q-pcr結(jié)果分析報告

有用標準文檔有用標準文檔摘要：PCR線計算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標轉(zhuǎn)錄本之間的表2CT方法是實時定量PCR試驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。本文介紹了該方法的推導(dǎo)，假設(shè)及其應(yīng)用。另外，在本文中我們還介紹了兩種2CT衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們在實時定量PCR數(shù)據(jù)分析中可能會被用到。關(guān)鍵詞：PCRPCRPCRTaqman反轉(zhuǎn)錄PCR〔RT-PCR〕是基因表達定量格外有用的一種方法〔1-3〕。實時PCRRT-PCR的結(jié)合產(chǎn)生了反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)〔4,5〕PCR的數(shù)據(jù)分析方法有兩種：確定定量和相對定量。確定定量一般通過定量標準曲線來確定我們所感興趣的轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)；相對定量方法則是用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標轉(zhuǎn)錄本之間的表達差異或是目標轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達差異。確定定量通常在需要確定轉(zhuǎn)錄本確定拷貝數(shù)的條件下使用。通過實時PCR進展確定定量已有多篇報道〔6-9〕，包括已發(fā)表的兩篇爭論論文〔10,11〕。在有些狀況下，并不需要對轉(zhuǎn)錄本進展確定定量，只需要給出相對基因表達差異即可。明顯，我們說X基因在經(jīng)過某種處理後表達量增加2.5倍比說1000拷貝/2500拷貝/細胞更加直觀。PCR對基因表達進展相對定量分析需要特別的公式、假設(shè)以及對這些假設(shè)的驗證。2CTPCR試驗來計算基因表達的相對變化：2CT公式的推導(dǎo)，以及試驗設(shè)計，有效性評估AppliedBiosystemsUserBulletinNo.〔P/N4303859〕2CT方法分析基因表達數(shù)據(jù)在文獻中也有報道5,6〕2CT兩種PCR數(shù)據(jù)分析中都可能被用到。－△△CT方法C方法的推導(dǎo)PCR指數(shù)擴增的公式是：這里，Xn是第n個循環(huán)後目標分子數(shù)，X0是初始目標分子數(shù)，Ex是目標分子擴增效率，n是循環(huán)數(shù)，CT代表目標擴增產(chǎn)物到達設(shè)定閾值所經(jīng)受的循環(huán)數(shù)。因此：XT是目標分子到達設(shè)定的閾值時的分子數(shù)。C個常數(shù)。

