124頁\編于星期三\9點

取材

人腫瘤細胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。當前第33頁\共有124頁\編于星期三\9點

培養(yǎng)基

腫瘤細胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細胞培養(yǎng)。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。當前第34頁\共有124頁\編于星期三\9點

成纖維細胞的排除

成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。當前第35頁\共有124頁\編于星期三\9點抑制成纖維細胞生長因素方法因素組織細胞選擇性附著

選擇性附著底物

匯合飼養(yǎng)細胞層

選擇性培養(yǎng)基胰蛋白酶

膠原酶

聚丙烯酰胺

聚四氟乙烯（Teflon）

膠原（豬皮）

小鼠3T3

人胎小腸

D-纈氨酸（Valine）

MCDB-710

MCDB-153

Phenobarbitone胚胎小腸、心肌、表皮

乳癌

各種腫瘤

轉(zhuǎn)化細胞

表皮細胞

表皮

正常和惡性乳腺上皮

結(jié)腸癌

腎組織

乳腺

表皮

肝細胞當前第36頁\共有124頁\編于星期三\9點

成纖維細胞排除法

機械刮除法：標記→刮除→沖洗→培養(yǎng)

反復貼壁法：根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。

膠原酶消化法：本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。當前第37頁\共有124頁\編于星期三\9點【形態(tài)觀察】主要觀察細胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。

【細胞生長增殖】檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數(shù)、倍增時間、細胞周期時間。

【細胞核型分析】檢測核型特點，染色體數(shù)量、標記染色體的有無、帶型等。

【凝集試驗】檢測凝集力。

【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測集落形成能力。

【異體動物接種】向異體動物體內(nèi)（皮下）接種細胞懸液，觀察成瘤能力。

【其它】除上述項目外，根據(jù)需要還可做同位素標記、組織化學成分分析，熒光顯微鏡觀察等。

體外培養(yǎng)腫瘤細胞生物學檢測當前第38頁\共有124頁\編于星期三\9點2.上皮細胞培養(yǎng)

上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養(yǎng)特別受到重視。體內(nèi)上皮細胞生長在膠原構(gòu)成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長。子宮內(nèi)膜上皮細胞當前第39頁\共有124頁\編于星期三\9點3.神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)神經(jīng)細胞（神經(jīng)元〕不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細胞因子時，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。

神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。當前第40頁\共有124頁\編于星期三\9點4.巨噬細胞培養(yǎng)

巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。巨噬細胞也建有無限細胞系。肺巨噬細胞吞噬大腸桿菌當前第41頁\共有124頁\編于星期三\9點TheNIH/3T3,acontinuouscelllineofhighlycontact-inhibitedcellswasestablishedfromNIHSwissmouseembryoculturesinthesamemannerastheoriginalrandombred3T3andtheinbredBALB/c3T3.NIH／3T3五、一些重要的細胞系當前第42頁\共有124頁\編于星期三\9點ThislinewasderivedfromtheCV-1cellline(ATCCCCL-70)bytransformationwithanorigindefectivemutantofSV40whichcodesforwild-typeTantigen.COS-7當前第43頁\共有124頁\編于星期三\9點TheVerocelllinewasinitiatedfromthekidneyofanormaladultAfricangreenmonkeyonMarch27,1962,byY.YasumuraandY.KawakitaattheChibaUniversityinChiba,Japan.

Verocell當前第44頁\共有124頁\編于星期三\9點EL4wasestablishedfromalymphomainducedinaC57BLmouseby9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene.

EL4淋巴瘤細胞當前第45頁\共有124頁\編于星期三\9點HL-60isapromyelocyticcelllinederivedbyS.J.Collins,etal.Peripheralbloodleukocyteswereobtainedbyleukopheresisfroma36-year-oldCaucasianfemalewithacutepromyelocyticleukemia.

