蛋白質(zhì)的方法

蛋白質(zhì)的研究方法

生物化學(xué)教研室2010-101主要內(nèi)容蛋白質(zhì)對(duì)象的選擇和樣品的獲取蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)生物功能檢測(cè)

2蛋白質(zhì)對(duì)象的選擇和樣品的獲取3

一、研究對(duì)象的選擇無論何種來源的生物材料一般都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)分子；在一種生物組織中，同時(shí)又存在著多種蛋白質(zhì)組分。雖然它們都具有肽鏈結(jié)構(gòu)，但在分子大小、極性以及電荷上會(huì)有所差異。

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選擇研究蛋白的原則：在組織中含量比較高相對(duì)比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)（如血液中的Hb；肌肉中的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白等）從模式生物基因組測(cè)序結(jié)果來看，每一種生物有機(jī)體內(nèi)都還有大量的蛋白質(zhì)（50％左右）從來沒有被研究過。5獲取蛋白樣品的方法：

直接從生物組織中提純蛋白—為主根據(jù)基因組測(cè)序獲得的信息

6應(yīng)用各種分辨效果好的化學(xué)及物理化學(xué)方法7直接從生物組織中提純蛋白——蛋白質(zhì)的分離純化包括以下過程：1.破碎生物組織，并用適當(dāng)?shù)木彌_液將蛋白質(zhì)抽提出來；2.將有關(guān)的蛋白質(zhì)分級(jí)沉淀下來;

（鹽析法或有機(jī)溶劑法）3.應(yīng)用層析法或電泳法使它們各自分開；4.蛋白質(zhì)結(jié)晶；5.蛋白質(zhì)純度鑒定和含量測(cè)定。8根據(jù)基因組測(cè)序獲得的信息

（1）可以獲得所要研究的特定蛋白質(zhì)的AA序列。

先根據(jù)推出的AA序列合成對(duì)象蛋白中的一段肽，用它去獲得有關(guān)的抗體，然后用抗體去探測(cè)蛋白質(zhì)的存在，甚至可以用抗體通過親和層析純化對(duì)象蛋白9（2）去獲得有關(guān)基因的cDNA全序列，然后通過重組DNA技術(shù)去表達(dá)重組蛋白。有偏差，甚至完全是假象。即使推測(cè)得到的蛋白質(zhì)編碼信息是對(duì)的，在細(xì)胞內(nèi)還存在轉(zhuǎn)錄后的RNA加工，翻譯后的蛋白質(zhì)的修飾和加工等基因序列上目前還無法反映的信息。10制備過程中注意事項(xiàng)：要求自始至終保持在天然狀態(tài)避免一切過激因素--如過酸或過堿，高溫，重金屬等的影響。2.通常都在低溫條件下操作。3.盡可能使樣品中蛋白質(zhì)的濃度維持在較高水平。11二、細(xì)胞的破碎

少數(shù)蛋白質(zhì)---存在于細(xì)胞外面（如血液和體液中）大多數(shù)蛋白質(zhì)---都存在于細(xì)胞的里面。

一般固形生物材料首先都必須加以破碎，以釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組分。

生物材料必須新鮮要求：1.材料-80℃2.或者制成干粉（丙酮）3.低溫存放12破碎的方法：機(jī)械破碎法：利用機(jī)械力的攪切作用，使細(xì)胞研碎高速攪切器、玻璃勻漿器、家用攪肉器、研缽、玻璃珠高速勻漿器以及靜壓器（高壓破碎）。2.滲透破碎法：利用低滲條件，使細(xì)胞溶脹破碎。紅血球放于水中，便發(fā)生自溶。13*抽提作用：生物材料在破碎的過程中，通常被浸在適當(dāng)?shù)木彌_液中，使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)等內(nèi)容物釋放到這種溶液中去。143.交替凍融法：

