菌種對孔雀綠染料的降解實驗課件

菌種對孔雀綠染料的降解實驗前言印染工業(yè)是世界上最大的工業(yè)之一,它包括紡織業(yè)、皮革、化妝品、紙業(yè)、印刷業(yè)、塑料制造、制藥和快餐業(yè)等,同時它也是世界上最大的污染源之一。如果染料廢水被排到河水中會對水生生物的肝臟、鰓、腎臟、腸、生殖腺、腺垂體細胞產(chǎn)生有害的影響。因此,染料的降解已經(jīng)被認為是紡織業(yè)廢水處理的一個非常重要的問題。各種各樣的物理或化學方法已經(jīng)被用于染料廢水的處理,如吸附、離子交換、凝聚、膜過濾、臭氧法等。用物理化學方法除去孔雀石綠相對來說過程復雜、耗時且效率不高。而生物方法因其是一種環(huán)境友好型的處理方式,日益受到人們的關注?？兹妇G(MalachiteGreen,MG)是一種已經(jīng)被廣泛應用于工業(yè)的三苯甲烷類染料,它影響人類的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng),是一種具有致癌性的有毒物質。另外,直接接觸孔雀石綠會刺激皮膚、損傷眼睛?？兹甘G已經(jīng)被美國食品與藥物管理局提名為首要的致癌化學物質，并且已經(jīng)被一些國家和美國食品與藥物管理局禁止使用。本實驗從活性污泥和土壤中篩選出分離染料的高效菌，對其進行分離、純化和馴化后以孔雀綠染料作為底物進行降解實驗，觀察不同菌種對孔雀綠的脫色效果，最終確定高效脫色菌種。01PART01PART02PART03實驗設計方案與思路實驗方法結果與討論PART03實驗結論1231實驗設計方案與思路1.1孔雀綠的標準曲線制定1.2活性污泥和土壤中菌種的分離純化1.3單菌種的擴大培養(yǎng)1.4不同單菌種對染料的降解實驗1.5對菌種進行初步鑒定1232實驗方法2.1孔雀綠的標準曲線制定配制濃度為216mg/L的孔雀綠標準溶液，在8支50ml容量瓶中各加入該標準溶液0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL、4.00mL和5.00mL，用水稀釋至刻度、搖勻。在紫外分光光度計上于波長617nm處，以水為參比，測定吸光度值。利用所測得的標準系列的吸光度值對濃度作圖，繪制標準曲線。1232.2活性污泥、土壤和底泥中菌種的分離純化2.2.1培養(yǎng)基制備、滅菌（1）實驗用具滅菌：將實驗需要用到的培養(yǎng)皿清洗干凈后用報紙包裝好放入滅菌鍋滅菌。（2）培養(yǎng)基配方：牛肉膏3g，NaCl5g，蛋白胨10g，瓊脂15~20g，淀粉2g，蒸餾水1000mL，pH：7.4~7.8。滅菌條件：0.103MPa（121℃,15~20min）（3）按照配方將培養(yǎng)基溶液煮好后倒入干凈的大錐形瓶中，塞上棉塞，用報紙包裝好錐形瓶口后放入滅菌鍋滅菌。（4）滅菌結束并冷卻后在無菌操作臺中將培養(yǎng)基溶液倒入6個培養(yǎng)皿中，倒入的培養(yǎng)基溶液應不超過培養(yǎng)皿的1/2，待培養(yǎng)基凝固后即成平板，最后將制好的平板放到37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天。2實驗方法1232.2.2活性污泥中菌種的分離純化活性污泥中菌種的分離純化采用平板劃線法。在無菌操作臺中，將平板倒置于酒精燈旁,左手拿出皿底并盡量使平板垂直于桌面，有培養(yǎng)基一面向著酒精燈(這時皿蓋朝上，仍留在酒精燈旁)，右手拿接種環(huán)在酒精燈上燒紅之后再挑取一環(huán)活性污泥伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，先在平板上輕輕劃一折線（切勿劃破培養(yǎng)基），轉動培養(yǎng)皿，并將接種環(huán)上殘菌燒掉，冷卻后使接種環(huán)從第一次畫的折線的末端開始做第二次折線劃線，同法做第三、第四次劃線。劃線完畢（如上圖）蓋好皿蓋，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天后觀察結果。（實驗將三個平板用于活性污泥菌種的分離純化，做好標簽）2實驗方法1232.2.3土壤中菌種的分離純化擔心土壤中的菌太少，用平板劃線法可能導致接種到的菌太少不明顯，于是采用平板表面涂布法來對土壤中的菌種進行分離純化。（1）將采來的樣本土壤在燒杯中加水充分攪拌溶解成土壤溶液。（2）涂布：在無菌操作臺中，將三角刮刀在酒精燈上燒熱并冷卻后在土壤溶液中輕輕浸泡一下保證三角刮刀上沾有土壤溶液，最后用沾有土壤溶液的三角刮刀在平板上旋轉涂布均勻，蓋上皿蓋。