HL-60當前第46頁\共有124頁\編于星期三\9點Thecellsexpress3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductaseandhepatictriglyceridelipaseactivities.HepG2當前第47頁\共有124頁\編于星期三\9點NATUREREVIEWS|CANCERVOLUME2|APRIL2002|315－319當前第48頁\共有124頁\編于星期三\9點腫瘤細胞:小鼠類EL4淋巴瘤Pcc4胚癌細胞EL4IL-2淋巴瘤P815肥大細胞瘤YAC-1淋巴瘤MFC前胃癌L1210淋巴白血病AtT20垂體瘤P388D1淋巴樣瘤NS-1骨髓瘤SRS-82腹水瘤SP2/0骨髓瘤SAC-IIB2腹水瘤P3-NS-1/1-Ag4.1骨髓瘤SAC-IIC3腹水瘤45.6.TG1.7骨髓瘤S180腹水瘤P3-X63-Ag8骨髓瘤B16黑色素瘤J774A.1單核細胞－巨噬細胞C127乳腺腫瘤RAW264.7單核細胞－巨噬細胞F9胚胎瘤NG108-15小鼠神經(jīng)細胞瘤×大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞雜交細胞當前第49頁\共有124頁\編于星期三\9點C6膠質(zhì)瘤RH－35肝癌SHZ－88乳腺癌CBRH－7919肝癌PC-12腎上腺嗜鉻細胞瘤

腫瘤細胞:大鼠類當前第50頁\共有124頁\編于星期三\9點HBL-100乳腺細胞BT-325神經(jīng)膠質(zhì)瘤SMC-1惡性胸膜間皮瘤SK-N-SH神經(jīng)母細胞瘤A549肺癌U251星形膠質(zhì)瘤A2肺癌SHG-44膠質(zhì)瘤95-D高轉(zhuǎn)移肺癌A375惡性黑色素瘤Calu-3肺腺癌（胸膜滲出液）BowesMelanoma黑色素瘤LTEP-a-2肺腺癌MM96L黑色素瘤NCI-H460大細胞肺癌6T-CEMT細胞白血病SH-77小細胞肺癌J-111單核細胞白血病NCI-H446小細胞肺癌Dami巨核細胞SPC-A-1肺腺癌CHMas肥大細胞白血病SGC-7901胃腺癌HEL紅細胞白血病(Erythroleukemia)BGC-823低分化胃腺癌HL-60原髓細胞白血病（Promyelocyticlenukemia）腫瘤細胞:人類當前第51頁\共有124頁\編于星期三\9點MKN-45低分化胃癌K562慢性髓原白血病LoVo結(jié)腸腺癌Hut-78皮膚T細胞淋巴瘤Ls-174-T結(jié)腸腺癌Hut-102皮膚T細胞淋巴瘤HCT-8回盲腸腺癌NamalwaBurkitt`s淋巴瘤HCe-8693盲腸未分化腺癌Jurknt.CloneE6-1白血病細胞HR-8348直腸腺癌THP-1單核細胞BEL-7402肝癌U937組織細胞淋巴瘤BEL-7404肝癌Raji