生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。4.超聲波法：

利用超聲波震蕩，使細(xì)胞膜上所受張力不均而解體。5.酶消化法：

利用蛋白酶、溶菌酶、蝸牛復(fù)合酶等對(duì)細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的分解作用，使它們解體15三、獎(jiǎng)去污宮劑處膨理溶跨解膜弄蛋白膜蛋襖白的邀提取推與細(xì)父胞質(zhì)皆蛋白務(wù)，核束蛋白唉提取甘不同屬之處熔在于翼它是鏡嵌在講膜中猛的，疼水溶跑性不歐好，單基本淘方法鈴就是扁用不代同的蘿離心冶速度臣去掉切胞質(zhì)羅蛋白短等，卻最后而用去江污劑情把蛋絡(luò)白從車膜中聞釋放嘗出來軋。膜蛾蛋白站分離暈純化暮的重吩要步劣驟是叔選擇褲適當(dāng)現(xiàn)的增框溶用斜表面足活性訓(xùn)劑16膜蛋爹白的攔處理買：復(fù)誦雜細(xì)胞雄膜的即結(jié)構(gòu)17按其誤所在位置大體承可分翻為：兩種袖類型牲外地周蛋花白（通過洞次級(jí)蘿鍵和左外膜扛脂質(zhì)腎的極性豆頭螯煎合在渾一起撲）固有盞蛋白外周禽蛋白--襪-選擇健適當(dāng)演離子盤強(qiáng)度川及PH的含多有ED腹TA的緩沖偏液抽喘提（逮高鹽蟻溶液種）固有陣蛋白--御-嵌合糧在膜救雙層鑒中，秋它通弊過疏水拿作用與膜內(nèi)玻部脂伍質(zhì)層的疏魔水性饒尾部耳相結(jié)粱合，具有α螺旋菌結(jié)構(gòu)。18去污果劑：一類址具有親水孝性頭領(lǐng)部疏性妨尾巴的雙獲親性務(wù)（am蹄ph淡ip俊at怪hi衡c）脂命類分漆子作用耀：既可訪以破浮壞細(xì)廣胞的磷脂除雙層設(shè)結(jié)構(gòu)，又緊可以晶與具挽有疏偷水性瓦表面挽的膜蛋陡白結(jié)胳合，從備而阻死止釋句放出晃來的撇膜蛋周白通陸過疏粒水相彎互作債用形瘦成大辯的、規(guī)可沉萍淀的預(yù)聚集賺體。19有的去污雜劑的證親水石性頭朋部可度離子煌化（即拐含有踩一帶鳥電基渡團(tuán)）如：脫氧捎膽酸允鈉（so錯(cuò)di勻umde娃ox庸yc疫h(yuǎn)o千la扯te）十二疾烷基執(zhí)硫酸泊鈉（so內(nèi)di旱umdo紫de數(shù)cy框ls毀ul懶fa帳te，SD印S）有的去污劑遣不能陵解離頸，所狂以分守子中延缺少歐帶電副基團(tuán)，屬如報(bào)：Tr消it屆on柴X鈴-1良00，辛基鑰葡萄凱糖苷(oc臘ty雖lg巨lu耀co召si更de）20臨界棟微團(tuán)波濃度（cr殿it蟻ic晶al反m勸ic率el卸le檢c枕on濃ce柏nt跪ra犧ti若on，CM嘴C)：每一轟種去徹污劑塞都具濤有一蝴特征幣性的CM信C。CM親C值與傷其分駝子中疏水燙部分與親水品部分的結(jié)構(gòu)有杜關(guān)例。當(dāng)[去污居劑]低于孩此值門的時(shí)鮮候，掏去污漂劑分屠子在螞水溶載液中混將不霧形成崖微團(tuán)宵，達(dá)折到此祖值的呆時(shí)候艙，微如團(tuán)開跡始形僅成。21離子浩化去夏污劑潛（SD筆S）：其“疏水摸尾巴”破蹤蝶壞蛋融白質(zhì)靈分子矩的疏封水性啟部分方的結(jié)牢構(gòu)，多其帶違電的我“頭部”破向壞蛋岸白質(zhì)宗分子尾中的男氫鍵作和離京子鍵候。作用職的結(jié)剪果是：使任嶺何蛋諒白（揪不管房誠(chéng)是膜童蛋白掘還是磨水溶亭性蛋輔白）如都發(fā)生退完全躍變性，并溶解盆在水溶液介中，套同時(shí)失去膽生物尿活性。在部手分情跟況下兩，當(dāng)耕去污防劑被衡透析竟掉后瞎，蛋吵白質(zhì)爹可以盆復(fù)性璃并恢中復(fù)生抽物活峰性。22SD賤S-聚丙耕烯酰拒胺凝袋膠電賢泳（SD組S-po訪ly批ac評(píng)ry宴la仁mi姑dege卻l閉el駛ec嶼tr胞op息ho店re婚si盟s，SD謙S-梅PA艷GE）：就是頸利用SD矮S的這擊種結(jié)紛合在姥整個(gè)旗蛋白逆分子裂上，菊并使識(shí)蛋白叫完全行變性域的特康性。這樣省經(jīng)過SD陽S變性漲的蛋霞白質(zhì)駝在電強(qiáng)場(chǎng)中荷完全按大垂小分離俗開。23非離卵子去牲污劑：相對(duì)表溫和奶，一遭般不會(huì)蠻使蛋去白質(zhì)用變性。只潮是將羊蛋白跟質(zhì)分帥子從個(gè)膜上際溶解乎下來蹦而已澡。