固定化酶催化反應(yīng)過程

第一頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五1、水溶性酶應(yīng)用過程中的一些不足酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶(如α-淀粉酶、Taq酶等)及可以耐受較低的pH條件(胃蛋白酶等)以外，大多數(shù)的酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應(yīng)，這樣酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無疑給產(chǎn)物的進(jìn)一步的分離純化帶來一定的困難。固定化酶、概述:第二頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五通過物理或化學(xué)的方法使溶液酶轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢ǖ目臻g內(nèi)其運動受到約束（完全或局部）的一種不溶于水，但仍具活性的酶。它以固相狀態(tài)作用于底物進(jìn)行催化反應(yīng)。水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)2、固定化酶（固相酶或水不溶酶）：第三頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五3、固定化酶的研究歷史固定化酶的研究從50年代開始，1953年德國的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體與羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結(jié)合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技術(shù)迅速發(fā)展起來。1969年，日本的千煙一郎首次在工業(yè)上生產(chǎn)應(yīng)用固定化氨基酰化酶從DL-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸，實現(xiàn)了酶應(yīng)用史上的一大變革。在1971年召開的第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會議上，確定固定化酶的統(tǒng)一英文名稱為Immobilizedenzyme。第四頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五優(yōu)點:(1)

在催化反應(yīng)以后，固定化酶容易從反應(yīng)系統(tǒng) 中分離出來，可以反復(fù)使用，固定化后的酶 大多數(shù)情況下其穩(wěn)定性增加.(2)

產(chǎn)物不受污染,容易精制;(3)固定化酶有一定的形狀和機(jī)械強(qiáng)度，可以裝 填在反應(yīng)器中長期使用，便于實現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù) 化和自動化。缺點：

(1)存在擴(kuò)散限制。適于催化小分子物質(zhì)。

(2)酶活性下降。4、固定化酶的優(yōu)缺點：第五頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用: 5、固定化酶應(yīng)用:泵儲罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala固定化氨基酸酰化酶生產(chǎn)L-氨基酸;乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala第六頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五固定化葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)高果糖漿---世界上生產(chǎn)規(guī)模最大，應(yīng)用最為成功的一種固定化酶.第七頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五固定化酶在生化制藥中的應(yīng)用:固定化的青霉素?；干a(chǎn)制造各種半合成的青霉素和頭孢霉素;固定化谷氨酸脫羧酶可以生產(chǎn)γ-氨基丁酸,制成了CO2電極,可用于測定谷氨酸的含量。固定化酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用:固定化纖溶酶治療血栓,用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎等第八頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五固定化酶在分析檢測和環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用

(生物傳感器是由生物活性物質(zhì)與換能器組成的分析系統(tǒng),可以簡便、快速地測定各種特異性很強(qiáng)的物質(zhì))第九頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五固定化葡萄糖氧化酶傳感器是其中應(yīng)用最為廣泛的一種,將葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶和一種顯色劑一起固定在試紙上,只要將該試紙浸入被檢尿樣中幾秒鐘就可以馬上檢測出尿樣的葡萄糖是否超標(biāo),從而斷定該婦女是有血糖、尿糖還是妊娠。生化分析中最常用的H電極也絕大多數(shù)是固定化酶產(chǎn)品:固定化青霉素酶電極重組海洛因酯酶傳感器檢測違禁藥品用聚丙烯酰胺凝膠包埋細(xì)菌電極可快速測定污水中的BOD。第十頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五

——載體結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法.1）載體結(jié)合法：將酶結(jié)合于水不溶性載體的一種固定化方法。物理吸附法離子結(jié)合法共價結(jié)合法結(jié)合的形式6、固定化酶的制備方法:第十一頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五離子結(jié)合法：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法。載體:多糖類離子交換劑和合成高分子離子交換樹脂。DEAE纖維素、GM纖維素等。特點:操作簡單，條件溫和，酶活回收率較高,受緩沖液種類或pH的影響，易從載體上脫落。物理吸附法：酶被物理吸附(氫鍵,疏水鍵)于不溶性載體的一種固定化方法。載體:活性炭、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、淀粉、合成樹脂等。特點:酶活性中心不易被破壞，酶結(jié)構(gòu)變化少，酶與載體相互作用力弱，酶易脫落。第十二頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五共價結(jié)合法：酶以共價鍵結(jié)合于載體的固定化方法，是載體結(jié)合法中應(yīng)用最多的一種。將載體有關(guān)基團(tuán)活化，與酶有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；或在載體上接一個雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去?？膳c載體結(jié)合的酶的功能團(tuán)有氨基、羧基、羥基、酚基等。代表性的方法有重氮法、溴化氰法等。特點:反應(yīng)條件比較苛刻，操作復(fù)雜，并引起酶高級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，破壞了部分活性中心，酶活回收率為30％左右。第十三頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五用雙功能或多功能試劑使酶與酶之間交聯(lián)的固定化方法。它是利用共價鍵固定酶的，它不使用載體。交聯(lián)劑:形成希夫堿的戊二醛、形成肽鍵的異氰酸酯、發(fā)生重氮偶合反應(yīng)的雙重氮聯(lián)苯胺等。特點:結(jié)合牢固，可以長時間使用,反應(yīng)條件較激烈、酶活回收率低,顆粒較小,使用不便。2）交聯(lián)法：第十四頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長補短。第十五頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五——網(wǎng)格型和微囊型兩種。將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)格型；將酶包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。特點:酶的高級結(jié)構(gòu)改變少，酶活回收率較高，包埋法只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶，因為只有小分子才可以通過高分子凝膠的網(wǎng)格進(jìn)行擴(kuò)散。適于網(wǎng)格型的高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、明膠、海藻酸等。