Burkitt's淋巴瘤BEL-7405肝癌MEG-01成巨核細胞白血病HepG2肝細胞癌

腫瘤細胞:人類當前第52頁\共有124頁\編于星期三\9點

大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞工程中重要的組成部分，是在人工條件下高密度大規(guī)模培養(yǎng)的用動、植物細胞來生產(chǎn)生物產(chǎn)品的技術(shù)。如今這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物制藥的研究和生產(chǎn)中，為生產(chǎn)疫苗、細胞因子、生物產(chǎn)品乃至人造組織等產(chǎn)品提供了強有力的工具。六、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)當前第53頁\共有124頁\編于星期三\9點大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術(shù)當前第54頁\共有124頁\編于星期三\9點旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（TheRotaryCellCultureSystem，RCCS）(1)高分化度:(2)模擬微重力:(3)三維細胞培養(yǎng):當前第55頁\共有124頁\編于星期三\9點第二節(jié)細胞融合與單克隆抗體當前第56頁\共有124頁\編于星期三\9點一、動物細胞融合1.概念兩個或兩個以上的細胞合并成一個雙核或多核細胞的現(xiàn)象稱為細胞融合，也稱細胞雜交。細胞融合技術(shù)在基因定位、基因表達產(chǎn)物、腫瘤診斷核治療、生物新品種培育及單克隆抗體技術(shù)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景。當前第57頁\共有124頁\編于星期三\9點紫外線喪失感染活性保留融合活性生物法：仙臺病毒化學法：PEG誘導物理法：電融合2.融合方法當前第58頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）生物法：仙臺病毒當前第59頁\共有124頁\編于星期三\9點生物法融合當前第60頁\共有124頁\編于星期三\9點采用助融劑聚乙二醇（PEG）和高Ca2+、高pH相結(jié)合。PEG用于細胞融合至少有兩方面的作用：可促使細胞凝結(jié)；破壞互相接觸處的細胞膜的磷脂雙分子層，從而使相互接觸的細胞膜之間發(fā)生融合，進而細胞質(zhì)溝通，形成一個打的雙核或多核融合細胞。（2）化學法：PEG誘導當前第61頁\共有124頁\編于星期三\9點（3）物理法：電融合

游離的動物細胞或原生質(zhì)體，置于電融合室中，在高頻交流電場的作用下，細胞被極化，成為偶極子，造成細胞之間相互連接，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細胞接觸點部位的質(zhì)膜，此時質(zhì)膜脂類分子發(fā)生重組，同時由于細胞表面的張力作用，使兩細胞融合逐步完成。當前第62頁\共有124頁\編于星期三\9點電融合當前第63頁\共有124頁\編于星期三\9點3.融合細胞的篩選人工誘導形成的融合細胞有兩類，一類是同核體，另一類是異核體。把異核體從同核體以及未發(fā)生融合的親本細胞中分離出來。分離方法包括非選擇性篩選和選擇性篩選。當前第64頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）非選擇性篩選

非選擇性篩選是指用機械方法把單個融合細胞挑選出來，讓其分裂增殖，培養(yǎng)出細胞克隆，也稱單細胞克隆。其缺點是融合細胞數(shù)量很少，挑選不易，而且挑選出來的細胞不一定分裂，因此有時需要挑選并分離大量的融合細胞，才能獲得幾株細胞克隆。當前第65頁\共有124頁\編于星期三\9點（2）選擇性篩選

是根據(jù)細胞對藥物的抗性、營養(yǎng)要求或溫度敏感性等的不同，選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)條件，將雜交細胞分離出來。①抗藥性篩選系統(tǒng)常用的培養(yǎng)基有HAT培養(yǎng)基。②營養(yǎng)缺陷型篩選系統(tǒng)當前第66頁\共有124頁\編于星期三\9點二、單克隆抗體技術(shù)

通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長，小鼠骨髓瘤細胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即所謂“永生”性。在HAT選擇培養(yǎng)基的作用下，只有Ｂ細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交細胞才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。當前第67頁\共有124頁\編于星期三\9點單克隆抗體

由一個識別單一抗原決定簇（表位）的B細胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。單克隆抗體的特性：（1）理化性狀高度均一。（2）抗原結(jié)合性高度特異。（3）生物活性高度單一。當前第68頁\共有124頁\編于星期三\9點表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體當前第69頁\共有124頁\編于星期三\9點雜交瘤技術(shù)

通過融合經(jīng)免疫的小鼠脾細胞和建系小鼠骨髓瘤細胞，以獲得同時具有抗體分泌功能和保持細胞永生性特征的雜交瘤細胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術(shù)途徑。當前第70頁\共有124頁\編于星期三\9點TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies"GeorgesJ.F.Koehler

FederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunology

Basel,Switzerlandb.1946d.1995

CarMilstein

ArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiology

Cambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)

d.2002當前第71頁\共有124頁\編于星期三\9點當前第72頁\共有124頁\編于星期三\9點單克隆抗體制備過程（1）致敏淋巴細胞的準備（2）骨髓瘤細胞的準備（3）細胞融合（4）選擇性培養(yǎng)（5）抗體分泌細胞的篩選（6）克隆化過程（7）單克隆抗體的制取當前第73頁\共有124頁\編于星期三\9點抗原致敏淋巴細胞骨髓瘤細胞融合選擇性培養(yǎng)抗體分泌細胞篩選克隆化單抗制取單抗純化單抗鑒定當前第74頁\共有124頁\編于星期三\9點致敏淋巴細胞的準備動物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài)抗原接種：方式——體內(nèi)、體外劑量——0.5-100g

次數(shù)——視抗原而定間隔——視抗原而定佐劑——視抗原而定收集時間：末次接種后72h當前第75頁\共有124頁\編于星期三\9點骨髓瘤細胞的準備細胞株處于良好的生長狀態(tài)細胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)當前第76頁\共有124頁\編于星期三\9點致敏淋巴細胞骨髓瘤細胞離心1000rpm10min50%PEG1ml培養(yǎng)液

10ml離心1000rpm7min37。C搖動、由慢漸快1min、靜止1.5min加入HAT培養(yǎng)液懸浮細胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi)細胞融合當前第77頁\共有124頁\編于星期三\9點隨機融合后的細胞類型細胞組合HGPRT生長狀態(tài)淋巴細胞+骨髓瘤+長期生長淋巴細胞+淋巴細胞+短期生長骨髓瘤+骨髓瘤-

不能生長未融合淋巴細胞+短期生長未融合骨髓瘤-不能生長當前第78頁\共有124頁\編于星期三\9點HAT選擇培養(yǎng)原理核苷酸從頭合成途徑（denovosynthesis）核苷酸補救合成途徑（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）當前第79頁\共有124頁\編于星期三\9點抗體分泌細胞的篩選對篩選方法的要求：

多——大量樣品一次檢測

快——迅速取得檢測結(jié)果

準——檢測結(jié)果可靠性高

靈——檢測方法靈敏度高常用篩選方法：

ELISA、RIA、CDC、IFA等當前第80頁\共有124頁\編于星期三\9點克隆化過程概念：建立單一細胞克隆方法：有限稀釋法克隆建立的標準：連續(xù)兩次以上100%陽性孔飼養(yǎng)細胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細胞當前第81頁\共有124頁\編于星期三\9點有限稀釋法計數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔當前第82頁\共有124頁\編于星期三\9點單克隆抗體的制取制取方式：體外——培養(yǎng)罐法體內(nèi)——腹腔接種純化：鹽析、層析、制備型HPLC鑒定：特征鑒定——Ig類型、親和力、效價、特異性決定簇鑒定——是否針對同一決定簇當前第83頁\共有124頁\編于星期三\9點單克隆抗體制備當前第84頁\共有124頁\編于星期三\9點第三節(jié)細胞核移植與克隆技術(shù)當前第85頁\共有124頁\編于星期三\9點一、歷史回顧1932年Spemann提出設(shè)想：分化了的細胞核移入卵子中能否指導胚胎發(fā)育？1952年Briggs和King在兩棲動物證實了Spemann提出設(shè)想1955年他們獲得了一只蝌蚪的細胞創(chuàng)造了與原版完全一樣的復制品。當前第86頁\共有124頁\編于星期三\9點二、細胞核移植

將早期胚胎、胎兒或成體動物的細胞核移植到去核的卵母細胞中，重新組成重構(gòu)胚并使之發(fā)育成成體動物的過程。當前第87頁\共有124頁\編于星期三\9點去核的方法（1）直接穿刺法。（2）盲吸法。（3）半卵法。（4）用DNA熒光染料對卵母細胞染色，然后在熒光監(jiān)視下去核。（5）功能性去核，將卵母細胞置于用熒光燃料配置的溶液中,用紫外線照射使核失去功能。