當(dāng)[去污葛劑]＜其CM倚C值的砌時(shí)候宣，去忠污劑當(dāng)分子晚與膜算蛋白慘表面位的疏血水區(qū)蛋域結(jié)爐合，跪使蛋贊白質(zhì)販在水壺溶液楚中溶群解而友不聚轎集。當(dāng)[去污死劑]≧其CM塔C值的勢(shì)時(shí)候舟，去知污劑滋分子她將與熊膜磷系脂一婚起形銹成混把合微方團(tuán)，臂膜蛋榴白以鄙整合圈在微姐團(tuán)中紅的形圈式存浸在。一般籃選擇事非離寧子去械污劑來保持叼膜蛋輩白生紅物活榨性242526四、急蛋白澡分子攀的穩(wěn)我定防止旗蛋白雞質(zhì)分爹子可娃能被符同時(shí)年釋放傘的蛋住白質(zhì)暫水解蹲酶降鏟解、Pr空間矛結(jié)構(gòu)里可能竄被溫錫度或危化學(xué)痛試劑呢等環(huán)稀境因館素破厚壞而減喪失雞生物領(lǐng)學(xué)活甲性等笑。處理：需乒要在亦緩沖貞液中券加入融蛋白遲酶抑虧制劑水；在低祝溫下握操作略；加入外穩(wěn)定盞劑(如甘胖油等拼）．27五、剖細(xì)胞公碎片晶的去基除——離心(密ce敘nt勉ri鹿fu關(guān)ga雷ti鑒on隊(duì))原理慨：懸牌浮在著溶液恐中的災(zāi)兩個(gè)窮或多決個(gè)不廣同質(zhì)踩量或黎密度帆的顆辯粒（毯如細(xì)厘胞、四細(xì)胞充器、乘大分刮子復(fù)吩合體吉、或沾分子我等）限沉降亂到試瓶管的燈底部限的速賤度是饒不一車樣的纏，質(zhì)量越衣大、寧或密乒度越開高沉賄降的就速度們?cè)娇熵?fù)。沉淀烏：固礙體性耍的細(xì)逝胞碎旨片和估細(xì)胞嚷器沉平降到克離心閣管的底部溫形成嬌；上清羅：絕免大多射數(shù)蛋繩白分喬子或罵蛋白撐復(fù)合障體保騰留在煙細(xì)胞抽提舍液中租即上肢清中鍵．28六、為目標(biāo)義蛋白攔質(zhì)的纏分離槽、純暖化--惑--圾-蛋白延質(zhì)的天分級(jí)討沉淀胞和層喊析分辜離將不而同蛋凱白質(zhì)巨分開鞏的性痛質(zhì)主啊要包縣括：分子齒量的劈燕大小帶電避情況水溶寶性與某堤種物格質(zhì)的使特異駕高親混和力正等29（一遵）蛋驗(yàn)白質(zhì)抹的分沸級(jí)沉岸淀常用谷的方燈法有及：鹽析芽法有機(jī)廈溶劑扣法30蛋白緣瑞質(zhì)的采膠體護(hù)性質(zhì)芽：蛋白塑質(zhì)顆圈粒表調(diào)面多俱為親疾水基扶團(tuán)，品可吸免引水酷分子學(xué)，使紅顆粒具表面旗成有族一層形水膜，蛋鏟白質(zhì)哨顆粒根相互嶺隔開貢，不滋會(huì)聚勻集成繪大顆閘粒而饒沉淀材。此外呀，蛋喇白質(zhì)五表面罷可帶輩有電袖荷，閱可起便膠粒茅穩(wěn)定蛛的作用胡。若去泛除蛋傳白質(zhì)承膠體衛(wèi)表面話電荷什和水雄化膜治兩個(gè)豈穩(wěn)定別因素陜，療蛋白葡質(zhì)極只易從葬溶液津中析歌出鹽析阻法31#32鹽析樣法概念：將中性政鹽加貿(mào)入蛋央白質(zhì)簽溶液違，破供壞水張化膜宴和電秋荷而咳使蛋愚白質(zhì)脂沉淀欣，叫鎮(zhèn)鹽析朱。各扇種蛋嗎白質(zhì)解鹽析侵所需渡的鹽挽濃度蠶及PH不同哥，加組入不霉同濃子度的勒中性尚鹽可使各貍種蛋團(tuán)白質(zhì)堵依次醬分別肌沉淀車出來巴。優(yōu)點(diǎn)逆：操如作簡(jiǎn)蓋便對(duì)易悠變性爬的蛋顧白質(zhì)籃有一尖定的妹保護(hù)年作用猛，適用缺范圍臺(tái)十分壞廣泛更。缺點(diǎn)休：分襲辨能犁力差呈，純抹化倍子數(shù)低331.基本極原理在蛋幕白質(zhì)怕水溶六液中棵添加浸無機(jī)摸鹽，白可以播產(chǎn)生濟(jì)兩種影響白：(1秧)鹽離幣子與Pr分子中的番極性陜基團(tuán)離子慨基團(tuán)踐作盆用降低Pr分子單的活拆度系痕數(shù)，迫趨使奏其溶狂解度磨。(2蜂)鹽離繭子也與水這種遇偶極偽分子驗(yàn)作用賠，使我水分倒子的結(jié)活度降注低，擴(kuò)導(dǎo)致Pr水合工程度道的減孔少，詠從而尊趨使Pr溶解度機(jī)。34*鹽溶伯（sa招l(wèi)t斤in涂g餓in仗)--當(dāng)溶效液中凈的鹽廊離子否強(qiáng)度觀比較凍低的券時(shí)候而，蛋維白質(zhì)斷的溶撞解度號(hào)會(huì)隨窯著鹽跑濃度句的增釣加而兵增加股，這肉種現(xiàn)偷象叫代做～.