哈蟆油質(zhì)量控制

哈蟆油質(zhì)量控制

【摘要】根據(jù)歷史文獻(xiàn)和現(xiàn)代哈蟆油研究的成果，進(jìn)行整理、分析、總結(jié)，闡述了哈蟆油質(zhì)量控制現(xiàn)狀和方法，從傳統(tǒng)的基源鑒別發(fā)展到性狀鑒別、顯微鑒別、色譜法、光譜法以及生物鑒定法，尤其是現(xiàn)代發(fā)展較好的氣相色譜、高效液相色譜、電泳色譜、PCR技術(shù)以及指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用使哈蟆油的研究進(jìn)入了一個(gè)更高的科學(xué)領(lǐng)域。對(duì)哈蟆油的鑒定手段不斷的完善，為提高哈蟆油質(zhì)量控制和鑒別真?zhèn)翁峁┝艘罁?jù)。

【關(guān)鍵詞】中藥；哈蟆油；質(zhì)量控制方法

前言

藥材的真?zhèn)舞b別和品質(zhì)評(píng)價(jià)是臨床應(yīng)用、成藥制備、中藥科研不可缺少的前提條件。我國藥材品種繁多，據(jù)統(tǒng)計(jì)約有一萬二千多種，由于地大物博，南北差異，同名異物、同物異名的混淆品種極多，療效各不相同。而且中藥的有效成分和環(huán)境、產(chǎn)地、采收季節(jié)等因素也有很大關(guān)系；加之近年來，假冒偽劣中藥充斥市場(chǎng)，為控制中藥質(zhì)量、保證臨床用藥安全和有效，中藥鑒定技術(shù)由傳統(tǒng)的性狀鑒別，如眼觀、鼻聞、口嘗、手摸升華、水火試等，對(duì)藥物的形狀、大小、輕重、顏色、表面特征、折斷面紋理、氣味、黏性、酸堿性等進(jìn)行正確鑒別和描述，到現(xiàn)代的色譜法、光譜法、X射線分析法、熱分析法、分子生物學(xué)技術(shù)等。哈蟆油OviductusRanae）為蛙科動(dòng)物中國林蛙RanatemporariachensinensisDavid雌蛙的輸卵管，經(jīng)采制干燥而得。據(jù)《中國藥典》Ⅰ部收載，具有補(bǔ)腎益精，潤肺養(yǎng)陰的功效，用于陰虛體弱，神疲乏力，心悸失眠，盜汗不止，癆嗽咳血［1］等癥狀。隨著中藥現(xiàn)代化技術(shù)的發(fā)展，哈蟆油的質(zhì)量控制技術(shù)也在不斷的提高。

1基源鑒定法

基源鑒定法就是應(yīng)用植物、動(dòng)物或礦物形態(tài)和分類學(xué)等方面的知識(shí)，對(duì)中藥的來源進(jìn)行鑒定。中國林蛙的形態(tài)特征［2］為：體長5～7cm；頭長等于或大于寬，口內(nèi)鋤骨齒位于肉鼻孔后方，排列成兩短行；兩側(cè)耳無后腺；背面黃褐色，較平滑；腹面黃白色，胸骨平坦，下肢部?jī)蓚?cè)稍膨大；后肢長為軀體的倍。

2性狀鑒別法

哈蟆油呈不規(guī)則的塊狀，彎曲而重疊，長～2cm，厚～5mm，表面黃白色，呈脂肪樣光澤，偶有帶灰白色薄膜狀干皮。摸之有滑膩感，在溫水中浸泡體積可膨脹10～15倍［3］。氣腥，味微甘，嚼之有黏滑感［1］。

3顯微鑒別法

董萬超等［4］報(bào)道了林蛙油的顯微特征如下：加碘酊染色后，在顯微鏡下觀察，呈金黃色。腺體細(xì)胞肥大，呈長橢圓形，排列整齊，細(xì)胞壁明顯，靠腺體內(nèi)腔一端較窄，細(xì)胞壁凸起，細(xì)胞核橢圓形，位于細(xì)胞中間稍偏向腺體內(nèi)腔一面，腺體底部較寬，上端較狹，呈圓錐形。腺體內(nèi)開口呈心臟形，內(nèi)凹，整個(gè)腺體布滿細(xì)小紋理。為鑒別哈蟆油與中華大蟾蜍輸卵管、明太魚精巢、瓊脂蛋白加工品、馬鈴薯甘薯的偽制品提供了依據(jù)。

