原輔料藥的含量測(cè)定技術(shù)-生物檢定定量技術(shù)（獸藥檢測(cè)技術(shù)）

生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測(cè)技術(shù)抗生素藥物在低微濃度下即可對(duì)某些生物的生命活動(dòng)有特異抑制作用，與化學(xué)藥物相比，具有化學(xué)純度較低、活性組分易發(fā)生變異、穩(wěn)定性差等特點(diǎn)。微生物檢定法是在適宜的條件下，通過(guò)檢測(cè)抗生素藥物對(duì)微生物的抑制作用，計(jì)算抗生素效價(jià)的方法。該方法的測(cè)定原理能直接表示抗生素對(duì)微生物的作用，是其他物理學(xué)方法或化學(xué)方法所不能達(dá)到的，目前各國(guó)藥典仍多數(shù)采用這一方法。依據(jù)設(shè)計(jì)原理不同，可分為稀釋法、濁度法和瓊脂擴(kuò)散法。后二者被列為抗生素微生物檢定的國(guó)際通用方法。《中國(guó)獸藥典》首選方法是管碟法。一、生物檢定法概述二、管碟法獸藥檢測(cè)技術(shù)當(dāng)抗生素在菌層培養(yǎng)基中擴(kuò)散時(shí)，會(huì)形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴(kuò)散的中心濃度高而邊緣濃度低。在抗生素濃度高于MIC（最低抑制濃度）時(shí)，試驗(yàn)菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的抑菌圈?？股卦谝欢舛确秶鷥?nèi)，對(duì)數(shù)劑量與抑菌圈直徑（或面積）呈線性關(guān)系。

1.原理生物檢定定量技術(shù)二、管碟法獸藥檢測(cè)技術(shù)將未知效價(jià)供試液與已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)液，在同一條件下，抗生素在培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散到達(dá)適當(dāng)范圍內(nèi)產(chǎn)生了抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的透明抑菌圈，經(jīng)比較供試液和標(biāo)準(zhǔn)液兩者產(chǎn)生的抑菌圈直徑（面積）的大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)。2.方法生物檢定定量技術(shù)二、管碟法獸藥檢測(cè)技術(shù)二劑量法是最常用的一種方法，系將供試品和標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成高低兩個(gè)濃度，高低濃度的比值（稱為劑距）為2︰1或4︰1，在每個(gè)雙碟內(nèi)放置4個(gè)小鋼管，對(duì)角的兩個(gè)小鋼管內(nèi)分別滴裝高濃度和低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余兩個(gè)小鋼管分別滴裝高濃度和低濃度的供試品溶液，在規(guī)定條件下培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)定比較。2.方法生物檢定定量技術(shù)

供試品效價(jià)相當(dāng)于標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)的百分?jǐn)?shù)為：

P為供試品效價(jià)（相當(dāng)于標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)的百分?jǐn)?shù)）；S2為高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致抑菌圈直徑（或面積）總和；S1為低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致抑菌圈直徑（或面積）總和；T2為高濃度供試品溶液所致抑菌圈直徑（或面積）總和；T1為低濃度供試品溶液所致抑菌圈直徑（或面積）總和；I為高濃度與低濃度比值的對(duì)數(shù)值（即劑距的對(duì)數(shù)值）。獸藥檢測(cè)技術(shù)生物檢定定量技術(shù)將此百分?jǐn)?shù)乘以供試品估計(jì)的效價(jià)數(shù)，即得供試品每1mg中所含的單位數(shù)（U/mg）。供試品的效價(jià)數(shù)（Pr）＝估計(jì)效價(jià)數(shù)（Ar）×P本法計(jì)算所得效價(jià)，如低于估計(jì)效價(jià)的90％或高于估計(jì)效價(jià)的110％時(shí)，則應(yīng)調(diào)整其估計(jì)效價(jià)，予以重試。獸藥檢測(cè)技術(shù)生物檢定定量技術(shù)（1）稱量（2）稀釋（3）雙碟的制備①培養(yǎng)基底層的制備②培養(yǎng)基菌層的制備（4）放置小鋼管（5）滴加抗生素溶液

（6）培養(yǎng)（7）抑菌圈測(cè)量（8）記錄與數(shù)據(jù)處理（9）結(jié)果判定制備雙碟檢定步驟配制抗生素溶液

生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測(cè)技術(shù)（1）稱量

☆標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量均為一次取樣稱取。生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測(cè)技術(shù)二、管碟法3.二劑量法步驟生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測(cè)技術(shù)（2）稀釋☆采用容量瓶☆取樣量不得少于2ml

☆稀釋步驟一般不超過(guò)3步

☆從“0”刻度開(kāi)始放溶液。

☆標(biāo)準(zhǔn)品溶液取出須至室溫后方可稀釋☆劑距為2∶1或4∶1。

☆平行原則生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測(cè)技術(shù)☆培養(yǎng)基均勻攤布

（3）雙碟的制備☆臺(tái)面必須水平

生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測(cè)技術(shù)☆平穩(wěn)落在培養(yǎng)基上（4）放置小鋼管☆小鋼管經(jīng)干熱滅菌生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測(cè)技術(shù)☆滴加溶液的順序?yàn)镾H→TH→SL→TL。（5）滴加抗生素溶液☆成對(duì)角滴加標(biāo)準(zhǔn)品（S）及供試品（T）高（H）、低（L）兩種濃度的溶液。生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測(cè)技術(shù)（6）培養(yǎng)生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測(cè)技術(shù)（7）抑菌圈測(cè)量