*鹽析宇（sa始lt蔑in之g蔬ou鞠t禾)-仁-但當(dāng)瞎溶液壞中的痰鹽離秘子強(qiáng)閱度比葡較高露的時(shí)侵候，碎蛋白糠質(zhì)的怨溶解劣度會(huì)握隨著素鹽濃價(jià)度的藏增加嶄而降臨低，辨這種跟現(xiàn)象柏叫做～.一定培的鹽汗?jié)舛葒@下，績(jī)每一頃種蛋銀白都界有一度不同順的特悟異溶泊解度袍。35影響凈鹽析舊作用喪的因蔑素（1）鹽其的種席類（2）PH和溫吊度#（3）蛋兩白質(zhì)恒濃度%36（1）鹽縱的種規(guī)類對(duì)同襯一種Pr而言學(xué)，價(jià)數(shù)調(diào)愈高的鹽逗離子壤，鹽寶析能問力也愈壺強(qiáng):PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CH哪OH粥CO共O-）2＞AC－＞CL－＞NO3-＞Br-＞I-＞CN駝S-K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+負(fù)離息子價(jià)圖數(shù)較脹高的職中性限鹽（如吩硫酸鄰鹽、礎(chǔ)磷酸涌鹽等誼）的Ks值常窗較一雹價(jià)中羨性鹽搬的Ks值高層。Ks陰:鹽析搖常數(shù)禮（價(jià)亮數(shù)較春高時(shí)管，Ks值也錄較大榴）。石代表識(shí)鹽析睜的效認(rèn)率，亮是與Pr及鹽是種類架有關(guān)奇的特摩性常鳥數(shù)。37硫酸規(guī)銨（常呢用鹽仙析劑誕）優(yōu)點(diǎn)煩：鹽策析能蛾力較麻強(qiáng)具有蘿較高央的溶封解度較低贈(zèng)的溶赴解度啊溫度知系數(shù)價(jià)格象低廉不產(chǎn)慚生副想作用嚴(yán)。缺點(diǎn)香：緩策沖能憂力較庫(kù)差PH難控榮制38（2）PH和溫柱度S。代各表蛋支白質(zhì)醫(yī)在無匯機(jī)鹽本溶液業(yè)中的直溶解誘度除取側(cè)決于Pr的種熊類，都還受PH及溫逝度影搞響:PH燙=P續(xù)I時(shí)，S。的數(shù)糠值極貼小S。隨溫肺度增聚加而浙減低南。鹽析朱過程陶中，闖若增徑高溫交度，盡有助受于Pr的析維出。#39（3）蛋峰白質(zhì)催濃度[P券r]較高，在在較低墾無機(jī)勸鹽濃向度時(shí),蛋白快質(zhì)便疊開始析戀出，朵鹽析沈界限投比較絞寬。[P夾r]較低，需翠要無薪機(jī)鹽趣的濃危度也客高，尺即鹽琴析界限傍變窄洲。40蛋白沸質(zhì)濃店度愈桂高，稱所需沃鹽的阿飽和簽度極召限愈口低。但蛋認(rèn)白質(zhì)袋濃度僑愈高景時(shí)，純其他罪蛋白片質(zhì)的飽共沉慶淀作撞用也愈臨強(qiáng)所以儀當(dāng)?shù)八踪|(zhì)凳溶液牽太濃俊時(shí)，晝應(yīng)適繞當(dāng)稀勸釋，通常砍在2.輪5～3.提0％之間怨比較傻合適士。411.基本瀉原理（1）在PI附近瘡，Pr主要診以中蘆性離復(fù)子形巧式存曲在。華此時(shí)裁若添辰加有機(jī)有溶劑宿，由林于有機(jī)腐溶劑可使蛙溶液電離常數(shù)減小蠻，增像強(qiáng)了中性子離子察間靜抵電引匙力，暴從而響使分塊集合奏而沉幫淀出糊來。（2）有機(jī)災(zāi)溶劑本身雄的水稈合作決用會(huì)私破壞Pr表面亦的水逮合層死，也促使Pr變得甩不穩(wěn)悉定而掉聚集緞析出.常用苦的有庸機(jī)溶饒劑：沙乙醇賢和丙抽酮有機(jī)險(xiǎn)溶劑鴉法分辨賞力比栗鹽析斧方法慕高，頭提純井效果筐好422.影響趨有機(jī)筐溶劑跌沉淀Pr的因藥素（1）PH值PH柔=P疊I時(shí)刃蛋白易質(zhì)的債溶解育度最聽低。葉按PI來調(diào)怠節(jié)PH值，有利往于分備離。（2）蛋涂白質(zhì)櫻濃度[P俯r]越高角，加炎入一慌定量后有機(jī)懼溶劑肚后，Pr析出別越多坐。此時(shí)蔽溶液州的介電澆常數(shù)也相響應(yīng)提磁高，市可以洋減少Pr的變子性。[P莖r]越高,P充r分子智間作餡用引住起的般共沉廁淀現(xiàn)更象也肯顯著增強(qiáng)儲(chǔ)，這停樣分拴離效郊果差榴，不真利于伸分級(jí)丟沉淀臟。只有闖選擇撕恰當(dāng)攏的[P艷r]才有哈可能派獲得黨良好給的分張高效慮果。43（3）離峽子強(qiáng)槽度中性梯鹽的盤加入貸能促尺使Pr在有眼機(jī)溶建劑中爽溶解捎，并且魂能防劈燕止Pr的變端性。釀但含膝鹽過博多，濤卻會(huì)須使Pr過度壘析出更，不協(xié)利于蝴分級(jí)口沉淀直。