淺論二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆細(xì)胞模型的最佳條件篩選

淺論二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆細(xì)胞模型的最佳條件篩選【摘要】目的確定二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆(AD)細(xì)胞模型的最佳條件。方法利用細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT方法確立β淀粉樣蛋白(Aβ)25-35片段在建立AD細(xì)胞模型時(shí)的濃度及篩選二苯乙烯苷含藥血清作用的最佳濃度，分別觀察不同濃度血清及不同濃度Aβ25-35對AD細(xì)胞模型存活率的影響。結(jié)果各種血清以5%濃度組的細(xì)胞存活率最高。在5%血清濃度下，Aβ25-350μmol/L和5μmol/L濃度組中各含藥血清組細(xì)胞存活率均明顯高于正常大鼠血清組(或)，但在10μmol/LAβ25-35濃度時(shí)差異無顯著性。結(jié)論選用5μmol/LAβ25-35及5%血清濃度建立NG108-15AD細(xì)胞模型及藥效考察體系較為合適，在此條件下能客觀地評價(jià)二苯乙烯苷含藥血清的藥效。

【關(guān)鍵詞】二苯乙烯苷癡呆老年性β淀粉樣蛋白NG108-15細(xì)胞

Abstract:ObjectiveToconfirmtheoptimumconditionsofTSG-containingserumaffectoncellmodelofAlzheimer‘sdisease(AD).MethodsCellcountingandMTTtechniquewereusedtodeterminetheoptimumconcentrationofamyloidβ25-35(Aβ25-35)anddrug-containingseruminestablishingcellmodelofAD,thenobservedthecellsurvivalrateofthecellmodelaftertreatedwithdifferentconcentrationofrat‘sserumandofamyloidβ25-35,respectively.Results5%concentrationofserumresultedinthehighestcellsurvivalrateamongallkindsofserum.Atthe5%concentrationofserumcondition,thecellsurvivalrateofdrug-containingserumgroupswerehigherthanthenormalserumgroupat0μmol/Land5μmol/LconcentrationofAβ25-35(or),buthadnodifferenceat10μoml/Lconcentration.ConclusionsItistheoptimumconditiontoselect5μmol/LconcentrationofAβ25-35and5%concentrationofdrug-containingserumtoestablishtheNG108-15cellmodelofADandthebestsystemtoassessthedrugefficacy.UndertheseconditionscanbeobjectivelyassessedthedrugefficacyofTSG-containingserum.

Keywords:2,3,5,4‘-tetrahydroxy-stilbene-2-O-B-D-glycoside;dementia,senile;amyloidbeta-protein;NG108-15cells

用動(dòng)物模型研究老年性癡呆能夠反映整體水平的變化以及行為和記憶功能的改變，但由于體內(nèi)復(fù)雜因素的影響，對某些特殊類型細(xì)胞功能及細(xì)胞結(jié)構(gòu)、酶、離子及其通道、受體的研究卻較困難。動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)成功彌補(bǔ)了這一缺陷。利用細(xì)胞培養(yǎng)法建立AD細(xì)胞模型已經(jīng)成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究AD的重要手段［1,2］。我們將β淀粉樣蛋白(Aβ)25-35作用于NG108-15神經(jīng)細(xì)胞，建立AD細(xì)胞模型，研究二苯乙烯苷含藥血清對AD細(xì)胞模型的影響。本實(shí)驗(yàn)主要探討建立AD細(xì)胞模型的Aβ25-35的最佳濃度和二苯乙烯苷含藥血清的最佳作用濃度，觀察在不同濃度Aβ25-35和不同濃度二苯乙烯苷含藥血清的細(xì)胞存活率?，F(xiàn)報(bào)道

1材料

動(dòng)物

健康3月齡Wistar大鼠60只，雌雄兼用，體重200～250g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

主要藥品與試劑

二苯乙烯苷：由本教研室根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)［3,4］提取；石杉?jí)A甲；Aβ25-35片段，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，青霉素(Penicillin)G，硫酸鏈霉素，MTT；HAT；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基。

主要儀器

CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀。

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

NG108-15細(xì)胞：由廣西中醫(yī)學(xué)院鐘振國教授惠贈(zèng)。

2方法

含藥血清的制備及實(shí)驗(yàn)血清濃度的選擇

將健康的3月齡Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為3組，每組20只：①正常對照組；②石杉?jí)A甲組；③二苯乙烯苷組。各組根據(jù)成人治療量換算為大鼠用量，用高劑量灌胃。每天灌胃量/100g體重，二苯乙烯苷按/kg體重，石杉?jí)A甲按/kg體重，正常血清組給相應(yīng)體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃10天，于末次給藥后2h，用20%烏拉坦腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈抽血，離心分離血清，56℃滅活30min，無菌過濾，即得相應(yīng)的含藥血清。將各組含藥血清和正常對照組血清分別加入HAT、雙抗和DMEM培養(yǎng)液，配成含5%、10%、20%的含藥血清和正常對照組血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)NG108-15細(xì)胞，以生存率為指標(biāo)，選擇細(xì)胞生長狀態(tài)最好的血清濃度為實(shí)驗(yàn)血清濃度。

