法獲取目的基因演示文稿

法獲取目的基因演示文稿當前第1頁\共有21頁\編于星期三\6點（優(yōu)選）法獲取目的基因當前第2頁\共有21頁\編于星期三\6點PCR技術的定義及其發(fā)展歷史PCR技術的原理PCR的反應體系和條件PCR法獲取目的基因PCR技術的未來展望當前第3頁\共有21頁\編于星期三\6點PCR技術多聚酶鏈式反應

(PolymeraseChainReaction)

PCR技術即多聚酶鏈式反應，又稱聚合酶鏈式反應。是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法。

在生物學實驗中做為基礎存在，可以說是現代分子生物學研究中最重要的技術。

當前第4頁\共有21頁\編于星期三\6點一、PCR技術的創(chuàng)建1.Khorana等1971年提出在體外經DNA變性、與適當引物雜交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設想。2.1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現。3.1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術。

4.1988年，第一臺PCR儀問世。5.1989年美國《Science》雜志比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。當前第5頁\共有21頁\編于星期三\6點二、PCR技術的原理

1.PCR技術在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧核苷酸,耐熱性DNA聚合酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段的循環(huán)合成DNA，每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數放大一倍。一般樣品經過30次循環(huán),可使基因的拷貝數達到數百萬。當前第6頁\共有21頁\編于星期三\6點

PCR原理

（1）類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于寡核苷酸引物的存在

（3）重復“變性--退火--延伸”的循環(huán)，可獲得大量的新DNA鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板，從而指數級地獲得大量DNA產物，數小時內可使目的基因的數量擴增數百萬倍。（2）PCR過程：由變性—復性（退火）--延伸三個基本反應步驟構成①變性：94℃左右，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈；②復性：55℃左右，引物與模板DNA單鏈互補配對結合；③延伸：72℃左右，“模板-引物結合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，以靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成新的DNA鏈當前第7頁\共有21頁\編于星期三\6點2.PCR技術的特點1）速度快，靈敏度高：經過30輪循環(huán)，理論上目的產物的擴增量達230個拷貝（109拷貝）。2）特異性：引物的序列及其與模板結合的特異性是決定PCR反應結果的關鍵；引物設計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性，同時盡可能減少非特異性擴增。3）操作簡便易行：只需要數小時就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數個拷貝的模板序列。當前第8頁\共有21頁\編于星期三\6點三、PCR的反應體系和基本步驟H2O

35μL10×PCR反應緩沖液

5μL25mmol/LMgCl2

4μL4種dNTP

4μL上游引物（引物１）

0.5μL下游引物（引物２）

0.5μL模板DNA

(約1ng)

0.5μLTaq酶0.5μL

1.反應體系組成成分（總體積：50L）當前第9頁\共有21頁\編于星期三\6點模板DNAdNTP引物BufferMg2+預變性模板DNAdNTP引物BufferMg2+TaqDNA聚合酶94℃5min2.基本程序PCR排管當前第10頁\共有21頁\編于星期三\6點Taq酶模板DNAdNTP引物BufferMg2+

循環(huán)儀94℃55℃72℃72℃5～7min循環(huán)25～35次擴增出的目標基因當前第11頁\共有21頁\編于星期三\6點瓊脂糖凝膠電泳轉移點樣進行電泳擴增出的目的基因當前第12頁\共有21頁\編于星期三\6點3.PCR反應條件循環(huán)參數（1）預變性：94℃5min（2）變性：94℃20s-45s使雙鏈DNA解鏈為單鏈（3）退火：溫度由引物的解鏈溫度Tm決定，時間45s左右。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合；降低溫度可增加反應的靈敏性。（4）延伸：一般為72℃，時間由擴增片段長度決定。（5）循環(huán)次數：主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次次數過多，導致擴增效率降低，錯誤摻入率增加。到達平臺期所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝數。（6）延伸補齊：72℃5min—10min當前第13頁\共有21頁\編于星期三\6點PCR技術的注意事項1.合理分隔實驗室將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環(huán)擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產物的鑒定應與其他步驟嚴格分開。2.吸樣槍由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。3.試劑分裝所有的PCR試劑都應小量分裝，-20℃保存，以減少重復加樣次數，避免污染機會。另外，PCR試劑和PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存。4.防止操作人員污染一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用。當前第14頁\共有21頁\編于星期三\6點四、PCR法獲取目的基因當前第15頁\共有21頁\編于星期三\6點由TaqDNA聚合酶擴增的PCR產物中，其3’末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為TaqDNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時可以使用T載體克隆目的基因。1.T載體克隆PCR獲取的目的基因當前第16頁\共有21頁\編于星期三\6點具有3‘-5’外切酶活性的DNA聚合酶（如pfu聚合酶），其擴增的PCR產物是平末端,要對這種平末端的PCR產物進行克隆,應首先對PCR產物的3‘末端進行加A的工作。工作程序如下方案一膠回收平末端PCR產物，進入5μl10×TagDNAPolymeraseBuffer、4種dNTP或dATP（終濃度為200nM）、2.5UTagDNAPolymerase，加水至終反應體積為50μl，72℃保溫10min，純化PCR片段后進行TA克隆方案二PCR反應（50μl反應體積）結束以后，加入1μl20mMdATP和2.5U的Tag酶，72℃保溫10min，然后進行直接進行TA克隆當前第17頁\共有21頁\編于星期三\6點2.設計酶切位點克隆PCR獲取的目的基因3’5’限制性內切酶的識別序列目的基因的PCR片段3’5’限制性內切酶的識別序列經限制酶切割得到的具有粘性末端的線性載體經限制酶切割得到粘性末端體外連接獲得目的基因的克隆當前第18頁\共有21頁\編于星期三\6點1、不對稱PCR2、反向PCR(reversePCR)3、多重PCR（復合PCR）4、LP-PCR（Labelledprimers)5、錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）6、PCR固相分析法7、原位PCR8、反轉錄PCR（RT-PCR)9、

熒光定量PCR（real-timePCR)

五、PCR的類型當前第19頁\共有21頁\編于星期三\6點熒光定位PCR技術（FQ-PCR）FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5′→3′外切酶活性，在PCR反應系統中加入一個熒光標記的探針。該探針可與引物包含序列內的DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5′端標以熒光報告基團，靠近3′端標以熒光淬滅基團，兩者之間構成能量傳遞結構。當PCR反應每復制一個特異核酸片段，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物是一對一的關系，因此用熒光檢測技術檢測出的熒光信號有無或強弱，即代表擴增產物有無或多少。由于熒光信號是代表擴增產物的有效特異信號,實現了儀器實時檢測，為新的PCR定量原理創(chuàng)造了條件。當前第20頁\共有21頁\編于星期三\6點PCR技術的應用舉例：研究：基因克隆；DNA測序；分析突變；基因重組與融合；鑒定與調控蛋白質結合DNA序列；轉座子插入位點的繪圖；檢測基因的修飾；人類基因組工程：用散布重復序列產生DNA標志