3）包埋法第十六頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五微囊型特點:固定化酶顆粒一般為直徑是幾微米到幾百微米的球狀體，比網(wǎng)格型顆粒小得多,有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散;半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進(jìn)入，注入體內(nèi)既可避免引起免疫過敏反應(yīng)，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學(xué)價值.但反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。制備方法:界面沉淀法、界面聚合法、二級乳化法和脂質(zhì)體包埋法等.第十七頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五脂質(zhì)體包埋：這是一種采用表面活性劑和磷脂酰膽堿等物質(zhì)，形成液膜來包埋酶的方法。脂質(zhì)體是指具有脂雙層結(jié)構(gòu)和一定包囊空間的微球體,

具有一定的機(jī)械性能，能定向?qū)⒚傅缺话飻y帶到體內(nèi)特定部位，然后將被包裹物質(zhì)釋放。因此，其在藥物應(yīng)用方面受到重視。第十八頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五第十九頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五固定化方法吸附法包埋法共價結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法離子吸附法制備難易易易較難難較難結(jié)合程度弱中等強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能可能不能不能不能費用低低低高中等底物專一性不變不變不變可變可變第二十頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五發(fā)展方向:將酶固定在生物膜或超濾膜上,制造出來的生物膜反應(yīng)器;固定化細(xì)胞技術(shù)注:通過不同方法制得的固定化酶，必須制成不同型式的組件裝在反應(yīng)器中進(jìn)行酶催化反應(yīng)，例如制成顆粒狀、膜狀、管狀(中空纖維)。第二十一頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五酶的固定化，不僅使酶的活性發(fā)生了變化，而且由于固定化酶使反應(yīng)體系變?yōu)槎嘞囿w系，例如液一固體系,氣-液-固等，因此研究需結(jié)合以下兩個方面:考慮酶催化反應(yīng)的本征動力學(xué)規(guī)律;研究反應(yīng)物的質(zhì)量傳遞規(guī)律，及其對酶催化反應(yīng)過程的影響。固定化酶催化反應(yīng)動力學(xué)本質(zhì)宏觀動力學(xué)方程:同時包括物質(zhì)傳質(zhì)速率和催化反應(yīng)速率的動力學(xué)方程。是設(shè)計固定化酶催化反應(yīng)器和確定其操作條件的理論基礎(chǔ)。第二十二頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五溶液酶→固定化酶，其性質(zhì)將會發(fā)生很大的變化。這種變化因酶的種類、所催化的反應(yīng)、所用的載體和采用的固定化方法的不同而不同。3．1固定化酶催化的動力學(xué)特征

一、酶的固定化對其動力學(xué)特性的影響(1)活性的變化。固定化時，部分酶未被固定而殘留在溶液中，造成了酶的部分損失；同時由于各種原因也會造成已被固定化的酶的活性有所下降。固定化酶的動力學(xué)仍服從M—M方程，可通過米氏常數(shù)K反映酶在固定化前后活性的變化。第二十三頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五某些游離酶和固定化酶的米氏常數(shù)酶固定化試劑底物Km/(mol/L)肌酸激酶無對氨苯基纖維素ATPATP6.5×10-48.0×10-4乳酸脫氫酶無丙酰-玻璃NADHNADH7.8×10-65.5×10-5-糜蛋白酶無可溶性醛葡聚糖ATEEATEE1.0×10-31.3×10-3無花果蛋白酶無CM-纖維-70BAEEBAEE2×10-22×10-2胰蛋白酶無馬來酸/1,2-亞乙基BAABAA6.8×10-32×10-4ATP-三磷酸腺苷;NADH-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸;ATEE-N-乙酰-L-酪氨酸乙酯;BAEE-N-苯酰精氨酸乙酯;BAA-苯酰精氨酰胺大多數(shù)酶在固定化后，其Km值增加，表示催化反應(yīng)活性將下降。也有少數(shù)酶固定化后活性無變化，甚至有所增大。第二十四頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五評價活性變化的兩種指標(biāo)：酶活力表現(xiàn)率和酶活力收率。酶活力表現(xiàn)率：實際測定的固定化酶的總活力與被固定化了的酶在溶液狀態(tài)時的總活力之比。酶活力收率：實際的固定化酶的總活力與固定化時所用的全部游離酶的活力之比。活力表現(xiàn)率=固定化酶總活力/(加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)×100%活力收率=固定化酶總活力/加入酶的總活力×100%第二十五頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五半衰期:在連續(xù)測定條件下，固定化酶(細(xì)胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。理論推測酶固定化后，其半衰期將增加一倍。熱穩(wěn)定性:也有所提高，要比溶液酶提高10多倍。這是因為酶固定化后，酶的空間結(jié)構(gòu)變得更為堅固，加熱時不易變形，增加了酶的熱穩(wěn)定性。酶被固定化后，其穩(wěn)定性有所增加，保存和使用時的穩(wěn)定性均有提高。(2)穩(wěn)定性的變化:第二十六頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五構(gòu)象效應(yīng)：酶在固定化過程中，由于酶和載體的相互作用，引起了酶的活性部位發(fā)生某種扭曲變形，改變了酶活性部位的三維結(jié)構(gòu)，減弱了酶與底物的結(jié)合能力的現(xiàn)象。屏蔽效應(yīng)（位阻效應(yīng)）：載體的存在使酶分子的活性基團(tuán)不易與底物相接觸，從而對酶的活性部位造成了空間障礙，使酶的活性下降。如在葡聚糖凝膠上共價交聯(lián)胰蛋白酶的活性低于結(jié)合在瓊脂糖的活性，原因是葡聚糖凝膠的空間屏障大于瓊脂糖。