Aβ25-35濃度的選擇

將Aβ25-35溶于高壓滅菌后的生理鹽水，配成250μmol/L母液備用。在篩選出最佳實(shí)驗(yàn)血清濃度的基礎(chǔ)上，分別比較大鼠血清在Aβ25-350μmol/L、5μmol/L和10μmol/L濃度時(shí)的細(xì)胞生存率，確立Aβ25-35片段在建立細(xì)胞模型時(shí)的最佳濃度。

AD細(xì)胞模型的建立

將NG108-15細(xì)胞加入細(xì)胞增殖液，在10%CO2、37℃條件下培養(yǎng)1天，然后加入較適濃度Aβ25-35片段，繼續(xù)培養(yǎng)1天后，即建成AD細(xì)胞模型。以各含藥血清或含正常對照組血清DMEM培養(yǎng)液更換原培養(yǎng)液，仍加入上述較適濃度Aβ25-35片段以維持AD細(xì)胞模型。培養(yǎng)2天后進(jìn)行觀察、分析。

細(xì)胞存活率觀察

細(xì)胞直接置于光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)及計(jì)數(shù)其存活率。在培養(yǎng)板每孔上下左右中5個(gè)視野各拍片1張，然后在照片上計(jì)算培養(yǎng)板各組細(xì)胞的數(shù)目，將最初播下的細(xì)胞數(shù)定為基數(shù)，然后將各組細(xì)胞與原播種細(xì)胞數(shù)相比得出各組結(jié)果。

MTT測定法

吸棄待測細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)液，加無血清DMEM液100μl/孔，MTT液20μl，置于37℃、10%CO2條件下4h，出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶后，加SDS-DMF100μl/孔，于37℃、10%CO2條件下過夜，用酶標(biāo)儀于λ=570nm處測OD值。

統(tǒng)計(jì)方法

所有檢測結(jié)果以(±s)表示。用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)在α=。

3結(jié)果

不同濃度血清對NG108-15細(xì)胞存活率的影響

見表1。5%和10%石杉?jí)A甲和二苯乙烯苷含藥血清細(xì)胞存活率明顯高于同濃度的正常大鼠血清；在20%濃度時(shí)組間無差異。同一組內(nèi)不同血清濃度對細(xì)胞存活率進(jìn)行比較，5%明顯高于10%和20%組，但10%和20%濃度組間卻無差別。結(jié)果表明，5%濃度的正常大鼠血清和各含藥血清對維持NG108-15細(xì)胞的良好生長狀態(tài)較為合適，故選用5%的血清濃度培養(yǎng)液供實(shí)驗(yàn)用。表1不同濃度血清對NG108-15細(xì)胞存活率的影響注：同一種血清與5%濃度比較，a：；同一血清濃度與正常大鼠血清比較，b：，c：

5%濃度血清培養(yǎng)液中不同濃度Aβ25-35對NG108-15細(xì)胞存活率的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

見表2。在5%血清濃度下，Aβ25-350μmol/L及5μmol/L濃度組中石杉?jí)A甲和二苯乙烯苷含藥血清細(xì)胞存活率明顯高于同濃度的正常大鼠血清；在10μmol/L濃度時(shí)組間無差異。同一血清組內(nèi)不同Aβ25-35濃度對細(xì)胞存活率進(jìn)行比較顯示：0μmol/L濃度組細(xì)胞存活率明顯高于5μmol/L和10μmol/L濃度組，石杉?jí)A甲和二苯乙烯苷含藥血清在Aβ25-355μmol/L濃度組細(xì)胞存活率比10μmol/L濃度組高。以上結(jié)果表明，二苯乙烯苷含藥血清在無Aβ25-35的毒性作用下，對正常細(xì)胞能促進(jìn)增殖和維持良好的生長態(tài)勢。在Aβ25-355μmol/L濃度時(shí)，二苯乙烯苷和石杉?jí)A甲含藥血清能保護(hù)Aβ對NG108-15細(xì)胞的毒性殺傷作用，但在Aβ濃度較高時(shí)則未能起到保護(hù)作用。表25%血清時(shí)，不同濃度Aβ25-35對NG108-15細(xì)胞存活率的影響注：Aβ25-35濃度相同時(shí)與正常大鼠血清比較，a：；Aβ25-35濃度不同時(shí)同類血清與0μmol/L濃度比較，b：；Aβ25-35濃度不同時(shí)同類血清與5μmol/L濃度比較，c：。

