分子診斷技術的臨床應用課件

（優(yōu)選）分子診斷技術的臨床應用課件當前第1頁\共有32頁\編于星期三\0點

狹義的分子診斷是基于核酸的診斷技術，是通過對DNA或RNA的檢測來實現(xiàn)對疾病的檢測和診斷。但是，隨著第一張人類基因組測序圖的完成，以及由此而帶來的基因組學、蛋白組學、代謝物組學等新興學科的發(fā)展，分子診斷的內涵已經(jīng)從單純的DNA/RNA拷貝、突變等變化的檢測，拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測，并廣泛應用于疾病的篩查、診斷、治療監(jiān)測、預后與預防等生命科學的各個領域。一、分子診斷的概念當前第2頁\共有32頁\編于星期三\0點根據(jù)分子診斷技術特征劃分為三類：一、基于分子雜交為基礎的分子診斷技術兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補的原則下形成異質雙鏈是遺傳物質最重要的化學特征，這一過程亦被稱為分子雜交。分子雜交是所有分子生物學技術的基礎，從最初的印跡雜交到聚合酶鏈反應（PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術，都離不開堿基互補的分子雜交反應。當前第3頁\共有32頁\編于星期三\0點二、基于測序技術為基礎的分子診斷技術DNA的序列分析是分子診斷學的金標準，各種遺傳疾病，病毒或細菌的感染與變異，在基因表達水平上的個性化用藥，多基因疾病的診斷與預測，最終都可以借助基因測序平臺的應用。當前第4頁\共有32頁\編于星期三\0點三、基于擴增技術為基礎的分子診斷技術1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應（Polymerasechainreaction，PCR），使體外擴增DNA成為可能，開啟了體外擴增和操作DNA或RNA技術的發(fā)展。到現(xiàn)在，擴增DNA的技術已經(jīng)成為分子診斷應用最廣的技術之一，并發(fā)展變化了數(shù)十種核酸擴增檢測技術。當前第5頁\共有32頁\編于星期三\0點二、PCR概述（一）PCR概念PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項體外核酸擴增技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。當前第6頁\共有32頁\編于星期三\0點

PCR技術能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。二、PCR概述當前第7頁\共有32頁\編于星期三\0點九十年代中期PCR臨床應用在國內全面展開1998年熒光定量PCR技術開始在中國應用于臨床檢測PCR發(fā)展簡史1983

Mullis于12月16日成功發(fā)明了PCR1985關于PCR的文章首次由Mullis及其同事等人在《Science》雜志上發(fā)表198912月《Science》雜志將PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名為第一個“年度分子”。199310月13日Mullis獲諾貝爾化學獎

1995熒光定量PCR技術出現(xiàn)當前第8頁\共有32頁\編于星期三\0點PCR技術PCR核心技術是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴增反應不需要每一個循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實現(xiàn)了自動化，使應用領域迅速擴大，PCR技術成為了分子生物學中的一項突破性技術。當前第9頁\共有32頁\編于星期三\0點PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇當前第10頁\共有32頁\編于星期三\0點二、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性

退火

延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關系當前第11頁\共有32頁\編于星期三\0點高靈敏度高特異性簡便快捷高效擴增、忠實復制！PCR反應的特點當前第12頁\共有32頁\編于星期三\0點三、熒光定量PCR技術的臨床應用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測性病相關病原體（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因檢測優(yōu)生優(yōu)育項目診斷：人巨細胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒（HSV）、弓形蟲（TOX）、風疹病毒（RUB）其它病原體檢測：結核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等一病原體檢測當前第13頁\共有32頁\編于星期三\0點常規(guī)結核病實驗室診斷方法及不足1.痰涂片作抗酸染色：陽性率低、費時2.細胞培養(yǎng)“金標準”：周期太長(4-8W)3.血清學診斷：

a.接種BCG可出現(xiàn)陽性

b.不能區(qū)分活動性結核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人

c.交叉反應，假陽性不能早期診斷！容易漏診、誤診！當前第14頁\共有32頁\編于星期三\0點熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義1.能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA，靈敏度高，特異性強2.早期、快速、準確地診斷結核病。痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結核血液——播散性結核和各臟器的結核病腦脊液——中樞神經(jīng)系統(tǒng)結核病宮頸拭子、尿道拭子——泌尿生殖道結核病當前第15頁\共有32頁\編于星期三\0點3.熒光定量PCR檢出結核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。

