淺論ppGalNAcT2反義RNA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901生物學(xué)特性的影響

淺論ppGalNAcT2反義RNA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901生物學(xué)特性的影響【摘要】目的：研究人胃癌細(xì)胞SGC7901中多肽N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2(ppGalNAcT2)基因表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP2，TGFβ1表達(dá)的相關(guān)性，以及對(duì)細(xì)胞增殖和形態(tài)生物學(xué)特性的影響。方法：用兩個(gè)已構(gòu)建好的反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901，通過Ｇ418篩選，建立一系列旨在封閉胃癌細(xì)胞SGC7901ppGalNAcT2基因表達(dá)的亞細(xì)胞克隆。通過共聚焦顯微鏡，RTPCR檢測(cè)反義封閉ppGalNAcT2基因RNA表達(dá)后，胃癌細(xì)胞SGC7901中TGFβ1，MMP2表達(dá)水平，細(xì)胞增殖以及形態(tài)的變化。結(jié)果：反義封閉ppGalNAcT2基因表達(dá)后,胃癌細(xì)胞SGC7901ppGalNAcT2的表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，分裂增殖減慢。結(jié)果還顯示，反義封閉ppGalNAcT2基因表達(dá)可使TGFβ1，MMP2基因在mRNA表達(dá)水平均增加，提示ppGalNAcT2基因表達(dá)可能對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901浸潤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。結(jié)論：ppGalNAcT2可能在腫瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

【關(guān)鍵詞】SGC7901細(xì)胞；多肽N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶;基質(zhì)金屬蛋白酶;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

［Abstract］Objective:TostudytheeffectonthecellproliferationandthelevelofMMP2andTGFβ1intheSGC7901cellscausedbyantisenseblockingppGalNAcT2geneexpressionMethods：TheantisenseexpressingvectorsoftwodifferentlengthppGalNAcT2genesegmentswereconstructedandtransfectedintoSGC7901seriesofsubcellularclonesaimingatblockingofppGalNAcT2geneexpressionofSGC7901cellswereestablishedbyG418antisenseblocking,thecellswerefirsttestedwithfluorescenttheexpressionofppGalNAcT2，MMP2andTGFβ1genecellsgrowthwerestudiedwithRTeffectsofppGalNAcT2antisenseRNAontheproliferationofSGC7901cellsweretestedbyMTT.Results：TheresultsshowedthatppGalNAcT2levelinSGC7901cellswasobviouslyredudcedandthecellproliferationwasslowerafterantisenseindicatedthattheblockingofppGalNAcT2geneexpressionhadinfluenceonSGC7901cellwasalsorevealedthattheblockingofppGalNAcT2geneexpressioncouldincreasethemRNAandproteinlevelofMMP2andTGFβ1.Conclusion：TheresultsuggeststhatppGalNAcT2hasanimportantroleinthecellproliferation,invasionandmetastasisofcancer.

［Keywords］SGC7901cell;polypeptideNacetylgalactosaminyltransferase;matrixmetalloproteinase;transforminggrowthfactorβ1

糖蛋白的糖鏈按照其連接方式的不同，分為兩大類：一類稱N連接型糖鏈，又稱N聚糖，主要存在于血漿蛋白和細(xì)胞膜及胞質(zhì)的糖蛋白中。另一類稱O連接型糖鏈，又稱O聚糖，主要見于分泌液中的糖蛋白，俗稱黏蛋白［1］。腫瘤細(xì)胞含有富含O聚糖結(jié)構(gòu)域的膜結(jié)合黏蛋白類糖蛋白，這些糖蛋白的基因表達(dá)具有細(xì)胞特異性并且在腫瘤細(xì)胞中常發(fā)生變異。有關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的研究，以往人們較多地關(guān)注參與N糖苷鍵連接有關(guān)的酶，近年來隨著O糖基化相關(guān)酶新基因的發(fā)現(xiàn)和克隆，有關(guān)O糖基化產(chǎn)生的糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的研究受到廣泛重視。多肽:N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶是O糖鏈合成第一步的糖基轉(zhuǎn)移酶，ppGalNAcT2是該家族中組織分布及底物譜較廣的成員，很有可能是O糖鏈合成的限速酶，有著重要的生物學(xué)意義［2］。