二、固定化酶動力學(xué)的影響因素

(1)空間效應(yīng):酶的活性部位和變構(gòu)部位的性質(zhì)取決于酶分子的三維空間結(jié)構(gòu)。

第二十七頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五當(dāng)固定化酶處在反應(yīng)體系的主體溶液中時，反應(yīng)體系成為固液非均相體系。由于固定化酶的親水性、疏水性及靜電作用等引起固定酶載體內(nèi)部底物或產(chǎn)物濃度與溶液主體濃度不同的現(xiàn)象→分配效應(yīng)。造成了底物濃度在兩個環(huán)境中的不同，必然使酶的催化反應(yīng)速率有所不同。

分配效應(yīng)一般采用液固界面內(nèi)外側(cè)的底物濃度之比（分配系數(shù)）來定量表示。(2)分配效應(yīng)第二十八頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五界面內(nèi)側(cè)的底物濃度為Csg，界面外側(cè)的底物濃度為Csi,則分配系數(shù)K為：K=Csg／CsiCso—液相主體的濃度，Csi——外擴(kuò)散造成的界面外側(cè)濃度。Csg—由分配效應(yīng)造成的微環(huán)境的底物濃度。第二十九頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五靜電效應(yīng)的影響表現(xiàn)在對Km值的影響。通常酶可能被固定在帶電荷的酶膜上或載體上。底物在溶液中也會離子化，這樣在固定載體上的電荷和移動的離子之間，常會發(fā)生靜電交互作用，產(chǎn)生分配效應(yīng)。使底物或產(chǎn)物濃度之間出現(xiàn)不均勻分布。根據(jù)Boltzman分配定律，分配系數(shù)K為Z--底物分子所帶電荷；F--法拉第常數(shù)；U--靜電電勢。當(dāng)載體與底物所帶電荷相反時，即Z為正、U為負(fù)時，K大于1;當(dāng)兩者帶有相同電荷時，則K小于1。第三十頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五對固定化酶催化反應(yīng)，其底物濃度應(yīng)取在固定化酶內(nèi)外表面附近的微環(huán)境的數(shù)值，根據(jù)米氏方程，當(dāng)Z及U為異號，K'm小于Km；反之，則K'm大于Km

；當(dāng)任何一方電荷為零時，Km不變。當(dāng)載體與底物帶不同電荷時，Km值減小，反應(yīng)速率增大；帶有相同電荷時Km值增大，反應(yīng)速率減小。其根源在于使微環(huán)境與主體溶液之間的濃度出現(xiàn)了差異。第三十一頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五(3)擴(kuò)散效應(yīng)：固定化酶對底物進(jìn)行催化反應(yīng)時，底物必須從主體溶液傳遞到固定化酶內(nèi)部的催化活性中心處，反應(yīng)得到的產(chǎn)物必須從酶的催化活性中心傳遞到主體溶液中。物質(zhì)的傳遞過程有分子擴(kuò)散和對流擴(kuò)散。擴(kuò)散過程的速率在某些情況下可能會對反應(yīng)速率產(chǎn)生限制作用，由于生物物質(zhì)在液體中的擴(kuò)散速率相當(dāng)緩慢，而酶的催化活性又很高時，這種擴(kuò)散限制效應(yīng)會相當(dāng)明顯。

