淺論二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆細胞模型的最佳條件篩選

淺論二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆細胞模型的最佳條件篩選【摘要】目的確定二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆(AD)細胞模型的最佳條件。方法利用細胞計數(shù)、MTT方法確立β淀粉樣蛋白(Aβ)25-35片段在建立AD細胞模型時的濃度及篩選二苯乙烯苷含藥血清作用的最佳濃度，分別觀察不同濃度血清及不同濃度Aβ25-35對AD細胞模型存活率的影響。結果各種血清以5%濃度組的細胞存活率最高。在5%血清濃度下，Aβ25-350μmol/L和5μmol/L濃度組中各含藥血清組細胞存活率均明顯高于正常大鼠血清組(或)，但在10μmol/LAβ25-35濃度時差異無顯著性。結論選用5μmol/LAβ25-35及5%血清濃度建立NG108-15AD細胞模型及藥效考察體系較為合適，在此條件下能客觀地評價二苯乙烯苷含藥血清的藥效。

【關鍵詞】二苯乙烯苷癡呆老年性β淀粉樣蛋白NG108-15細胞

Abstract:ObjectiveToconfirmtheoptimumconditionsofTSG-containingserumaffectoncellmodelofAlzheimer‘sdisease(AD).MethodsCellcountingandMTTtechniquewereusedtodeterminetheoptimumconcentrationofamyloidβ25-35(Aβ25-35)anddrug-containingseruminestablishingcellmodelofAD,thenobservedthecellsurvivalrateofthecellmodelaftertreatedwithdifferentconcentrationofrat‘sserumandofamyloidβ25-35,respectively.Results5%concentrationofserumresultedinthehighestcellsurvivalrateamongallkindsofserum.Atthe5%concentrationofserumcondition,thecellsurvivalrateofdrug-containingserumgroupswerehigherthanthenormalserumgroupat0μmol/Land5μmol/LconcentrationofAβ25-35(or),buthadnodifferenceat10μoml/Lconcentration.ConclusionsItistheoptimumconditiontoselect5μmol/LconcentrationofAβ25-35and5%concentrationofdrug-containingserumtoestablishtheNG108-15cellmodelofADandthebestsystemtoassessthedrugefficacy.UndertheseconditionscanbeobjectivelyassessedthedrugefficacyofTSG-containingserum.

Keywords:2,3,5,4‘-tetrahydroxy-stilbene-2-O-B-D-glycoside;dementia,senile;amyloidbeta-protein;NG108-15cells

用動物模型研究老年性癡呆能夠反映整體水平的變化以及行為和記憶功能的改變，但由于體內復雜因素的影響，對某些特殊類型細胞功能及細胞結構、酶、離子及其通道、受體的研究卻較困難。動物細胞的體外培養(yǎng)成功彌補了這一缺陷。利用細胞培養(yǎng)法建立AD細胞模型已經成為現(xiàn)代生物醫(yī)學研究AD的重要手段［1,2］。我們將β淀粉樣蛋白(Aβ)25-35作用于NG108-15神經細胞，建立AD細胞模型，研究二苯乙烯苷含藥血清對AD細胞模型的影響。本實驗主要探討建立AD細胞模型的Aβ25-35的最佳濃度和二苯乙烯苷含藥血清的最佳作用濃度，觀察在不同濃度Aβ25-35和不同濃度二苯乙烯苷含藥血清的細胞存活率?，F(xiàn)報道

1材料

動物

健康3月齡Wistar大鼠60只，雌雄兼用，體重200～250g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

主要藥品與試劑

二苯乙烯苷：由本教研室根據(jù)有關文獻［3,4］提??；石杉堿甲；Aβ25-35片段，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，青霉素(Penicillin)G，硫酸鏈霉素，MTT；HAT；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基。