為了深入研究ppGalNAcT2的生物學(xué)功能，我們成功地構(gòu)建了ppGalNAcT2反義表達(dá)質(zhì)粒載體，反義封閉ppGalNAcT2基因表達(dá)［3］；我們也成功地構(gòu)建了ppGalNAcT2的RNA干擾真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞得到穩(wěn)定的ppGalNAcT2基因剔除細(xì)胞株［4］。為探討ppGalNAcT2在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及浸潤轉(zhuǎn)移中的作用，本研究將ppGalNAcT2反義重組載體運(yùn)用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞SGC7901，得到封閉胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞ppGalNAcT2基因表達(dá)的亞細(xì)胞克隆，并對(duì)其生長(zhǎng)繁殖及浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基質(zhì)金屬蛋白酶和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)進(jìn)行了初步研究。

1材料與方法

材料

人胃癌細(xì)胞株SGC7901為本室保存。反義重組載體pEGFPFDT2和pEGFPFXT2由本室構(gòu)建保存。RPMI1640培養(yǎng)基購自GibcoBRL公司，RTPCR試劑盒購于Promega公司，轉(zhuǎn)染試劑盒G418選擇性抗生素購于Roche公司。PCR引物為上海博亞公司合成。NBT/BCIP染色試劑盒為華美生物工程公司產(chǎn)品，antihTGFβ1、antihMMP2及βactin單抗均為R&D公司產(chǎn)品。

方法

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞pEGFPFDT2和pEGFPFXT2重組載體分別是將T2全長(zhǎng)序列1716bp和T2序列中的一片段753bp經(jīng)酶切后反向連接入pEGFPC1載體中，分別形成反義重組載體pEGFPFDT2和pEGFPFXT2。轉(zhuǎn)染前將SGC7901細(xì)胞接種于24孔板，加入不同濃度的G418觀察細(xì)胞的死亡情況，確定最低致死濃度。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶(1×106/ml)，于37℃，5％CO2孵箱中孵育12h后，按FUGENE6介導(dǎo)轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞的方法，將純化的重組質(zhì)粒和陰性空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞。72h后加入G418溶液至終濃度為600mg/L，培養(yǎng)2周左右直到出現(xiàn)抗G418細(xì)胞克隆。

共聚焦顯微鏡觀察將蓋玻片置于6孔板中，把轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞培養(yǎng)于其中，待細(xì)胞長(zhǎng)到30%～40％的匯合度時(shí)棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕淋洗后，每孔加1ml4％低聚甲醛固定半小時(shí)后，吸出低聚甲醛，用PBS洗2遍，封片后置于共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒所表達(dá)的GFP熒光。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了反義重組載體pEGFPFDT2和pEGFPFXT2的細(xì)胞株分別命名為SGC7901，SGC79010，SGC7901FDT2，SGC7901FXT2，將4種細(xì)胞置于顯微鏡下，觀察其形態(tài)的變化，并拍照記錄。

相關(guān)基因的檢測(cè)細(xì)胞總RNA的提取采用Trizol一步法。以所得到的細(xì)胞總RNA為模板，使用Promega公司的試劑盒進(jìn)行RT反應(yīng)，得到cDNA。選用βactin為內(nèi)對(duì)照，以各種細(xì)胞株的總RNA的RT產(chǎn)物為模板同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)轉(zhuǎn)染反義ppGalNAcT2的SGC7901細(xì)胞ppGalNAcT2，TGFβ1，MMP2等相關(guān)基因表達(dá)的變化。PCR反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性4min，94℃變性50s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10min。PCR引物序列及預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如下。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)整到一定濃度后，接種于96孔板上，每孔加200μl細(xì)胞懸液，每隔24h隨機(jī)取4孔，各加MTT50μl，5h后小心吸去液體，加二甲基亞砜(DMSO)150μl，待顯色后轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度值(490nm)。以第1天的光密度值為1以后各天顯示值為與第1天之比值，作生長(zhǎng)曲線圖，觀察細(xì)胞增殖變化。

2結(jié)果

共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

在共聚焦顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，并發(fā)現(xiàn)GFP綠色熒光都集中于胞質(zhì)中，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。表1PCR引物序列

轉(zhuǎn)基因細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

熒光顯微鏡下可以看到轉(zhuǎn)染了反義RNA載體的細(xì)胞形態(tài)有所變化，相對(duì)于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了空載體的細(xì)胞其形態(tài)更顯得梭長(zhǎng)，提示轉(zhuǎn)染反義重組載體可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)特性(圖2)。

轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的變化

結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了pEGFPFDT2和pEGFPFXT2細(xì)胞ppGalNAcT2的mRNA表達(dá)明顯降低，而TGFβ1和MMP2的mRNA表達(dá)水平均相對(duì)增加(圖3)。顯示ppGalNAcT2可能與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

3討論

ppGalNAcT及其家族作為黏蛋白O糖基化的起始酶，可能與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們觀察了ppGalNAcT2在8種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)譜后發(fā)現(xiàn)［3，5］，在人胃癌細(xì)胞株SGC7901中，ppGalNAcT2的表達(dá)較其他細(xì)胞要高。本研究通過轉(zhuǎn)染表達(dá)ppGalNAcT2反義RNA的質(zhì)粒，成功獲得了ppGalNAcT2表達(dá)受抑制的人胃癌細(xì)胞克隆，為研究該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＿M(jìn)一步的相關(guān)功能研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了ppGalNAcT2反義RNA的質(zhì)粒的SGC7901細(xì)胞ppGalNAcT2mRNA表達(dá)水平降低，TGFβ1，MMP2的mRNA表達(dá)水平均相對(duì)增加。由于TGFβ1，MMP2都與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移及增殖相關(guān)，因此推測(cè)ppGalNAcT2與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移及增殖密切關(guān)聯(lián)。

關(guān)于轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞因子，近年來研究較多的有IGFⅡ，TGFβ，EGF，IL6等。TGFβ1基因被認(rèn)為參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生等過程，在許多腫瘤組織中高表達(dá)。TGFβ1可促進(jìn)某些腫瘤細(xì)胞的局部浸潤或腹膜播散，并削弱免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的排斥效應(yīng)［6］。TGFβmRNA表達(dá)受多種因素的影響，近年的研究發(fā)現(xiàn)TGFβmRNA的水平升高似乎與高糖的程度呈正相關(guān)［7］，Ziyadeh等在體外研究中證實(shí)，高糖增強(qiáng)系膜細(xì)胞TGFβmRNA的表達(dá)及活性，而在糖尿病研究中也發(fā)現(xiàn)非酶糖基化產(chǎn)物可促進(jìn)TGFβ1mRNA的表達(dá)。本研究中轉(zhuǎn)染了表達(dá)ppGalNAcT2反義RNA的質(zhì)粒的SGC7901細(xì)胞TGFβ1的表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載的細(xì)胞。可能的原因是由于抑制了細(xì)胞內(nèi)ppGalNAcT2的表達(dá)，酶促糖基化減少，而非酶糖基化增加，這樣同時(shí)增加了糖濃度和非酶糖基化產(chǎn)物。這兩個(gè)因素可促進(jìn)TGFβ1mRNA表達(dá)相對(duì)增加。而TGFβ1又與MMP的表達(dá)密切相關(guān)，TGFβ1能誘導(dǎo)人類細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄出高水平的MMPsmRNA［8］。有報(bào)道稱，在轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)TGFβ的過表達(dá)能抑制良性皮膚瘤的形成，而對(duì)于皮膚癌卻能促進(jìn)其浸潤轉(zhuǎn)移，并證實(shí)是MMPs合成增加所致［9］。在本研究中，ppGalNAcT2反義RNA能抑制ppGalNAcT2的表達(dá),而ppGalNAcT2表達(dá)水平的降低促進(jìn)了TGFβ1的表達(dá)，進(jìn)而可能促進(jìn)MMPs的合成。

TGFβ1是具有雙重調(diào)節(jié)作用的因子，體外實(shí)驗(yàn)證明TGFβ1是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的主要負(fù)性調(diào)控因子，TGFβ1與細(xì)胞表面受體結(jié)合，通過p53和PRB的低能磷酸化，抑制cmyc的表達(dá)，使細(xì)胞分裂停止，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［10,11］。在本研究中，推測(cè)ppGalNAcT2的減少導(dǎo)致TGFβ1的合成增加進(jìn)而減慢了細(xì)胞的生長(zhǎng)。

我們的工作還觀察到ppGalNAcT2對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分的黏附能力有影響［12］，因而有關(guān)ppGalNAcT2在整體動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)、浸潤與轉(zhuǎn)移過程中的作用值得進(jìn)一步研究。

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