當前第88頁\共有124頁\編于星期三\9點A

顯微注射針刺入卵母細胞前B開始吸取第一極體C

極體已被吸入注射針D

去除極體后的卵母細胞E

注射供體細胞F

供體細胞已被注入透明帶下核移植的顯微操作過程AFEDCB當前第89頁\共有124頁\編于星期三\9點電融合當前第90頁\共有124頁\編于星期三\9點重構(gòu)卵激活

核移植過程中的激活就是模仿受精過程中精子的刺激作用。激活的方式有電激活、化學激活和注射精子因子激活。

當前第91頁\共有124頁\編于星期三\9點重構(gòu)胚的培養(yǎng)

重構(gòu)胚移入受體之前的培養(yǎng)方法有體外培養(yǎng)和體內(nèi)培養(yǎng)兩種方法。體外培養(yǎng)法相對要簡單方便的多。當前第92頁\共有124頁\編于星期三\9點重構(gòu)胚的遺傳學鑒定利用種屬特異性探針（人類X、Y探針）對卵裂球細胞進行熒光原位雜交。當前第93頁\共有124頁\編于星期三\9點供體細胞培養(yǎng)（MⅡ卵母細胞）減數(shù)第二次分裂中期去核的卵母細胞供體細胞注入去核卵母細胞受體細胞激活，完成減數(shù)分裂、發(fā)育胚胎移植當前第94頁\共有124頁\編于星期三\9點三、核移植分類根據(jù)核供體細胞來源的不同：（1）胚胎細胞的核移植（2）體細胞的核移植根據(jù)供體細胞與受體細胞是否來源于同一種動物：（1）同種核移植（2）異種核移植當前第95頁\共有124頁\編于星期三\9點胚胎細胞核移植技術(shù)胚胎細胞核移植(embryocelluncleartransplantation)：將一個早期胚胎的細胞核移植到去核的卵母細胞中，構(gòu)建新合子的生物技術(shù)，通常將提供細胞核的細胞稱為供體，接受細胞核的卵母細胞稱為受體。核移植所用的供體細胞均為囊胚階段以前的胚胎細胞。當時人們普遍認為，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后則隨著分化而逐漸喪失其全能性。當前第96頁\共有124頁\編于星期三\9點胚胎細胞核移植1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學的伊爾門澤、美國杰克遜實驗室，首次對小鼠卵進行核移植獲得成功。此后，胚胎細胞的核移植在多種動物上獲得了克隆后代，如綿羊(Willadsen等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),豬(Prather等,1989),山羊(張勇等,1991)等。直到1997年才由

Mengetal成功地克隆出兩只猴,這是靈長類動物的首次被克隆。

當前第97頁\共有124頁\編于星期三\9點胚胎細胞核移植存在的問題對于瀕危動物來說，由于種群數(shù)量有限，卵母細胞較難獲得；而在人類，由于倫理等原因，卵母細胞的獲得同樣困難。核供體、核受體胚胎來源困難。限制了核移植技術(shù)為人類服務(wù)的初衷。當前第98頁\共有124頁\編于星期三\9點解決辦法（1）體細胞核移植——

解決供核困難（2）異種胚胎核移植——解決核受體胚胎來源困難當前第99頁\共有124頁\編于星期三\9點問題當時人們普遍認為，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后則隨著分化而逐漸喪失其全能性。哺乳動物胚胎發(fā)育過程中，細胞發(fā)生了分化，但是在適宜環(huán)境下，已分化的細胞能否重新恢復到發(fā)育的起始狀態(tài)，再重新發(fā)育成其它類型細胞組織的多能性，甚至發(fā)育成完整個體的全能性呢？?當前第100頁\共有124頁\編于星期三\9點核重編程