MTT法測定細(xì)胞存活率比較

見表3。在5%血清濃度下，Aβ25-350μmol/L及5μmol/L濃度組中石杉?jí)A甲和二苯乙烯苷含藥血清組的OD值明顯高于同濃度的正常大鼠血清，但在10μmol/L濃度時(shí)組間差異無顯著性。同一組血清內(nèi)組間兩兩比較則顯示0μmol/L濃度Aβ25-35OD值最高，石杉?jí)A甲和二苯乙烯苷含藥血清在Aβ25-355μmol/L濃度OD值比10μmol/L濃度組高。以上結(jié)果與細(xì)胞計(jì)數(shù)法得出的結(jié)果一致。表3不同濃度Aβ25-35在NG108-15細(xì)胞以不同血清處理2天后的MTTOD值注：Aβ25-35濃度相同時(shí)與正常大鼠血清比較，a：；Aβ25-35濃度不同時(shí)同類血清與0μmol/L濃度比較，b：；Aβ25-35濃度不同時(shí)同類血清與5μmol/L濃度比較，c：。

4討論

大量的證據(jù)表明大腦神經(jīng)原纖維纏結(jié)、老年斑、膽堿能神經(jīng)元的大量缺失是AD的主要病理改變，同時(shí)在這些病變的病灶中發(fā)現(xiàn)有大量Aβ沉積物［5］。一般認(rèn)為，Aβ或含Aβ順序的β淀粉樣蛋白前體的降解產(chǎn)物聚集沉積產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用是AD的病因；而神經(jīng)元的死亡、纖維纏結(jié)的形成、血管的損害和癡呆的出現(xiàn)是Aβ沉積的直接結(jié)果［6～8］。因此，可把Aβ作為AD腦的生化標(biāo)記物。Aβ25-35作為全長Aβ的最短有效毒性片段，作用于不同細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均顯示出與全長Aβ相近的毒性效應(yīng)，可致培養(yǎng)細(xì)胞死亡［9,10］。故將Aβ25-35片段加入細(xì)胞培養(yǎng)液中造模是目前較常用的方法之一。鐘振國等［11,12］將Aβ25-35產(chǎn)物直接加入到培養(yǎng)中的NG108-15細(xì)胞中建立AD細(xì)胞模型，其細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、死亡率、ChAT活性水平、SynapsinⅠ水平、Ach遞質(zhì)釋放能力等與AD病理生理變化基本一致，故可用Aβ25-35誘導(dǎo)NG108-15神經(jīng)細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型。

本實(shí)驗(yàn)為探討建立AD細(xì)胞模型及藥效考察體系的最佳條件的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：過高的二苯乙烯苷含藥血清濃度能降低細(xì)胞的存活率，不利于細(xì)胞的增殖，同時(shí)造成血清的浪費(fèi)；過低的Aβ25-35濃度達(dá)不到造模的目的，過高Aβ25-35濃度又會(huì)造成NG108-15細(xì)胞的大量死亡，不能靈敏地反映二苯乙烯苷含藥血清的藥效。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：5μmol/LAβ25-35及5%血清濃度條件時(shí)，建立AD細(xì)胞模型及藥效考察體系較為合適，在此條件下，應(yīng)用該細(xì)胞模型觀察發(fā)現(xiàn)，5%二苯乙烯苷含藥血清能有效地降低Aβ25-35片段對NG108-15神經(jīng)細(xì)胞的損害，減少細(xì)胞的死亡率。其細(xì)胞存活率，與正常大鼠血清組比較差異具有顯著性，而與陽性對照藥石杉?jí)A甲含藥血清組比較則無明顯差異。此細(xì)胞模型及藥效考察體系的最佳條件的確立，能靈敏、真實(shí)地反映藥效，為進(jìn)一步考察二苯乙烯苷含藥血清的藥效打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

［1］HartmanRE,LaurerH,LonghiL,etal.ApolipoproteinE4influencesamyloiddepositionbutnotcelllossaftertraumaticbraininjuryinamousemodelofAlzheimer‘sdisease［J］.Neurosci,2002,22(23):10083-10087.

［2］XuTH,DingJ,ShiYL.Toosendaninincreasesfree-Ca2+concentrationinNG108-15cellsviaL-typeCa2+channels［J］.ActaPharmacolSin,2004,25(5):597-601.

［3］朱海升，蔡光明，劉鄂湖，等.大孔吸附樹脂分離純化何首烏有效成分二苯乙烯苷的研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22：269-273.

［4］江濤濤，歐陽臻，繆亞東，等.大孔樹脂吸附純化何首烏中二苯乙烯苷的研究［J］.中國中藥雜志,2006,31(8):646-649.

［5］HosodaT,NakajimaH,HonjoH.Estrogenprotectsneuronalcellsfromamyloidbetainducedapoptoticcelldeath［J］.Neuroreport,2001,12(9):1965-1970.

［6］DingY,QiaoA,WangZ,etal.Retinoicacidattenuatesβ-AmyloiddepositionandrescuesmemorydeficitsinanAlzheimer’sdiseasetransgenicmousemodel［J］.JNeurosci,2008,28(45):11622-11634.

［7］OakleyH,ColeSL,LoganS,etal.Intraneuronalβ-amyloidaggregates,neurodegeneration,andneuronlossintransgenicmicewithfiveFamilialAlzheimer‘sdiseasemutations:potentialfactorsinamyloidplaqueformation［J］.Neurosci,2006,26(40):10129-10140.

［8］WinklerJ,ConnorDJ,FrautschySA,