一般纏∠0.到05咬M的稀宰鹽溶儉液。（4）多之價(jià)陽絞離子Pr與多慈價(jià)的癢陽離頭子如您（Zn2+、Cu2+等）老能結(jié)合成稀復(fù)合兼物。右這種顛復(fù)合屆物在既有機(jī)麥溶劑粉中往若往使Pr溶解儀度變寶小。44常溫鴿下有廟機(jī)溶志劑可屠使蛋乖白質(zhì)斗變性悄，低溫驢條件下可典減慢璃變性在速度見。因陪此用肌有機(jī)池溶劑圖沉淀鄉(xiāng)豐蛋白鈔質(zhì)時(shí)年應(yīng)在筑低溫配條件六下進(jìn)盞行。如利尺用丙昆酮沉嘴淀蛋嶺白質(zhì)紗時(shí)，騰必須滔在0～4℃低溫臂下進(jìn)帖行，譜丙酮寧用量-般10倍于英蛋白累質(zhì)溶亦液體脊積。余蛋白謝質(zhì)被于丙酮顆沉淀辦后，舒應(yīng)立擊即分培離，霉否則野蛋白氏質(zhì)會(huì)泊變性皮。缺點(diǎn)仍：易使矛酶和腎具有赤活性錫的蛋曬白質(zhì)屈變性股。故宋操作障時(shí)要良求條辱件比誤鹽析銜嚴(yán)格棍。對(duì)醋于某鮮些敏海感的吹酶和濤蛋白穗質(zhì)，爆使用解有機(jī)譯溶劑扛沉淀取尤其釣要小豈心。45(二）蛋白功質(zhì)的昆層析節(jié)分離煉法（色吼譜法漆）最基脖本的奔特征掌：固定段相流動(dòng)芳相46原理—各種朗物質(zhì)稱得以取分離按的最味基本做原因叉：就貧在于胡它們推在這兩個(gè)花相之間具迷有不瓣同的嚼分配援系數(shù).兩相酸作相顛對(duì)運(yùn)閱動(dòng)時(shí)伐，這些雅物質(zhì)境在兩半相間騎進(jìn)行奇多次嗚的分乖配，西即使敬它們碗的分配系愧數(shù)只攝有微扁小的丙差異叨，通未過這幟個(gè)過源程也終能得談到最大的肉分離以效果雞。47層析燦分離塊能力荒的實(shí)獎(jiǎng)質(zhì)—物質(zhì)覺的分設(shè)配問終題*分乏配系蜘數(shù)：當(dāng)一涉種溶愿質(zhì)分執(zhí)布在敲兩個(gè)隙互不填相溶拼的溶可劑中渾時(shí)，法它在佛固定皆相和同移動(dòng)勝相兩奪相內(nèi)瘡的濃度碧之比是一席個(gè)常潑數(shù)，駝這稱窮為分缸配系救數(shù)。C1K鮮=或C2*質(zhì)量臉分配木系數(shù)罩：若不與用濃己度而灰用物質(zhì)滔的絕裁對(duì)量坊的比虎值來表營(yíng)示，萍則稱打?yàn)橘|(zhì)澆量分壯配系風(fēng)數(shù)即礦：VsD=體KVmVs:固定釣相的示體積Vm:流動(dòng)械相的曉體積48種類遇：氣相針層析按兩相解狀態(tài)來分淡液相扒層析吸附撕層析分配鎮(zhèn)層析按層析細(xì)機(jī)理來分昏離子伏交換必層析凝膠撤排阻誦層析親和毛層析柱層兼析按操作味方式來分期薄層兔層析紙層幟析層析蝴法分嗚離、利純化：Pr、多肽忌和AA49離子消交換炎層析緩法*原理狗：陰（陽缸）離思子交午換樹坐脂顆棄粒（廢作為克固定習(xí)相）填充捷在層除析柱散內(nèi)，芒由于陰（陽兆）離內(nèi)子交針換樹脂顆桃粒上象帶正（負(fù)歪）電適荷，燃能吸踩引溶至液中消的陰（陽赤）離烘子。弦然后眉再用玻含陰延（陽準(zhǔn)）離派子的溶液濾洗柱慚。含勉負(fù)電棟量小變的蛋貼白質(zhì)滾首先近被洗滴脫下來忽，增島加陰霸離子煩濃度份，含撿負(fù)電濤量多培的蛋燭白質(zhì)也箱被洗若脫下學(xué)來，妥于是栗兩種演蛋白印質(zhì)被脂分開徹。5051固定亮相：1.纖維誦素--獄-DE穿AE纖維頂素、CM纖維弓素2.葡聚捷糖52纖維仍素:骨架澤為柔英性長(zhǎng)順鏈1.加入牧量我：加入霞層析寨柱的平蛋白妙質(zhì)量蒼通常同纖維貧素量堅(jiān)的十分朱之一逗。2.提高紋分辨騾率，尺樣品企體積達(dá)應(yīng)盡負(fù)可能假地少板。3.在洗腥脫時(shí)著，可裁以通閉過改變嘉洗脫闖緩沖甘液的PH，而使粘蛋白遠(yuǎn)質(zhì)分奪子電聲荷減遙少而命被解轎吸下喘來，協(xié)也可以濕通過提高漲洗脫區(qū)緩沖援液中議離子坊強(qiáng)度，減近弱蛋白祝質(zhì)分故子與唱載體鬼親和壩力的幫辦法柄，將破蛋白鈔質(zhì)組分態(tài)逐一宜洗脫呆下來草。53葡聚造糖的授離子鏡交換攔樹脂:骨架溜為三找維網(wǎng)摟狀結(jié)丟構(gòu)優(yōu)點(diǎn)：1.同時(shí)剩具有屯分子鮮篩的乓作用2.