第三十二頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五擴(kuò)散限制效應(yīng)有外擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)。外擴(kuò)散：底物從液相主體向固定化酶的外表面的一種擴(kuò)散,或是產(chǎn)物從固定化酶的外表面向液相主體中的擴(kuò)散。外擴(kuò)散是發(fā)生在催化反應(yīng)之前或之后。由于外擴(kuò)散阻力的存在，使底物或產(chǎn)物在液相主體和固定化酶外表面之間存在著濃度梯度。內(nèi)擴(kuò)散：指對有微孔載體的固定化酶，底物從固定化酶外表面擴(kuò)散到微孔內(nèi)部的酶催化中心處，或是產(chǎn)物沿相反途徑的擴(kuò)散。對底物來講，內(nèi)擴(kuò)散限制與酶催化反應(yīng)同時進(jìn)行。第三十三頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五由于擴(kuò)散限制效應(yīng)的存在，底物濃度從液相主體到固定化酶外表面，再到內(nèi)表面是依次降低，而產(chǎn)物濃度分布則相反。第三十四頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五分配效應(yīng)造成的結(jié)果是使微觀環(huán)境與宏觀環(huán)境之間的底物濃度出現(xiàn)了差別，因而影響了酶催化的反應(yīng)速率。如果在上述本征動力學(xué)的基礎(chǔ)上，僅考慮由于這種分配效應(yīng)而造成的濃度差異對動力學(xué)產(chǎn)生的影響，所建立的動力學(xué)稱為固有動力學(xué)。動力學(xué)方程仍然服從M—M方程形式，僅對動力學(xué)參數(shù)予以修正?？臻g效應(yīng)難以定量描述，它與固定化的方法、載體的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)、底物分子大小和形狀等因素有關(guān)。這屬于酶工程的范圍?？臻g效應(yīng)的影響可通過校正動力學(xué)參數(shù)rmax和Km來體現(xiàn)的。在此基礎(chǔ)上建立起的動力學(xué)方程→本征動力學(xué)。本征動力學(xué)是指酶的真實動力學(xué)行為，包括溶液酶和固定化酶在內(nèi)。固定化酶的本征動力學(xué)與溶液酶的本征動力學(xué)是有差別的。第三十五頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五擴(kuò)散效應(yīng):固定化酶受到擴(kuò)散限制時所觀察到的速率統(tǒng)稱為有效反應(yīng)速率（宏觀反應(yīng)速率）。由于生化物質(zhì)在溶液內(nèi)和固定化酶微孔內(nèi)的擴(kuò)散速率是比較慢的，因而擴(kuò)散阻力是影響固定化酶催化活力的主要因素。并且所建立的宏觀動力學(xué)方程也不完全服從M—M方程形式。

第三十六頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五因此對一個非均相(液一固)體系所建立的宏觀動力學(xué)方程不僅包括酶的催化反應(yīng)速率，而且還包括了傳質(zhì)速率。這是固定化酶催化反應(yīng)過程動力學(xué)的最主要特征。對固定化酶催化反應(yīng)動力學(xué)，要考慮固定化酶本身的活性變化和底物等物質(zhì)的傳質(zhì)速率的影響，而傳質(zhì)速率又與底物等物質(zhì)的性質(zhì)和操作條件以及載體的的性質(zhì)等因素有關(guān)。第三十七頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五3．2外擴(kuò)散限制效應(yīng)固定化酶與液相反應(yīng)物系相接觸時，反應(yīng)過程包括三步：①底物從液相主體擴(kuò)散到固定化酶的外表面；②底物在固定化酶的外表面上進(jìn)行反應(yīng)；③產(chǎn)物從酶外表面擴(kuò)散進(jìn)入液相主體。三步是一串聯(lián)過程。任意一步的速率發(fā)生變化，都影響到整個過程的速率。第三十八頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五對非帶電的固定化酶，其外表面上的反應(yīng)速率符合M—M方程形式，即Rsi—底物在固定化酶外表面上的消耗速率（宏觀反應(yīng)速率），mol／(L·S)；Csi——底物在固定化酶外表面上的濃度，mol／L。3.2.1外擴(kuò)散速率對酶催化反應(yīng)速率的限制第三十九頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五底物由液相主體擴(kuò)散到固定化酶外表面的速率Rsd表示為kL——液膜傳質(zhì)系數(shù)，m／s；a——單位體積的物系中所具有的傳質(zhì)表面積;kLa——體積傳質(zhì)系數(shù)，s-1；Cso—底物在液相主體中的濃度，mol／L。定態(tài)條件下，應(yīng)存在Rsi=Rsd，第四十頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五該式表示了在定態(tài)條件下，外擴(kuò)散傳質(zhì)速率等于在固定化酶外表面上底物的反應(yīng)速率。當(dāng)外擴(kuò)散傳質(zhì)速率很快，而固定化酶外表面反應(yīng)速率相對較慢，并成為該反應(yīng)過程速率的控制步驟時，則酶的外表面上底物濃度應(yīng)為液相主體溶液的濃度Cs。此時的反應(yīng)速率應(yīng)為第四十一頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五存在有Cso=Csi。因此上式為沒有外擴(kuò)散傳質(zhì)速率影響的本征反應(yīng)速率，或稱為在此條件下可能達(dá)到的最大反應(yīng)速率rso。當(dāng)外擴(kuò)散傳質(zhì)速率很慢，而酶表面上的反應(yīng)速率很快，此時外擴(kuò)散速率成為反應(yīng)的控制步驟。固定化酶外表面上底物濃度趨于零?！鶵si=kLaCso=rd第四十二頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五Rso~Cso----非線性Rd~Cso----線性當(dāng)Cso值較低時，rso>rd，為外擴(kuò)散控制，→Rsi=rd當(dāng)Cso值較高時，rso<rd，為動力學(xué)控制，→Rsi=rso第四十三頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五當(dāng)Cso處于中間范圍，稱為過渡區(qū)，反應(yīng)速率與擴(kuò)散速率相差不大。要求取有外擴(kuò)散影響下的反應(yīng)速率，即宏觀反應(yīng)速率Rsi,可采用兩種方法求出。(1)由Csi值確定Rsi。定義上式表示為第四十四頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五