（3）培養(yǎng)：將涂布完畢的培養(yǎng)皿（實驗將三個平板用于土壤溶液的涂布，做好標簽）送到37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天。（4）觀察：待長出菌落，觀察實驗結果。2實驗方法1232.2活性污泥、土壤和底泥中菌種的分離純化2.2.1培養(yǎng)基制備、滅菌（1）實驗用具滅菌：將實驗需要用到的培養(yǎng)皿清洗干凈后用報紙包裝好放入滅菌鍋滅菌。（2）培養(yǎng)基配方：牛肉膏3g，NaCl5g，蛋白胨10g，瓊脂15~20g，淀粉2g，蒸餾水1000mL，pH：7.4~7.8。滅菌條件：0.103MPa（121℃,15~20min）（3）按照配方將培養(yǎng)基溶液煮好后倒入干凈的大錐形瓶中，塞上棉塞，用報紙包裝好錐形瓶口后放入滅菌鍋滅菌。（4）滅菌結束并冷卻后在無菌操作臺中將培養(yǎng)基溶液倒入6個培養(yǎng)皿中，倒入的培養(yǎng)基溶液應不超過培養(yǎng)皿的1/2，待培養(yǎng)基凝固后即成平板，最后將制好的平板放到37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天。2實驗方法1232.3單菌種的擴大培養(yǎng)（1）液體培養(yǎng)基的制備、滅菌：按照培養(yǎng)基配方（不加瓊脂，其他相同）將培養(yǎng)基溶液煮好后稍冷卻倒入7個錐形瓶中，7個錐形瓶中的溶液的量應相同，均為100mL。用棉塞塞住錐形瓶并用報紙包裝好后將它們置于滅菌鍋中進行滅菌。滅菌結束并冷卻后即可得到液體培養(yǎng)基。（2）接種:把7個液體培養(yǎng)基置于無菌操作臺中，將上回活性污泥和土壤分離純化的6個平板從培養(yǎng)箱中取出。在無菌操作臺內(nèi)從3個活性污泥和3個土壤分離純化的平板形成的多個菌落中各找出明顯不同的三個菌落，并將這6種菌落分別接種到6個液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，做好標簽“土壤①”“土壤②”“土壤③”“活性①”“活性②”“活性③”，剩余一液體培養(yǎng)基不接種菌落，作為無菌空白對照組。具體操作如下：把接種環(huán)在酒精燈上燒紅后，挑取一環(huán)菌落在液體培養(yǎng)基中充分攪動確保該菌落進入液體培養(yǎng)基。（3）培養(yǎng)：接種完后將7瓶液體培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天。2實驗方法1232.4不同單菌種對染料的降解實驗在無菌操作臺內(nèi)往7個錐形瓶的菌種液體培養(yǎng)基中加入等量的少量的孔雀綠染料，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后，將7個錐形瓶的菌種液體培養(yǎng)基倒入7個離心管中進行離心后，在紫外分光光度計上于波長617nm處，以液體培養(yǎng)基溶液為參比，測定吸光度值。根據(jù)吸光度值算出脫光率，最后根據(jù)脫光率，確高效脫色菌種。2實驗方法1232.5對菌種進行初步鑒定對這六種菌進行革蘭氏染色觀察菌種的形狀和菌屬。（1）涂片、固定取干凈的載玻片于實驗臺上，在正面邊角作記號，用膠頭滴管滴一滴含菌溶液于載玻片中央。將載玻片置于微小火焰上方烘干。烘干后再在火焰上方快速通過3~4次，使菌體完全固定在載玻片上。但不宜在高溫下長時間烤干，否則急速失水會使菌體變形。（2）初染滴加草酸銨結晶紫染色液染色1~2min，水洗。（3）媒染滴加革蘭氏碘液，染1~2min，水洗。（4）脫色滴加體積分數(shù)為95%的乙醇，約45s后即水洗；或滴加體積分數(shù)為95%的乙醇后將玻片搖晃幾下即傾去乙醇，如此重復2~3遍后即水洗。（5）復染滴加番紅染液，染2~3min，水洗并使之干燥。（6）鏡檢按顯微鏡的操作步驟觀察菌體形態(tài)，及時記錄并根據(jù)呈現(xiàn)的顏色判斷該菌屬是陽性菌還是陰性菌。2實驗方法3結果與討論3.1孔雀綠的標準曲線制定3結果與討論3.2不同菌種對染料的降解實驗

由表格中的數(shù)據(jù)可以看出不同菌種對孔雀綠染料的脫光率中，“土壤③”菌種的脫光率是最高的，可以初步確定為高效脫色菌種。但由于實驗誤差導致菌種脫光率出現(xiàn)大于100%的情況，經(jīng)討論，造成該誤差可能的原因為：在用紫外分光光度計測吸光度步驟中，所采用的參比溶液不正確。在實驗過程中我們是用液體培養(yǎng)基溶液作為參比的，但實際上在用液體培養(yǎng)基對菌種進行擴大培養(yǎng)一段時間后，作為碳源的淀粉，可能早已被菌種消耗完了，所以應選不含淀粉的液體培養(yǎng)基溶液作為參比。3結果與討論3.3對菌種進行初步鑒定活性污泥①長細絲狀革蘭氏染色陽性