4理化鑒別法

熒光檢查劉秀峰等［5］

報(bào)道了哈蟆油干品在365nm下呈黃色的熒光；乙醇浸出物在254nm下呈藍(lán)白色熒光［4］。

化學(xué)定性分析據(jù)報(bào)道［4］蛤蟆油水浸液雙縮脲反應(yīng)為深紫紅色；加茚三酮試劑，反應(yīng)為深藍(lán)紫色。為鑒別真?zhèn)翁峁┝艘罁?jù)。

化學(xué)定量分析1991年，劉永鎮(zhèn)等［6］利用哈蟆油與Fehling試劑生成沉淀的反應(yīng)，定量的鑒別了哈蟆油與其偽品蟾蜍輸卵管。錢笈締等［7］采用蛋白質(zhì)自動(dòng)分析儀測(cè)定冰糖哈蟆油中蛋白質(zhì)的含量，探索了動(dòng)物藥制劑的指控方法。王秋雨等［8］采用半微量的凱氏定氮法測(cè)定了哈蟆油和青蛙油中蛋白質(zhì)的含量分別為％和％。

光譜分析法

可見分光光度法衛(wèi)功慶等［9］用美國產(chǎn)DU650分光光度計(jì)，在553nm下測(cè)定了哈蟆油和青蛙油中膽固醇的含量，分別為，/kg，由此確定哈蟆油比較適合中老年人服用。

紫外光譜法李明剛等［10］在0～360nm下對(duì)哈蟆油和中華大蟾蜍輸卵管95％乙醇浸出物進(jìn)行了紫外檢測(cè)，結(jié)果哈蟆油9個(gè)吸收峰分別位于4，114，129，252，256，275，311，312，314nm；中華大蟾蜍輸卵管8個(gè)吸收峰分別位于4，113，131，216，245，275，298，315nm；王麗蘭等［11］紫外光譜法測(cè)定了哈蟆油中總核酸的含量為%，DNA為%，RNA為%。2006年，作者報(bào)道了采用紫外譜線組法，對(duì)不同產(chǎn)地和不同溶劑提取的哈蟆油正品和偽品的紫外及其一階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行了檢測(cè)，為哈蟆油的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供了依據(jù)［12，13］。

紅外光譜法對(duì)哈蟆油的紅外光譜的報(bào)道較少，丘澤雨等［14］對(duì)不同產(chǎn)地的珍珠、蟾蜍、哈蟆油、冬蟲夏草、五靈脂的同種藥材進(jìn)行了對(duì)比研究，并用紅外光譜法進(jìn)行了藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別。

原子吸收光譜法和發(fā)射光譜法王秋雨等［8］用原子分光光度計(jì)和等離子發(fā)射光譜儀測(cè)定了哈蟆油與青蛙油中微量元素和重金屬的含量，結(jié)果哈蟆油與青蛙油均含有人體必需的常用微量元素,但青蛙油中重金屬Pb及Hg含量超標(biāo)。李媛媛等［15］采用等離子體發(fā)射光譜法對(duì)國產(chǎn)和俄羅斯產(chǎn)哈蟆油無機(jī)元素的含量進(jìn)行了分析。

色譜分析法

薄層色譜法劉永鎮(zhèn)等［15］研究證實(shí),用丙酮提取物乙醚萃取后的殘留物,在石油醚∶醋酸乙酯展開的薄層層析中,其Rf值為，用展開劑苯∶乙醚∶甲醇，顯色劑測(cè)定,效果良好。李明剛等［10］采用苯∶乙醚∶甲醇為展開劑，茴香醛∶冰乙酸∶濃硫酸為顯色劑，對(duì)哈蟆油和中華大蟾蜍輸卵管進(jìn)行了鑒別。趙文英等［16］用丙酮連續(xù)回流提取法，以石油醚：醋酸乙酯為展開劑，36％的乙酸∶濃硫酸為顯色劑，展距20cm，分別在自然光及紫外光下，對(duì)不同來源的哈蟆油正品以及不同種類的偽品進(jìn)行了鑒別。目前，作者正在對(duì)哈蟆油進(jìn)行系統(tǒng)的薄層色譜研究，比較不同極性的溶劑和提取方法下哈蟆油的薄層效果從而建立哈蟆油系統(tǒng)的薄層色譜條件，建立哈蟆油專屬性鑒別方法。