——無因次準(zhǔn)數(shù)，常稱Damkohler(丹克萊爾)準(zhǔn)數(shù)。求解可得當(dāng)a>0，括號內(nèi)取“+’’號；當(dāng)a<0，則應(yīng)取“一’’號。求出Csi值，再求出宏觀反應(yīng)速率Rsi值。

第四十五頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五Da是一個無因次數(shù)群。其物理意義為：當(dāng)Da<<l時，酶催化最大反應(yīng)速率要低于底物的擴(kuò)散速率。此時為反應(yīng)動力學(xué)控制。當(dāng)Da>>l時，則底物最大擴(kuò)散速率要低于酶催化底物的反應(yīng)速率，此時該反應(yīng)過程為傳質(zhì)擴(kuò)散控制。底物在固定化酶外表面處的濃度應(yīng)同時滿足傳質(zhì)速率方程式和反應(yīng)速率方程式，因此可通過作圖法求出Csi值和相應(yīng)的速率值。第四十六頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五圖中曲線1為底物S的反應(yīng)本征動力學(xué)曲線；直線2為傳質(zhì)速率方程；直線斜率為kLa；直線與曲線交點為方程的解，對應(yīng)橫坐標(biāo)值為其表面底物濃度Csi，交點對應(yīng)的縱坐標(biāo)值為所求的表面反應(yīng)速率Rsi。第四十七頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五如果是帶電的固定化酶放在電離了的底物溶液中，則表示外擴(kuò)散速率影響的宏觀速率應(yīng)為λ-與靜電分布有關(guān)的參數(shù)，M-修正系數(shù)第四十八頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五（2）外擴(kuò)散有效因子ηE，求RSi值。

ηE的定義為：用無因次形式得：有外擴(kuò)散影響時的實際反應(yīng)速率為：第四十九頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五當(dāng)時，Rsi≈rso，表明固定化酶外表面處底物濃度與液相主體濃度相同，反應(yīng)沒有受到外擴(kuò)散傳質(zhì)速率的限制影響；當(dāng)時，則表明由于外擴(kuò)散傳質(zhì)速率較慢，已在某種程程度上限制了反應(yīng)速率；當(dāng)時，則宏觀反應(yīng)速率實際上由外擴(kuò)散傳質(zhì)速率所控制。當(dāng)反應(yīng)過程為外擴(kuò)散控制時，Da>>l，有：

第五十頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五此時反應(yīng)宏觀速率可表示為：Rsi=kLaCs0

——一級反應(yīng)動力學(xué)當(dāng)反應(yīng)過程為動力學(xué)控制時，Da<<1，有：Rsi=rso為了使盡可能增大到1，應(yīng)控制操作條件使Da值盡可能小，即提高kLa值。一個有效的方法是提高液體流速。在消除了外擴(kuò)散的影響時所測得的宏觀反應(yīng)速率實際上反映了本征反應(yīng)速率。

第五十一頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五引入無因次底物液相主體濃度為

不同β值下，與Da的關(guān)系表示如圖

當(dāng)Da和β已知，可確定但需要已知其本征動力學(xué)參數(shù)rmax和Km，而這些參數(shù)又是不受外擴(kuò)散影響的反應(yīng)中求得的第五十二頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五引入可觀察的丹克萊爾準(zhǔn)數(shù)

式中沒有反應(yīng)的本征動力學(xué)參數(shù)。用來求值要比用Da更為方便。知故第五十三頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五在不同β值下，與作圖。用該圖很容易由值確定值。第五十四頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五外擴(kuò)散對反應(yīng)過程速率的影響還可從E—H圖看到

當(dāng)Da值較小時，為動力學(xué)控制，該關(guān)系表示為一直線；隨著Da值的增大，外擴(kuò)散影響程度在增加，關(guān)系曲線明顯偏離直線。通過該圖可檢驗外擴(kuò)散對反應(yīng)的限制程度。第五十五頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五對任意n級反應(yīng)A—R，本征速率方程為

n=1

第五十六頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五3．3內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)對包埋或吸附于多孔性載體中的固定化酶，其催化反應(yīng)發(fā)生的主要部位是在顆粒的內(nèi)部。內(nèi)擴(kuò)散的阻力主要是微孔內(nèi)的阻力。阻力的大小與固定化酶顆粒內(nèi)部的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)、反應(yīng)物系的性質(zhì)等因素有關(guān)。3.3.1載體的結(jié)構(gòu)參數(shù)與微孔內(nèi)的擴(kuò)散研究內(nèi)擴(kuò)散對動力學(xué)的影響時，常將均勻分布著酶的多孔球形顆粒為研究模型。先研究顆粒載體的結(jié)構(gòu)參數(shù)和流體在載體微孔內(nèi)的擴(kuò)散。第五十七頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五（1）載體結(jié)構(gòu)參數(shù)①比表面積Sg：單位質(zhì)量載體所具有的內(nèi)表面積，m2/g。Sg=200~300m2/g。②微孔半徑：多孔載體的內(nèi)表面積與微孔孔徑大小有關(guān)。孔徑愈小、比表面積愈大。如用Vg表示單位質(zhì)量載體所具有的孔體積，則平均微孔半徑為：③孔隙率:載體顆粒內(nèi)孔隙所占有的體積與該顆粒體積之比值。值恒小于1表觀密度:表示了單位顆粒體積中所含有固體的質(zhì)量。第五十八頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五④顆粒當(dāng)量直徑體積相當(dāng)直徑dv:與顆粒體積相等的球體直徑來表示外表面積相當(dāng)直徑ds:與顆粒的比表面積相等的球體直徑來表示假定某任一形狀的固定化酶顆粒，其體積為Vp，外表面積為Ap，各當(dāng)量直徑分別為形狀系數(shù)（球形度）：與顆粒體積相同的球體的外表面積As與顆粒的外表面積Ap之比值——表示了任意顆粒的外形與球形相接近的程度。第五十九頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五⑤顆粒密度顆粒表觀密度顆粒真密度顆粒堆密度