T,X是目標分子擴增到達閾值時的循環(huán)數(shù)。Kx是一對于內(nèi)參反響而言，也有同樣的公式：XTRT得到：對于使用TaqmanXT和RT的值由一系列因素打算：包括探針所帶的熒光K1。假設(shè)目標序列與內(nèi)參序列擴增效率一樣：或：XN代表經(jīng)過均一化處理過的初始目標分子量；△CT表示目標基因和內(nèi)標基因CT值的差異〔CT,X－CT,R〕整理上式得：qXN除以參照因子〔calibrator,cb〕的XN得到：在這里150bp的擴增片斷而言，假設(shè)Mg2+濃度、引物都進展了適當?shù)膬?yōu)化，擴增效率接近1。因此目標序列的量通過內(nèi)均一化處理之后相對于參照因子而言就是C方法的假設(shè)和應(yīng)用要使△△CT計算方法有效，目標序列和內(nèi)參序列的擴增效率必需相等?？磧蓚€反響是否具有一樣的擴增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋後擴增產(chǎn)物△CT如何變化。1顯示的是cDNA樣品在100GAPDHc-myc特異的熒光探針及引物進展擴增。計算出c-myc和GAPDHCT值以及△CT值，通過cDNAlog值對△CT0，說明目標基因和內(nèi)標基因的擴增效率一樣，就可以通過△△CT10.047，因而假設(shè)成立，△△CT相對定量；或者也可以重設(shè)計引物，優(yōu)化反響條件使得目標序列和內(nèi)參序列具有一樣的擴增效率。C內(nèi)標和參照因子的選擇RNA可被用作內(nèi)標基因。適合于實時PCRGAPDH，β-actin，β2-microglobulin以及rRNA。固然，其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標。我們推舉在應(yīng)用某一基因作為內(nèi)標之前首先確證該基因2.2局部有描述。2CT方法中參照因子的選擇打算于基因表達定量試驗的類型。最簡潔的設(shè)計就是把未經(jīng)處理的樣品作為參照因子〔calibrator〕。經(jīng)內(nèi)標基因均一化處理後，通過方法計算，目標基因表達差異通過經(jīng)過處理的樣本相對于未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來表示。對于未經(jīng)處理的參照樣，△△CT=020=1。所以依據(jù)定12CT0時刻的樣本作為參照因子。有些狀況下，并不是比較不同處理樣本基因表達差異。例如，有的是想看某一器官中特定mRNA的表達。在這種狀況下，參照因子可能是另一器官中該mRNA1顯示了大腦和腎臟總RNAc-mycGAPDH轉(zhuǎn)錄本的CT值。在這一個例子中，大腦被人為的選擇為參照因子，通過計算得到c-mycGAPDH校正後相對于大腦的表達量的結(jié)果。盡管相對定量方法可用于這種組織之在任何特定的組織中都存在。C方法的數(shù)據(jù)分析PCRCTMicrosoftExcelβ-actin均一化處理，我們對fos-glo-myc8h3個重復(fù)樣本，cDNA合成之後都做定量PCR9，即：Timex表示任意時間點，Time0表示經(jīng)β-actin1倍量的目標基因表達。T0時刻目標基因和內(nèi)標基因的平均C〔28欄〕被用于公式99計算出每一β-actin0時刻的倍數(shù)〔29欄〕。SD，CV通過檢測在01可以很便利的驗證三個重復(fù)樣品之間是否有錯誤或者誤差。假設(shè)1偏差很大，則說明存在計算錯誤或者是很高的試驗誤差。T在前面的例子中，在每一時間點上分別取了三個獨立的RNA樣本進展了分析。因此對每一個樣本分別處理，通過計算後取結(jié)果的平均值就格外重要。假設(shè)是同一樣本進展PCR擴增的重復(fù)，這就需要首CT，然後再進展計算。怎么樣計算平均值就要看目標基因和內(nèi)參基因是在同一個管子中擴增還是在不同的管子中擴增。表1給出了目標基因〔c-myc〕和內(nèi)參基因〔GAPDH〕在不同管中擴增的試驗數(shù)據(jù)。在這里不應(yīng)當把任一單個的試驗數(shù)據(jù)。在這里不應(yīng)當把任一單個的c-myc管子和GAPDH管子作比較，而應(yīng)當分別計算出c-myc相對量的變化。但其中的一個難點是CT值與相應(yīng)的拷貝數(shù)成指數(shù)關(guān)系〔4相對量的變化。但其中的一個難點是CT值與相應(yīng)的拷貝數(shù)成指數(shù)關(guān)系〔4局部〕，因此，在最後的和GAPDHCT來計算△CT計算中，的誤差通過△△計算中，的誤差通過△△CT加上標準偏差和△△CT減去標準偏差來評估，這就使得求得的數(shù)值相對于平均值呈不對稱分布。不對稱分布是由于結(jié)果經(jīng)指數(shù)處理後轉(zhuǎn)化成量的線性比較造成的。均值呈不對稱分布。不對稱分布是由于結(jié)果經(jīng)指數(shù)處理後轉(zhuǎn)化成量的線性比較造成的。2給出了目標基因〔c-myc〕和內(nèi)標基因〔GAPDH〕在同一管中擴增的試驗數(shù)據(jù)。對于任意一個管子，目標基因〔c-myc〕和內(nèi)參基因〔GAPDH〕cDNA量都是一樣多的，所以可以分別對每個管子計算△CT化為線性差異。12中，估量誤差在從△CT到△△CT的計算中未見有增加，這是由于我們把參照基因和檢測基因的誤差都顯示出來了。我們把△CT，cb當作一個人為設(shè)定的常數(shù)來減去，得到△△CT。這樣得到的結(jié)果就與圖2所顯示的在求平均之前對不同重復(fù)樣本分別通過各自的CT值求實所得結(jié)果相當。另一種方法是將參照基因當作沒有任何誤差的1倍的量，在這種狀況下，平均△CT,cb的誤差值被引入到每一樣本的△△CT1中，腎臟中△△CT變成-2.50±0.20而經(jīng)過校正的c-myc5.6倍，4.9到5.61倍。－△Cf方法－△Cf方法的推導(dǎo)RNA可以對參與RNA的量的差異進展校正。2CT方法的數(shù)據(jù)分析的一個特點就是能PCR試驗的一局部數(shù)據(jù)來完成這種校正。在其它的方法不能定量初始RNA量的時候：例如，在能得到的RNA量格外有限的時候或者需要處理高通量的樣品的時候，這一方法的優(yōu)勢就格外明顯。固然PCRcDNARNARNAcDNAPCR一個應(yīng)用例子就是爭論某種試驗處理是否影響內(nèi)標基因的表達。在這里，目標基因和內(nèi)標合二為一。在這個例子中，公式[2]不被公式[3]除，公式[5]變成：整理得：X0,qX0,cb得：T在這里△C”T=CT,q-CT,cb。△C’T與前面計算中用的△C〔用目標基因CT值減去參照基因CT值〕相互區(qū)分。T1.11，內(nèi)標相對于參照因子為：－△Cf方法的應(yīng)用2－△CT血清饑餓/誘導(dǎo)試驗〔7〕/mRNA降解的常用方法〔8〕。然而，血清可能影響一些基因的表達包括標準的看家基因的表達。24-hNIH3T315%Poly(A)+RNA，并將之反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用SYBRGreen通過實時定量PCRGAPDH，β2-microglobulincDNAGAPDH2-microglobulin2CT”公式求得。細胞處理對于GAPDHβ2-microglobulinβ2-microglobulin很適合做血清刺激定量試驗的內(nèi)標，而GAPDH并不適合。這一例子向大家呈現(xiàn)了在只爭論一個基因的時候怎么用△CT”3.PCR數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析PCRCT。CT值來表示結(jié)果。正如我們在前文中所描述的一樣，PCR相對量通常和內(nèi)標CT一點，我們用SYBRGreenreal-timePCR來檢測一樣cDNA96個重復(fù)反響。全部反響組分在同一管中混好後分裝到96個管中，做實時PCR分析，得到了每一個樣本的CT值。為了比較樣品間96個樣本的平均±SD，假設(shè)通過原始CT值計算，平均±SD20.00±0.193，CV0.97T1%CT

2-CT轉(zhuǎn)化成線性形式，平均±SD9.08×10-7

±1.33×10-7，CV為T13.5%。從這個簡潔的例子我們可以看出，通過原始C值來反映變化是錯誤的，應(yīng)當避開。用2－CT將單T個數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式來說明重復(fù)樣本之間的變化和差異更準確牢靠。4.結(jié)論PCRPCR試驗分析基因表達的時候首先要問的一個問題就是