主要儀器

CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，酶標儀。

實驗細胞株

NG108-15細胞：由廣西中醫(yī)學院鐘振國教授惠贈。

2方法

含藥血清的制備及實驗血清濃度的選擇

將健康的3月齡Wistar大鼠60只，隨機分為3組，每組20只：①正常對照組；②石杉堿甲組；③二苯乙烯苷組。各組根據(jù)成人治療量換算為大鼠用量，用高劑量灌胃。每天灌胃量/100g體重，二苯乙烯苷按/kg體重，石杉堿甲按/kg體重，正常血清組給相應體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃10天，于末次給藥后2h，用20%烏拉坦腹腔麻醉，腹主動脈抽血，離心分離血清，56℃滅活30min，無菌過濾，即得相應的含藥血清。將各組含藥血清和正常對照組血清分別加入HAT、雙抗和DMEM培養(yǎng)液，配成含5%、10%、20%的含藥血清和正常對照組血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)NG108-15細胞，以生存率為指標，選擇細胞生長狀態(tài)最好的血清濃度為實驗血清濃度。

Aβ25-35濃度的選擇

將Aβ25-35溶于高壓滅菌后的生理鹽水，配成250μmol/L母液備用。在篩選出最佳實驗血清濃度的基礎上，分別比較大鼠血清在Aβ25-350μmol/L、5μmol/L和10μmol/L濃度時的細胞生存率，確立Aβ25-35片段在建立細胞模型時的最佳濃度。

AD細胞模型的建立

將NG108-15細胞加入細胞增殖液，在10%CO2、37℃條件下培養(yǎng)1天，然后加入較適濃度Aβ25-35片段，繼續(xù)培養(yǎng)1天后，即建成AD細胞模型。以各含藥血清或含正常對照組血清DMEM培養(yǎng)液更換原培養(yǎng)液，仍加入上述較適濃度Aβ25-35片段以維持AD細胞模型。培養(yǎng)2天后進行觀察、分析。

細胞存活率觀察

細胞直接置于光學顯微鏡下觀察其形態(tài)及計數(shù)其存活率。在培養(yǎng)板每孔上下左右中5個視野各拍片1張，然后在照片上計算培養(yǎng)板各組細胞的數(shù)目，將最初播下的細胞數(shù)定為基數(shù)，然后將各組細胞與原播種細胞數(shù)相比得出各組結果。

MTT測定法

吸棄待測細胞培養(yǎng)孔內培養(yǎng)液，加無血清DMEM液100μl/孔，MTT液20μl，置于37℃、10%CO2條件下4h，出現(xiàn)藍色結晶后，加SDS-DMF100μl/孔，于37℃、10%CO2條件下過夜，用酶標儀于λ=570nm處測OD值。

統(tǒng)計方法

所有檢測結果以(±s)表示。用SPSS統(tǒng)計軟件分析，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，顯著性水平設在α=。

3結果

不同濃度血清對NG108-15細胞存活率的影響

見表1。5%和10%石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清細胞存活率明顯高于同濃度的正常大鼠血清；在20%濃度時組間無差異。同一組內不同血清濃度對細胞存活率進行比較，5%明顯高于10%和20%組，但10%和20%濃度組間卻無差別。結果表明，5%濃度的正常大鼠血清和各含藥血清對維持NG108-15細胞的良好生長狀態(tài)較為合適，故選用5%的血清濃度培養(yǎng)液供實驗用。表1不同濃度血清對NG108-15細胞存活率的影響注：同一種血清與5%濃度比較，a：；同一血清濃度與正常大鼠血清比較，b：，c：