核重編程的過程就是使在體細胞中被關(guān)閉，而在正常胚胎發(fā)育中表達的基因重新被激活的過程。重編程有三種可能的結(jié)果：（1）供核基因組完全沒有進行重編程，重構(gòu)胚很快死亡；（2）部分重編程，重構(gòu)胚在不同的發(fā)育階段死亡；（3）完全重編程，產(chǎn)生正常的克隆動物。當前第101頁\共有124頁\編于星期三\9點Modelofsequentialstepsinthereprogrammingofsomaticcells當前第102頁\共有124頁\編于星期三\9點當前第103頁\共有124頁\編于星期三\9點當前第104頁\共有124頁\編于星期三\9點當前第105頁\共有124頁\編于星期三\9點體細胞核移植技術(shù)(somaticcelluncleartransplantation)將分化程度較高的體細胞移植入去核的卵母細胞中構(gòu)建新合子的生物技術(shù)。

1996年，世界第一例從成年動物細胞克隆出的哺乳動物綿羊多莉誕生。這個秘密直到1997年2月才向世人公布。體細胞核移植技術(shù)——

動物克隆技術(shù)的里程碑當前第106頁\共有124頁\編于星期三\9點克隆羊“多莉”首先使用藥物促使母羊排卵，接著把未受精的卵取出，利用顯微設(shè)備從卵中吸出所有的染色體，這樣就制成了一個有活性但沒有遺傳物質(zhì)的卵空殼。下一步是再從母羊乳腺中取出一個普通組織細胞，顯微注射卵空殼融合，通過電流刺激或化學激活，形成新的胚胎，再移植到受體羊的子宮，發(fā)育成含有新的遺傳物質(zhì)的新個體。當前第107頁\共有124頁\編于星期三\9點黑面綿羊去核卵細胞白面綿羊乳腺細胞核重組細胞電脈沖刺激細胞培養(yǎng)早期胚胎另一頭母綿羊子宮克隆羊“多莉”妊娠當前第108頁\共有124頁\編于星期三\9點當前第109頁\共有124頁\編于星期三\9點1998年7月，美國夏威夷大學Wakayama等報道，由小鼠卵丘細胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，這是繼“多莉”以后的第二批哺乳動物體細胞核移植后代。此后，體細胞核移植技術(shù)在牛、山羊、豬等多種動物獲得成功。。至1999年底，全世界已有6種類型細胞——胎兒成纖維細胞、乳腺細胞、卵丘細胞、輸卵管／子宮上皮細胞、肌肉細胞和耳部皮膚細胞的體細胞克隆后代成功誕生。

體細胞核移植

當前第110頁\共有124頁\編于星期三\9點異種核移植

一種動物、人的體細胞作為核供體，另一種動物的卵母細胞為受體細胞而進行的核移植技術(shù)。2004年01月24日

07:29中國首例異體克隆動物———瀕危動物北山羊當前第111頁\共有124頁\編于星期三\9點人-兔異種體細胞核移植構(gòu)建重構(gòu)胚

MⅡ期兔卵母細胞人顆粒細胞、皮膚成纖維細胞顯微操作去除核及極體體外培養(yǎng)傳代、冷凍保存將單個體細胞注射入卵周隙

電融合激活體外培養(yǎng)

遺傳物質(zhì)鑒定當前第112頁\共有124頁\編于星期三\9點克隆來源于英語“clone”或“cloning”的音譯，起源于希臘文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插條”繁殖。曾譯為無性生殖或無性繁殖，即由同一個祖先細胞分裂而形成的純細胞系，這個細胞系每個細胞的基因彼此是相同的。隨著分子生物學的發(fā)展，通過核移植與基因工程等技術(shù)也可獲得無性系，于是人們把實現(xiàn)無性繁殖的操作稱之為克隆。四、克隆技術(shù)當前第113頁\共有124頁\編于星期三\9點動物克隆