第六十頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五(2)液體在微孔內(nèi)的擴(kuò)散：

當(dāng)微孔內(nèi)流動時，則某一組分的擴(kuò)散可以認(rèn)為是以濃度差為推動力而進(jìn)行的。對于氣相分子在微孔內(nèi)的擴(kuò)散，則由于微孔半徑r與分子運動的平均自由程λ的相對大小不同，微孔內(nèi)的擴(kuò)散機(jī)理可分為兩種：分子擴(kuò)散（正常擴(kuò)散）：擴(kuò)散的阻力來自于分子之間的碰撞，擴(kuò)散速率主要受到分子之間相互碰撞的影響，與微孔直徑的大小無關(guān)。努森(Knudson)擴(kuò)散：其擴(kuò)散過程的阻力主要是分子與孔壁之間的碰撞，而分子之間的碰撞影響較小。它常發(fā)生在微孔直徑較小的情況。第六十一頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五

當(dāng)時，→分子擴(kuò)散；當(dāng)時，→努森擴(kuò)散。介于之間屬于兩種擴(kuò)散機(jī)理并存。液體在微孔內(nèi)的擴(kuò)散機(jī)理一般為分子擴(kuò)散。其擴(kuò)散速率由分子擴(kuò)散系數(shù)決定。微孔內(nèi)液體分子的擴(kuò)散速率，可用Fick定律描述：

Ns—組分S的擴(kuò)散通量，z—沿擴(kuò)散方向的距離，De—有效擴(kuò)散系數(shù)第六十二頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五固定化酶顆粒內(nèi)部的微孔是彎彎曲曲的，微孔的大小也不均勻，微孔彼此之間可能封閉，也可能連通。因此與在主體溶液中進(jìn)行的分子擴(kuò)散相比，擴(kuò)散阻力明顯增大，其擴(kuò)散系數(shù)要比分子擴(kuò)散系數(shù)小。

對于常用固定化酶凝膠，De／D大約為0.5~0.8。但對于微膠囊固定化酶，由于顆粒內(nèi)亦為液相，因此De≈D。第六十三頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五第六十四頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五3.3.2

微孔內(nèi)反應(yīng)組分的濃度分布在微孔內(nèi)，由于內(nèi)擴(kuò)散阻力的存在，反應(yīng)組分在微孔內(nèi)的濃度分布不均勻。底物在固定化酶顆粒的外表面處濃度最高而在顆粒中心處濃度最低，形成濃度分布，而反應(yīng)產(chǎn)物的濃度分布則與之相反。由于在微孔內(nèi)擴(kuò)散與反應(yīng)同時進(jìn)行，因而沿著微孔方向，底物的濃度及反應(yīng)速率同時在下降。要描述濃度及反應(yīng)速率的變化規(guī)律，必須建立包括擴(kuò)散與反應(yīng)在內(nèi)的質(zhì)量衡算方程式。

第六十五頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五對球形固定化酶(1)質(zhì)量衡算方程：普遍而完整的質(zhì)量衡算方程應(yīng)表示為[流入系統(tǒng)的質(zhì)量]一[離開系統(tǒng)的質(zhì)量]+[系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的質(zhì)量]一[系統(tǒng)內(nèi)消耗的質(zhì)量]=[系統(tǒng)內(nèi)累積的質(zhì)量]第六十六頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五對球形顆粒，常用一殼層進(jìn)行質(zhì)量衡算，如圖所示。球形顆粒半徑為R，在距球心為r處取一殼層，其厚度為Δr。底物通過微孔由外向內(nèi)擴(kuò)散，并通過此殼層。底物在(r+Δr)處擴(kuò)散進(jìn)入，在r處離開，并在殼層內(nèi)發(fā)生酶催化反應(yīng)而消耗底物。第六十七頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五推導(dǎo)質(zhì)量衡算方程時的七點假設(shè)：①固定化酶顆粒是等溫的。一般情況下，固定化酶顆粒內(nèi)的溫度梯度是可以忽略的，以簡化了模型。②傳質(zhì)機(jī)理為擴(kuò)散效應(yīng)。一般假定顆粒對流體是不能滲透的，微孔內(nèi)流體的對流流動也是可以忽略的。這個假設(shè)對很多固定化酶是正確的。③擴(kuò)散效可用費克定律描述。有效擴(kuò)散系數(shù)為一常數(shù)。De不依位置的不同而變化。④顆粒是均勻的，不僅其活性分布均勻，載體也是均勻的。第六十八頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五⑤底物分配系數(shù)是1。對大部分底物和固定化酶，該假設(shè)也是正確的。⑥固定化酶顆粒處于穩(wěn)態(tài)之下，即催化活性無變化⑦底物和產(chǎn)物的濃度僅沿r方向而變化。[流入系統(tǒng)的質(zhì)量]一[離開系統(tǒng)的質(zhì)量]+[系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的質(zhì)量]一[系統(tǒng)內(nèi)消耗的質(zhì)量]=[系統(tǒng)內(nèi)累積的質(zhì)量]第六十九頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五根據(jù)微分定義得：要得到具體結(jié)果，上述方程的解法與動力學(xué)rs的形式有關(guān)。（2）一級動力學(xué)的濃度分布。引入，，令則該方程式變?yōu)?/p>