5%濃度血清培養(yǎng)液中不同濃度Aβ25-35對NG108-15細胞存活率的影響

光學顯微鏡下觀察細胞計數(shù)結果

見表2。在5%血清濃度下，Aβ25-350μmol/L及5μmol/L濃度組中石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清細胞存活率明顯高于同濃度的正常大鼠血清；在10μmol/L濃度時組間無差異。同一血清組內不同Aβ25-35濃度對細胞存活率進行比較顯示：0μmol/L濃度組細胞存活率明顯高于5μmol/L和10μmol/L濃度組，石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清在Aβ25-355μmol/L濃度組細胞存活率比10μmol/L濃度組高。以上結果表明，二苯乙烯苷含藥血清在無Aβ25-35的毒性作用下，對正常細胞能促進增殖和維持良好的生長態(tài)勢。在Aβ25-355μmol/L濃度時，二苯乙烯苷和石杉堿甲含藥血清能保護Aβ對NG108-15細胞的毒性殺傷作用，但在Aβ濃度較高時則未能起到保護作用。表25%血清時，不同濃度Aβ25-35對NG108-15細胞存活率的影響注：Aβ25-35濃度相同時與正常大鼠血清比較，a：；Aβ25-35濃度不同時同類血清與0μmol/L濃度比較，b：；Aβ25-35濃度不同時同類血清與5μmol/L濃度比較，c：。

MTT法測定細胞存活率比較

見表3。在5%血清濃度下，Aβ25-350μmol/L及5μmol/L濃度組中石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清組的OD值明顯高于同濃度的正常大鼠血清，但在10μmol/L濃度時組間差異無顯著性。同一組血清內組間兩兩比較則顯示0μmol/L濃度Aβ25-35OD值最高，石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清在Aβ25-355μmol/L濃度OD值比10μmol/L濃度組高。以上結果與細胞計數(shù)法得出的結果一致。表3不同濃度Aβ25-35在NG108-15細胞以不同血清處理2天后的MTTOD值注：Aβ25-35濃度相同時與正常大鼠血清比較，a：；Aβ25-35濃度不同時同類血清與0μmol/L濃度比較，b：；Aβ25-35濃度不同時同類血清與5μmol/L濃度比較，c：。

4討論

大量的證據(jù)表明大腦神經原纖維纏結、老年斑、膽堿能神經元的大量缺失是AD的主要病理改變，同時在這些病變的病灶中發(fā)現(xiàn)有大量Aβ沉積物［5］。一般認為，Aβ或含Aβ順序的β淀粉樣蛋白前體的降解產物聚集沉積產生神經毒性作用是AD的病因；而神經元的死亡、纖維纏結的形成、血管的損害和癡呆的出現(xiàn)是Aβ沉積的直接結果［6～8］。因此，可把Aβ作為AD腦的生化標記物。Aβ25-35作為全長Aβ的最短有效毒性片段，作用于不同細胞系及實驗動物均顯示出與全長Aβ相近的毒性效應，可致培養(yǎng)細胞死亡［9,10］。故將Aβ25-35片段加入細胞培養(yǎng)液中造模是目前較常用的方法之一。鐘振國等［11,12］將Aβ25-35產物直接加入到培養(yǎng)中的NG108-15細胞中建立AD細胞模型，其細胞的形態(tài)學、死亡率、ChAT活性水平、SynapsinⅠ水平、Ach遞質釋放能力等與AD病理生理變化基本一致，故可用Aβ25-35誘導NG108-15神經細胞建立AD細胞模型。

本實驗為探討建立AD細胞模型及藥效考察體系的最佳條件的實驗，結果表明：過高的二苯乙烯苷含藥血清濃度能降低細胞的存活率，不利于細胞的增殖，同時造成血清的浪費；過低的Aβ25-35濃度達不到造模的目的，過高Aβ25-35濃度又會造成NG108-15細胞的大量死亡，不能靈敏地反映二苯乙烯苷含藥血清的藥效。經實驗證實：5μmol/LAβ25-35及5%血清濃度條件時，建立AD細胞模型及藥效考察體系較為合適，在此條件下，應用該細胞模型觀察發(fā)現(xiàn)，5%二苯乙烯苷含藥血清能有效地降低Aβ25-35片段對NG108-15神經細胞的損害，減少細胞的死亡率。其細胞存活率，與正常大鼠血清組比較差異具有顯著性，而與陽性對照藥石杉堿甲含藥血清組比較則無明顯差異。此細胞模型及藥效考察體系的最佳條件的確立，能靈敏、真實地反映藥效，為進一步考察二苯乙烯苷含藥血清的藥效打下堅實的基礎。

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