高效液相色譜法李成義等［17］應(yīng)用HPLC測(cè)定了哈蟆油中磷脂的含量；多年來，作者對(duì)哈蟆油的有效成分進(jìn)行了較深入地研究，已分離出了多個(gè)化合物［18］，其中，十六烷酸膽甾醇酯為首次從哈蟆油中提取純化出來的，作者以十六烷酸膽甾醇酯為化學(xué)對(duì)照品，利用HPLC法對(duì)哈蟆油進(jìn)行了含量測(cè)定及其方法學(xué)的研究，為建立一個(gè)完整、科學(xué)的哈蟆油質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供依據(jù)［19］。李津明等［20］采用了反相高效液相色譜技術(shù)，對(duì)10批不同來源的林蛙油藥材建立了高效液相色譜指紋圖譜，從而提高了哈蟆油的質(zhì)量控制技術(shù)。

氣相色譜-質(zhì)譜法趙文英等［21］利用氣相色譜-質(zhì)譜法，對(duì)哈蟆油石油醚提取物分離出的脂肪酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)哈蟆油不飽和脂肪酸含量約占脂肪酸含量的40%；盧立明等［22］利用GC-MS對(duì)哈蟆油脂溶性部分的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，結(jié)果表明哈蟆油中含有多種不飽和脂肪酸和奇數(shù)碳原子脂肪酸。李成義等［17］利用GC-MS法，從吉林產(chǎn)哈蟆油中檢定出9種酸。其中亞油酸的相對(duì)百分含量為%,花生四烯酸的相對(duì)百分含量為%。劉玉翠等［23］利用GC-MS法對(duì)哈蟆油的一組脂溶性成分進(jìn)行分析,共分離鑒定了5種酯類化合物。季怡萍［24］用氣相色譜與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)哈士蟆油中的脂肪酸組成進(jìn)行了定性與定量分析,共鑒定出10種脂肪酸并用氣相色譜法作了定量。王秋雨等［8］利用氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定哈蟆油與青蛙油脂類物質(zhì)含量基本一致，約為6%，其中不飽和脂肪酸含量分別占其脂肪酸的%和%。

電泳分析法趙華英［25］采用PA-GE技術(shù),對(duì)哈士蟆油及其偽品:黑斑蛙、中華大蟾蜍的輸卵管進(jìn)行酯酶同工酶和可溶性蛋白質(zhì)的電泳分析。結(jié)果酯酶同工酶圖譜可見：哈士蟆油共有2條譜帶，A區(qū)1條三級(jí)帶，B區(qū)1條一級(jí)帶。黑斑蛙有7條譜帶，分布在B區(qū)和C區(qū)。中華大蟾蜍有2條譜帶，分布在B區(qū)和C區(qū)?？扇苄缘鞍踪|(zhì)電泳圖譜。可見哈士蟆油在C區(qū)有C2和C62條一級(jí)帶可與偽品鑒別。因?yàn)楹诎咄苤挥蠧3一級(jí)帶，而中華大蟾蜍C區(qū)無一級(jí)帶。曾明［26］、石俊英等［27］采用凝膠電泳法測(cè)得哈蟆油一級(jí)帶三條，二級(jí)帶兩條，三級(jí)帶一條，為鑒別哈蟆油與其易混品種雞內(nèi)金、蟾酥等提供了依據(jù)。新晨范文網(wǎng)

5生物鑒定法

放射性免疫分析法林紀(jì)嫻等［28］采用放射性免疫分析法對(duì)中國林蛙和中華大蟾蜍輸卵管中睪酮的含量進(jìn)行了分析；李成義［17］、白云等［29］先后采用了放射性免疫分析法測(cè)定了哈蟆油中激素的含量。

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)楊學(xué)干等［30］從中國林蛙、中華大蟾蜍以及鱈魚等組織材料中提取DNA，擴(kuò)增出約340bp的12SrRNA基因片段，測(cè)定其序列，并參考有關(guān)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)哈蟆油的鑒別引物HsmL1，HsmH1，用該鑒別引物擴(kuò)增蛙類原動(dòng)物的模板DNA時(shí)，只有中國林蛙和黑龍江林蛙的模板能得到陽性擴(kuò)增，其余樣品為陰性。因此該對(duì)引物能用于哈蟆油藥材來源的鑒別，對(duì)購自5個(gè)不同藥材商店的哈蟆油PCR鑒定結(jié)果表明，現(xiàn)市售商品哈蟆油有不同的材料來源，主要因?yàn)楣∮褪怯芍袊滞茌斅压芨芍贫?，這種以組織器官制成的藥材鑒定難度大，易用其它動(dòng)物相似的器官組織冒充,如黑斑側(cè)褶蛙、中華大蟾蜍、鱈魚等的輸卵管或精巢等加工品。該研究得到的鑒別引物能準(zhǔn)確地對(duì)該藥材的來源加以區(qū)別。

【參考文獻(xiàn)】

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［6］劉永鎮(zhèn)，崔順錦，南善姬.蛤蟆油與其