第七十頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五邊界條件：處，，處，。求濃度分布為該方程通解：根據(jù)邊界條件求出積分常數(shù)

C1和C2。

C1=0

第七十一頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五雙曲正弦函數(shù)

第七十二頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五右圖表示了不同φ值時的關(guān)系曲線，即濃度分布圖。對M—M反應(yīng)，當(dāng)Cs<<Km時，可做一級反應(yīng)處理，此時

第七十三頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五當(dāng)φ1值較小時，φ1≤1，擴(kuò)散速率要明顯快于反應(yīng)速率，因此底物可以擴(kuò)散進(jìn)入顆粒中心，并且使底物濃度沿r方向的分布是平坦的。當(dāng)φ1值較大時，例如φ1≥5，擴(kuò)散速率要明顯慢于反應(yīng)速率，大部分底物在接近顆粒外表面處消耗掉。如當(dāng)φ1=5時，在≤0．6處，底物濃度接近于零。第七十四頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五

(3)零級動力學(xué)的濃度分布對零級反應(yīng)動力學(xué)，可得：

(Cs>0)對M—M反應(yīng)，當(dāng)Cs>>Km時，可做零級反應(yīng)處理，此時k0=rmax。對零級反應(yīng)動力學(xué)，反應(yīng)速率與底物濃度高低無關(guān)，僅與k0有關(guān)。第七十五頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五如果由于內(nèi)擴(kuò)散阻力較大,造成了固定化酶顆粒內(nèi)部在球心O到某一位置Rc處之間無底物存在，即Cs=0，這對固定化酶催化能力產(chǎn)生影響。解方程得到邊界條件：處，Cs=Cs0，

處，第七十六頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五方程的解當(dāng)Cs>0時才是正確的。通過上式可求出Cs=0時的臨界半徑Rc值。當(dāng)Cs=0時，

第七十七頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五Rc→臨界半徑，在r<Rc處無底物存在，也無反應(yīng)發(fā)生。在0<r<Rc處，催化劑并未得到利用。為了節(jié)省固定化酶，其顆粒大小應(yīng)做成保證在球心處，即r=0處，正好Cs=0，此時求得半徑稱為最大顆粒半徑Rmax：只要顆粒半徑R≤Rmax，就可保證顆粒內(nèi)Cs>0。第七十八頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五(4)M—M動力學(xué)的濃度分布對M—M反應(yīng)動力學(xué)，可得：無因次參數(shù):

第七十九頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五邊界條件為外表面處中心處該方程描述了球形固定化酶微孔內(nèi)底物濃度與擴(kuò)散距離的關(guān)系。只能用數(shù)值法求解。得到如圖所示的關(guān)系曲線。對同一位置處，隨著φm值的增加，底物濃度在減少;表明著內(nèi)擴(kuò)散阻力的增大，底物濃度下降；

第八十頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五對同φm值，當(dāng)，1,當(dāng)，為最低值,即愈往顆粒內(nèi)部，底物濃度愈小。

當(dāng)擴(kuò)散速率較快時,Cs可以到達(dá)顆粒中心處，此時Rc=0；當(dāng)擴(kuò)散速率較慢時,底物在還未達(dá)到顆粒的中心處已反應(yīng)掉，在r<Rc處，Cs=0,此時Rc>0。第八十一頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五不同固定化酶動力學(xué)的濃度分布公式第八十二頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五3.3內(nèi)擴(kuò)散有效因子在球形固定化酶內(nèi)底物濃度的分布反映了內(nèi)擴(kuò)散阻力對濃度分布的影響，為求出內(nèi)擴(kuò)散阻力對反應(yīng)速率的影響，要能定量地算出考慮內(nèi)擴(kuò)散影響時的有效反應(yīng)速率。引入內(nèi)擴(kuò)散有效因子η概念如果不存在外擴(kuò)散影響，則Csi=Cs0，表面濃度等于液相主體濃度，即Rsi=Rso。第八十三頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五有內(nèi)擴(kuò)散影響時的反應(yīng)速率：在無外擴(kuò)散影響時，可表示為(1)一級動力學(xué)的有效因子：當(dāng)無內(nèi)外擴(kuò)散影響存在時，一球形固定化酶總的本征反應(yīng)速率可表示為：

第八十四頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五對球形固定化酶顆粒，在穩(wěn)態(tài)條件下，顆粒內(nèi)實際有效反應(yīng)速率應(yīng)等于從顆粒外表面向微孔內(nèi)的擴(kuò)散速率。第八十五頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五又知：