4.TB-DNA濃度可用于判斷療效：痰標本中結核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義當前第16頁\共有32頁\編于星期三\0點二腫瘤相關基因表達的檢測：1、包括癌基因、抗癌基因2、腫瘤轉移基因3、轉移抑制基因三、熒光定量PCR技術的臨床應用當前第17頁\共有32頁\編于星期三\0點三遺傳病1、等位基因檢測2、多基因遺傳病的突變檢測3、基因表達異常所致遺傳病檢測三、熒光定量PCR技術的臨床應用當前第18頁\共有32頁\編于星期三\0點四其它應用1.法醫(yī)學鑒定2.抗病毒藥物療效的觀察、指導3.縮短診斷的窗口期三、熒光定量PCR技術的臨床應用當前第19頁\共有32頁\編于星期三\0點窗口期：所謂“窗口期”,是指從感染病原體開始,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原體存在為止的這一段時間。美國90％以上輸血傳播HIV和HBV以及75％以上輸血HCV的危險性均來自“窗口期”感染獻血。當前第20頁\共有32頁\編于星期三\0點

提供直接證據(jù)縮短“窗口期”PCR檢測的臨床意義項目ELISA窗口期項目NAT窗口期HBsAg50HBV20-25抗-HCV70HCV10-14抗-HIV15HIV10當前第21頁\共有32頁\編于星期三\0點RNA+Ab-P24+Ab-血清陽轉后的方法RNAp24Ab血清陽轉抗體檢測臨界值

特異性抗體比例時間反應指標感染

血清陽轉前的方法怎樣檢測HIV早期感染?當前第22頁\共有32頁\編于星期三\0點

嬰幼兒感染HIV診斷：12月內核酸檢測，13-17月先抗體，陽性者檢測核酸，18個月以上抗體檢測當前第23頁\共有32頁\編于星期三\0點四、PCR檢測的標本采集要求

項目標本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉數(shù)圈取出分泌物（應略帶粘膜），前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內，停5秒后旋動棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV當前第24頁\共有32頁\編于星期三\0點項目標本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標本。2.也可取抗凝血標本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標本或咽拭子。也可取抗凝血標本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標本：留于無菌試管。3.也可取抗凝血標本,但需分離單個核細胞檢測，陽性率才會高。（于發(fā)熱時抽?。㎝P

咽拭子當前第25頁\共有32頁\編于星期三\0點五、NAT（核酸檢測）技術類型：當前第26頁\共有32頁\編于星期三\0點實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術（SAT）實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術（SAT）是將核酸恒溫擴增和實時熒光檢測相結合的一種新型核酸檢測技術。國內公司（上海仁度生物科技有限公司）自主研發(fā)，擁有一整套自主知識產(chǎn)權和核心技術。當前第27頁\共有32頁\編于星期三\0點（SAT）技術原理：

同一溫度下（42℃），以RNA為起始模板，通過M-MLV反轉錄酶產(chǎn)生一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個（100～1000個）RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環(huán)情況。當前第28頁\共有32頁\編于星期三\0點SAT檢測技術的優(yōu)勢：檢測靶標：RNA靈敏度高，特異性強，易鑒別死菌、活菌，適合臨床判愈;擴增產(chǎn)物：RNA高效擴增，低污染;核酸提?。捍胖榉ㄌ崛〖兌雀呓Y果準確;檢測方法：實時熒光檢測，擴增、檢測同時進行全程監(jiān)控;擴增方式：42℃恒溫無需熱循環(huán)，設備成本低。當前第29頁\共有32頁\編于星期三\0點總結

分子診斷技術經(jīng)歷近30年的快速發(fā)展，已經(jīng)形成了主要以雜交、測序和擴增三種反應模式為主的測試技術群，并且在臨床診斷中獲得了廣泛的應用。原位雜交為主的技術對于檢測基因表達異常的遺傳性疾病具有明顯的優(yōu)勢，已成為細胞遺傳學實驗室最有力的檢測工具之一。而全基因組測序技術的快速發(fā)展，使得高通量的測序方式來檢測全基因的表達差異或突變檢測的成本均大大降低，而且測試速度將逐漸適合臨床的需求，因此對于大量基因的表達和突變檢測，高通量測序技術的優(yōu)勢將會越趨明顯。另一方面，RT-PCR、STA等PCR技術對于感染性疾病、低突變位點或變異的檢測，在成本上明顯優(yōu)于前兩者，因此PCR技術可能在臨床上擁有更好的應用空間。不同的技術平臺有各自的優(yōu)缺點，我們要針對不同的實驗標本對象及需求,選擇適合的技術方法，力求在“高效,高質量,低成本”這三者間找到合適的平