因其獵高度阿的網(wǎng)池狀結(jié)疊構(gòu)，依所帶角有的證交換甩基團(tuán)描也比管纖維素多侮得多狗。交兔換容添量為電離子脖交換漸纖維吵素的3～5倍。缺點(diǎn)羊：它的膽床體漫積常忘受PH或鹽慰濃度逃影響求而變燒化，梢對(duì)分待離效果騙有一禁定程特度的濤干擾稱。54凝膠爐（排鑼阻）議層析又稱分子頃篩或幅凝膠宇過濾（ge嗓l蓬fi煉lt犬ra超ti也on）原理任：載體質(zhì)為有任一定叨孔徑鈔的多浴孔性傍親水述性凝滿膠。當(dāng)分妙子大鉛小不征同的畫混合對(duì)物通薦過這嗎種凝斗膠柱董時(shí)，直徑通大于貝孔徑昌的分異子將即不能貴進(jìn)入問凝膠今內(nèi)部趙，便直愿接沿嘆膠粒辟間隙因流出研（全買排出擱）。召較小票的分子蝦進(jìn)入痛能容促納它兔的孔展穴，濾繞道架而行句，在邪柱內(nèi)保檔留時(shí)諸間就野比較燭長(zhǎng)。寫這樣竿，較盒大的凳分子透被先洗脫歉下來雪，而全較小托的分膽子后穿被洗揀脫下遙來，魚從而達(dá)到治相互就分離庭的目排的.#55用作啦凝膠倡的載嶄體物炭質(zhì)有港三類：交聯(lián)律葡聚宏糖凝停膠商品枕名為Se佳ph腦ad諒exG聚丙嫌烯酰勸胺凝貨膠商品渴名為Bi夜o-返ge的l鄭P(丙烯配酰胺+疤N(yùn)，N’危-次甲肆基二陜丙烯騰酰胺肝聚合皂而成P值表伶示不葵同的妹交聯(lián)賀度)瓊脂詞糖凝前膠商品槳名為Se欣ph竊ar創(chuàng)os殺e或Bi資o-施ge留l掉A（從海遇藻瓊孟脂中浮分離求除去架瓊脂哨膠后擠的中紗性級(jí)盜成分是D-半乳廉糖和3,自6-脫水-L置-半乳嬸糖相嚼間重鏡復(fù)結(jié)合而責(zé)成的槍鏈狀伶化合遷物）5657瓊脂僻糖凝敬膠優(yōu)秘點(diǎn)：1.其機(jī)默械強(qiáng)瓣度比遺葡聚椅糖凝眉膠和鹿聚丙桌烯酰丘胺凝膠好兩得多鍋。2.對(duì)蛋駛白質(zhì)穗等高夜分子引的吸題附作棄用也否小得諒多3.適用挺分子惰量的宮范圍瘡寬，盡最大貪可以找到108。58凝膠熱排阻植層析耍的應(yīng)構(gòu)用：1.作為霞分析收工具(分子慚量差中別大慨的物沸質(zhì))2.作為姿脫鹽魚工具(Se準(zhǔn)ph乳ad猶exG-果25片)3.高分朋子溶連液的那濃縮(不穩(wěn)寺定的勁高分烤子)4.去除枕熱原熊物質(zhì)(D搞EA危E-汪A-濫25揭)5.物質(zhì)宵的分踩離提盼純6.用于晚測(cè)定墳高分析子物籠質(zhì)的仰分子容量59吸附互層析狡法原理演：柱層關(guān)析中鵲，含梅有Pr分子籠的混粗合物即隨流輔動(dòng)相辮通過由吸附劣劑組成宵的固賄定相半時(shí)，Pr分子別通過師各種次您級(jí)作纏用能僑夠吸荒附在婚吸附癢劑上,由于際不同衰分子的萄吸附雞能力望不同乞，可劇以通育過洗伸脫使委它們盟逐一解牲脫出芳來，顯而使虜混合鉤物得賊以分生離。優(yōu)點(diǎn)儉：1.物理覽吸附宋，吸惕附能責(zé)量比歉較低悅，洗拳脫也郵比較精容易鉆。2.操作倆簡(jiǎn)便犧，吸京附劑藍(lán)容易織獲得摸，價(jià)甩格較拍低廉60固定抵相：吸附件劑—磷酸荷鈣凝崗膠磷酸勵(lì)鈣膠Ca3（PO4）2磷酸饒氫鈣槳膠Ca悼HP氧O4·2求H2O羥基擔(dān)磷酸田鈣膠Ca5（PO4）3OH瀉[羥基蔥磷灰熄石]磷酸朱鈣膠旦對(duì)蛋拾白質(zhì)巨的吸毛附作吐用原痰理:主要嚴(yán)是由釣于弄１.緞Ca2+與Pr負(fù)電袖荷性曉基團(tuán)結(jié)合域。２.磷酸騎基團(tuán)顫與Pr正電古荷基拿團(tuán)61流動(dòng)丘相：洗脫脂劑--檸檬幸酸鹽作用閘：檸危檬酸免離子照因與Ca2+有更兔強(qiáng)的泰相互鴉作用印，它能薪大大降低蛋白利質(zhì)和且凝膠香的吸史附能辜力。Na需Cl，KC槽I甚至丹濃度藥高達(dá)3M時(shí)，休也不袍影響Pr負(fù)電后荷的吸窩附，暴相反字這些喬鹽可蟲以大陸大降觀低Pr正電咐荷的吸業(yè)附。詢因此納在高戲濃度虹的這除些鹽煙溶液籠中應(yīng)飄用羥趴基磷臘灰石工進(jìn)行姓層析有時(shí)，懷可以鐮專門余吸附耕酸性踢蛋白校質(zhì)及肢中性揪蛋白郵質(zhì)而直排除錯(cuò)堿性受蛋白羨質(zhì)。62親和租層析蔽法1.原理：利蹤蝶用生串物高蘋分子攔具有毅能和寇某些賀相對(duì)煤應(yīng)的充專一分子貓可逆慨結(jié)合張的特木性。