則有得——球形固定化酶催化一級不可逆反應(yīng)的有效因子第八十六頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五不同形狀固定化酶的η1~1關(guān)系曲線隨著梯勒模數(shù)1的增加，有效因子η1下降，說明內(nèi)擴(kuò)散對速率的限制效應(yīng)增大；當(dāng)1<0.4時，η1≈1，動力學(xué)控制；當(dāng)1>3時，

，內(nèi)擴(kuò)散控制;當(dāng)0.4<1<3時，為過渡區(qū)。第八十七頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五固定化酶的幾何形狀的不同，對其η1與1

的關(guān)系的影響實際上是不大的，圖上三條曲線幾乎重合。特別是當(dāng)1值較小或較大時更為明顯。在計算不同幾何形狀固定化酶催化一級不可逆反應(yīng)的有效因子時，先分別求出不同形狀時的梯勒模數(shù)值，再求出不同形狀固定化酶的有效因子，這樣做不會帶來大的誤差。第八十八頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五(2)零級動力學(xué)的有效因子。根據(jù)零級反應(yīng)的動力學(xué)特點，只要在整個球形固定化酶顆粒內(nèi)有底物存在，而不管其濃度高低，都存在有：如果由于內(nèi)擴(kuò)散限制的影響，使得底物在顆粒某一位置Rc處，Cs=0，反應(yīng)速率也為零。球形顆粒的無活性區(qū)第八十九頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五此時，該球形顆粒實際反應(yīng)速率應(yīng)為：Thiele模數(shù)來求值。對球形固定化酶

第九十頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五當(dāng)0<0≤0.577時，顆粒內(nèi)Cs>0，0=1；當(dāng)0>0.577時，0與0有下述關(guān)系：第九十一頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五隨著0的增大，0下降。圖表示了對零級反應(yīng)動力學(xué)的0與0

關(guān)系曲線。

第九十二頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五不同動力學(xué)與幾何形狀時η~關(guān)系式第九十三頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五由于M—M反應(yīng)動力學(xué)時非線性的特點,不能求得顆粒內(nèi)濃度分布的解析解，也不能求得有效因子的解析解。一般采用數(shù)值解方法。

圖為對片狀固定化酶催化劑進(jìn)行M—M反應(yīng)動力學(xué)時與的關(guān)系曲線，的定義見表3-4。該曲線通過數(shù)值解而得到。(3)M—M動力學(xué)的有效因子。第九十四頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五M值介于0和1之間，準(zhǔn)確的結(jié)果取決于β值。當(dāng)β=∞→零級動力學(xué)；當(dāng)β=0→一級動力學(xué)。當(dāng)β值處于上述兩種情況之間,則需要用數(shù)值解來求其M值。如果已經(jīng)有了m一m的曲線圖，則可利用公式直接求出m值，再利用有關(guān)圖，就可求出M值。第九十五頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五也可用近似公式求其M值。對膜狀固定化酶，a=b=1；對球形固定化酶，a=2.6，b=0.8。第九十六頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五

梯勒模數(shù)是一個重要無因次模型參數(shù)。其物理意義為：值愈大，表示內(nèi)擴(kuò)散傳質(zhì)速率相對于反應(yīng)速率較慢，內(nèi)擴(kuò)散阻力對反應(yīng)速率的限制程度就大。值的大小來判斷內(nèi)擴(kuò)散阻力對酶催化反應(yīng)的影響程度。(4)梯勒模數(shù)(Thielemodulus)的計算第九十七頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五對任何反應(yīng)動力學(xué)和任何形狀的固定化酶，普遍化的梯勒模數(shù)Vp-固定化酶顆粒體積，Ap-固定化酶顆粒外表面積rsi|Csi—Cs=Csi時的反應(yīng)速率；Cseq——平衡時底物濃度，對不可逆反應(yīng)Cseq=0。不同動力學(xué)和不同形狀的固定化酶催化反應(yīng)的梯勒模數(shù)計算公式，具體見表第九十八頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五m的定義第九十九頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五結(jié)論:①顆粒大小(或厚度)→特性尺寸。該值愈大、值也愈大，則值下降。為了減少內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)，應(yīng)盡可能采用小顆粒固定化酶。②微孔孔徑大小:若能增大De值，可使減小，值增大,內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)減輕。提高De值的重要手段是增大微孔孔徑，以減少底物或產(chǎn)物在微孔內(nèi)的擴(kuò)散阻力。從減小內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)角度考慮，固定化酶宜采用小粒度大孔徑。第一百頁，共一百一十六頁，編輯于2023年，星期五③當(dāng)動力學(xué)參數(shù)k0、k1和rmax值增加時,值增大，→值下降。由于動力學(xué)參數(shù)值的增大，使內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)的影響程度相對加大。需要指出:在值公式中所有采用的動力學(xué)參數(shù)為本征動力學(xué)參數(shù)，這些參數(shù)的數(shù)值必須是在無內(nèi)外擴(kuò)散影響下所測得的值。所用濃度表示為顆粒外表面濃度Csi，這是在有外擴(kuò)散時的濃度，若不考慮外擴(kuò)散影響，則可用Cs。(液相主體濃度)表示。包括β值、可用Cso／Km表示。第一百零一頁，共一百一十六頁，編輯于