游標(biāo)卡尺或抑菌圈測(cè)量?jī)x生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測(cè)技術(shù)（8）記錄、數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判斷

包括試驗(yàn)日期、稱量時(shí)天平室溫度、相對(duì)濕度，供試品的估計(jì)效價(jià)、標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量、最終稀釋濃度、稀釋步驟，試驗(yàn)菌名、菌液濃度，培養(yǎng)基、緩沖液，抑菌圈測(cè)量結(jié)果、可信限率。雙碟的制備

為硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，內(nèi)徑約90mm，高16～17mm，底面應(yīng)水平且厚薄均勻，無(wú)氣泡。檢查方法可將雙碟放在水平臺(tái)上，下墊一張白紙，碟內(nèi)加水2-3mL,再滴加藍(lán)墨水，觀察顏色深淺是否一致。獸藥檢測(cè)技術(shù)挑選雙碟雙碟的制備

用過(guò)的雙碟經(jīng)高壓滅菌倒出培養(yǎng)基后，置玻璃儀器中，用專用洗液或其它清洗液浸泡，再?zèng)_洗、晾干，裝在不銹鋼筒內(nèi)，置150-160℃干熱滅菌2h或高壓121℃蒸氣滅菌30min，備用。獸藥檢測(cè)技術(shù)雙碟的準(zhǔn)備雙碟的制備①底層

用滅菌大口吸管或其他滅菌分裝器，吸取已融化的培養(yǎng)基20mL，注入每個(gè)雙碟內(nèi)均勻攤布，用陶瓦蓋覆蓋，待其凝固。冬季室溫較低時(shí)，倒好的底層雙碟可先放入35-37℃培養(yǎng)箱內(nèi)保溫，使易于攤布菌層。獸藥檢測(cè)技術(shù)雙碟的制備雙碟的制備②菌層

取出試驗(yàn)用菌懸液，按已預(yù)試驗(yàn)的菌量（二劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18-22mm），用滅菌吸管吸取菌懸液加入已融化并保溫在水浴中（一般細(xì)菌48-50℃，芽孢可至60℃）的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻，作為菌層用。用滅菌大口10mL吸管或其它分裝器，吸取菌層培養(yǎng)基5mL，使均勻攤布在底層培養(yǎng)基上，置水平臺(tái)上，用陶瓦蓋覆蓋，放置20-30min，待凝固備用。獸藥檢測(cè)技術(shù)雙碟的制備小鋼管的放置和滴碟

不銹鋼制，外徑（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1mm，內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，每套鋼管重量差異不超過(guò)±0.5g。小鋼管內(nèi)外壁和兩端要求光滑平坦，管壁厚薄均勻一致。洗凈后晾干，裝在帶蓋的容器內(nèi)，150～160℃干熱滅菌2h備用。獸藥檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)備小鋼管小鋼管的放置和滴碟

將4孔鋼管放置器置于無(wú)菌室內(nèi)，鋼管下落時(shí)應(yīng)垂直平穩(wěn)、位置正確。應(yīng)保持清潔，防止抗生素污染?？啥ㄆ谟?5%乙醇棉擦拭，并用乙醇棉火焰燒小孔。獸藥檢測(cè)技術(shù)鋼管放置器小鋼管的放置和滴碟①每批供試品二劑量法取6個(gè)以上雙碟，滴注小鋼管用的毛細(xì)管或定量加樣器須用被滴注的溶液洗2～3次。②每份滴加的溶液為1個(gè)單位，但雙碟數(shù)每次不超過(guò)5個(gè)，如1份溶液滴加雙碟數(shù)目多，可分組滴加。每種溶液各用1支毛細(xì)滴管。③每個(gè)小鋼管應(yīng)加至管口平滿，每個(gè)小鋼管的裝量應(yīng)一致。④滴注溶液的次序，最好以一個(gè)批號(hào)為單位安排，并且標(biāo)準(zhǔn)液與供試品液應(yīng)輪換滴注。二劑量法中，在雙碟的4個(gè)鋼管中分別成對(duì)角滴加標(biāo)準(zhǔn)品（S）及供試品（T）高（H）、低（L）兩種濃度的溶液。滴加溶液的順序?yàn)镾H→TH→SL→TL。⑤滴注完畢后，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，置托盤內(nèi)，雙碟疊放不可超過(guò)3個(gè)，避免受熱不均，影響抑菌圈大小，以水平位置平穩(wěn)搬入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。獸藥檢測(cè)技術(shù)滴碟小鋼管的放置和滴碟

將已干熱滅菌的小鋼管倒入鋼管放置器的玻璃容器內(nèi)，或?qū)⒀b好小鋼管的已干熱滅菌的鋼管放入鋼管自動(dòng)放置器中，將雙碟打開(kāi)，放入雙碟臺(tái)上，托起雙碟臺(tái)，使鋼管平穩(wěn)落在培養(yǎng)基上。各個(gè)鋼管下落的高度基本一致，鋼管放好后，應(yīng)使雙碟靜置5~10min，使鋼管在瓊脂內(nèi)下沉穩(wěn)定后，再開(kāi)始滴加抗生素溶液。獸藥檢測(cè)技術(shù)放置小鋼管抑菌圈直徑測(cè)量

抑菌圈測(cè)量?jī)x或游標(biāo)卡尺

必須按檢驗(yàn)規(guī)程檢驗(yàn)合格。游標(biāo)卡尺的精