如，酶的息活性漫部位敞能和貿(mào)底物\抑制慣劑\輔助棒因子精專一性權(quán)地結(jié)倒合,改變悼條件瞇又能加使這革種結(jié)渠合解六除.[酶的掏變構(gòu)寨中心怖與變槐構(gòu)因巖子（序或稱雅效應(yīng)抓物）強(qiáng)之間、甲抗體士與抗他原之苗間、頑激素師與受錢體之鵝間，役結(jié)合蛋悟白與讓結(jié)合隨物之孤間]。這些瞧被作憶用的深對(duì)象浪物質(zhì)智稱之券為配基督（li沾ga亦nd)。63固定里相--配基固定斃在固相符載體上64652.優(yōu)點(diǎn)：具揚(yáng)有高貍度的扭吸附倡專一洪性層析古過程恩簡(jiǎn)便蜂、快乘速3.載體俱的選商擇：(1靜)必須年具有狹高度幻玉親水斯性，節(jié)使Pr分子畢容易蠢與它晚接近.(2濕)非專貢一性誼吸附啄要十場(chǎng)分小害。(3核)必須烏具有除大量渾可供棍活化抓而能狠與配舟基結(jié)偷合的性基團(tuán)肝。常用蘆載體：纖維剪素、黃葡答聚糖曉凝膠晝、瓊播脂糖榴凝膠戀、聚丙宿烯酸惰胺凝貴膠和幼多孔旬玻璃等。66高效杠液相貪層析割法（Hi鏡gh莊P蔥er貴fo伐rm思an苦ce嚷L烤iq君ui風(fēng)d恨Ch腹ro勾ma濫to座gr聚ap蠅hy，HP故LC）又稱介“高壓寧液相便色譜，是色譜壁法的一法個(gè)重傻要分跑支，舞以液體為流動(dòng)點(diǎn)相，采故用高永壓輸嶺液系歸統(tǒng)，攻將具梅有不花同極性的單配一溶劑或不腿同比疑例的妖混合仔溶劑陡、緩導(dǎo)沖液崖等流共動(dòng)相居泵入附裝有賺固定其相的色譜惰柱，在扛柱內(nèi)階各成鴉分被族分離幕后，順進(jìn)入武檢測(cè)請(qǐng)器進(jìn)蜂行檢挑測(cè)，鼓從而辱實(shí)現(xiàn)貴對(duì)試遇樣的劣分析捏。67HP泰LC包括幫：輸液險(xiǎn)系統(tǒng)洋：驅(qū)動(dòng)鬧流動(dòng)蹦相和河樣品奔通過淋色譜青分離行柱和保檢測(cè)漸系統(tǒng)層析巖柱：分離易樣品滿中的土各個(gè)據(jù)物質(zhì)進(jìn)樣璃器：將待美分析移樣品葛引入替色譜途系統(tǒng)檢測(cè)騾系統(tǒng)絕：將被朗分析猴組在擴(kuò)柱流拿出液貼中濃跡度的認(rèn)變化躬轉(zhuǎn)化過為光慶學(xué)或稈電學(xué)治信號(hào)，并臉分析托顯示下出來686970分月類(1良)液一餡固吸速附層腫析(2胖)液一評(píng)液分決配層窗析：是應(yīng)狂用最峽多的扇方法揪之一筋。(3客)離子故交換斷層析(4偽)凝膠進(jìn)滲透續(xù)層析71⑴液-固吸遺附層跨析：焰固定勾相是暖具有購(gòu)吸附墨活性乘的吸核附劑誘，常賭用的所有硅臺(tái)膠、餅氧化終鋁、萬高分旺子有核機(jī)酸捕或聚僻酰胺喜凝膠染等。愈液-固吸軍附層旺析中嘗的流幣動(dòng)相掉依其蛋所起傷的作可用不袖同，談分為靠“底沸劑”朵和洗老脫劑艙兩類嫌，底膏劑起蜜決定檢基本修色譜違的分檢離作忘用，嶄洗脫農(nóng)劑起喉調(diào)節(jié)頸試樣熱組份閑的滯彈留時(shí)對(duì)間長(zhǎng)紹短，勉并對(duì)將試樣燥中某愉幾個(gè)述組份騎具有解選擇殃性作防用。72⑵液-液分倍配層前析：昌固定慨相為壯單體詞固定御液構(gòu)值成。堂將固診定液傳的官懷能團(tuán)尊結(jié)合售在薄守殼或忍多孔抬型硅像膠上租，經(jīng)濕酸洗百、中球和、守干燥副活化歉、使忘表面嗓保持更一定驅(qū)的硅在羥基嘗。這露種以客化學(xué)藏鍵合循相為紀(jì)固定伸相的朗液-液層論析稱是為化院學(xué)鍵翻合相惠層析盛。另和一種腎利用財(cái)離子棋對(duì)原考理的猴液-液分師配層懼析為衛(wèi)離子猜對(duì)層勞析。73⑶離好子交池?fù)Q層界析：筋原理售與普暖通離謎子交絨換相馬同。喜在離粉子交絮換HP望LC中，襖固定厘相多仿用離對(duì)子性雕鍵合粱相，桂故本宿法又酒稱離窗子性總鍵合會(huì)相層期析。皆流動(dòng)表相主包要是孝水溶部液，pH值最塊好在歉被分疲離酸嘗、堿儀的pK值附丸近。74蛋白船質(zhì)的渴檢測(cè)渴和鑒塌定75一般伐可通銀過以厚下幾滾個(gè)方粥面進(jìn)禍行：光譜據(jù)學(xué)特醫(yī)性電泳脆行為特異鉛抗體贈(zèng)反應(yīng)特異膨生物給學(xué)活背性N一末源端氨宮基酸阿序列羊測(cè)定質(zhì)譜金檢測(cè)排阻省層析76一、蝕光譜濃學(xué)特杏性光譜頓特性狗的總形原則辯是：當(dāng)一氣定波屆長(zhǎng)的銅光（屆即電稼磁波駕）與Pr分子爛接觸腔時(shí)，鞋所吸拋收的巖或反肺射的棒輻射索能量搖與Pr分子派結(jié)構(gòu)沿特征暮和濃表度是賀密切胖相關(guān)桌的。77不同溉波長(zhǎng)盲范圍倦的電勸磁波篩與其背作用宋后的槍剩余儉能量說值反依映的鍋是蛋案白質(zhì)宋分子臨的不盼同特違征:19間0汁--除20惑0n股m波長(zhǎng)才范圍坊的光撫吸收覽反映桂的是蛋白奴質(zhì)主海鏈上庸的酞灘胺鍵駱中電寒子的距被激永發(fā)；23培0塊-憤30暖0n逢m波長(zhǎng)觸范圍針的光著吸收堡譜（填最大液吸收磚值在28喪0n才m波長(zhǎng)懶處）閥反映判的是蛋白雖質(zhì)分述子中碌芳香辮族氨醒基酸鈴側(cè)鏈廁上電畜子的構(gòu)被激品發(fā)。所以咐一般拜情況你下，擔(dān)溶液規(guī)在28通0n已m波長(zhǎng)夸處（滲屬紫于外光范紹圍）片的光挎吸收誦能力傲被當(dāng)梳做是存在蛋白展質(zhì)的去證據(jù)纏。78二、盆電泳漲檢測(cè)蛋白星質(zhì)分寺子為屆兩性清電解撿質(zhì)，妙在不腥同PH的溶臣液中污帶有粗不同缺的電搜荷，寨從而釋在直父流電孝場(chǎng)中舍能夠舊泳動(dòng)療，這圖就是電泳做現(xiàn)象。按介質(zhì)影狀態(tài)來分:自由盆電泳區(qū)帶籮電泳按操作裁原理可分爬為:一般原電泳等電伐電泳等電笨聚焦寬電泳免疫備電泳劇等79自由皇電泳--以溶液為介殼質(zhì)，咱在溶暑液中洲將蛋型白質(zhì)催分離缺點(diǎn):自由示電泳航過程速中擴(kuò)近散嚴(yán)凡重，央分辨郵率有飼限區(qū)帶晉電泳--在固篇體支商持物責(zé)上所僻進(jìn)行播的電旨泳．固體堆支持搬物有:濾紙亡、醋酸悶纖維蛇薄膜慨、瓊脂賣糖凝凡膠聚丙約烯酰才胺凝茅膠優(yōu)點(diǎn):分辨喘率很汪高。80SD福S-聚丙廁烯酰翻胺凝商膠電駁泳SD栽S–數(shù)(十二譽(yù)烷基邊硫酸奧鈉)是陰局離子罩型去到污劑(S罰od識(shí)iu推mdo槐de季cy混lsu鴨lf換at橋e,幅S葉DS扛)Qu蒼=（遷贊移率追）6π車rηu與Q、r有關(guān)若蛋怪白質(zhì)熔分子陸帶有偶足夠得的電精荷，痰在SD臺(tái)S-喝PA員GE中進(jìn)行電梯泳，催由于孩分子貴篩效協(xié)應(yīng)，u僅取茫決于膏分子棋的大思小。因此SD按S一凝聽膠電膀泳可當(dāng)以按蛋白憐質(zhì)分沫子大獲小的多不同將其分開區(qū)。這時(shí)潔，若與以分向子量窗的對(duì)銳數(shù)（lo甩gM）對(duì)相擔(dān)對(duì)于站染料饒前沿的遷筐移率仙（Rf）作圖預(yù)，呈種現(xiàn)線泰性關(guān)押系。8182這種始關(guān)系縫，對(duì)裳一種繞膠濃街度時(shí)孤，只堵適用穗于一判定的分子貪量范瓦圍：5％膠沙濃度瀉時(shí)，啞適用轟于分唱子量6～20較0萬的區(qū)汁間；10％膠消濃度惕時(shí)，激適用閥于分斗子量1.懂6～7萬的揮區(qū)間摧；15％膠央濃度匠時(shí)，漢適用恭于分夸子量1.皺2～4.姥5萬的葛區(qū)間掃。83聚丙兼烯酰率胺凝抄膠電菊泳圖胸譜84等電暗聚焦決電泳——（is的oe踢le不ct昨ri荷cfo粒cu高si爸ng秧,貢IE薪F）是一龜種根葛據(jù)樣垂品的努等電浴點(diǎn)不織同而額使它隱們?cè)趐H梯度中相鮮互分壇離的熊一種尋電泳梁技術(shù)犯。利用亞特殊蠢的一夠種緩背沖液犧（兩朱性電傾解質(zhì)想）在贊凝膠職（常診用聚吵丙烯帽酰胺照凝膠疏）內(nèi)簽制造擠一個(gè)pH梯度燭。pH梯度補(bǔ)制作胖利用充的兩憶性電胖解質(zhì)禾（am來ph治ol釀yt勤e，商共品名北為am馳ph撇ol漸in阿e），戒是脂郊肪族沉多胺專和多結(jié)羧類罰的同醒系物講，他凍們具嗽有相橫近但盛不同供的pK奏a和pI值。歡在外翁電場(chǎng)煙作用縣下，閑自然崗形成pH梯度周。涉凝膠移可用腔：聚狡丙烯驚酰胺恨凝膠西、瓊息脂糖腐凝膠鹽、葡得聚糖喂凝膠蒸等85Pr分子煎有一攜定的PI，它諷處在縫一個(gè)猴由陽極堆到陰籌極梯度念逐漸槽增加異的介塊質(zhì)中亂，并箱通過消以直大流電憲時(shí)，倉(cāng)它便日“聚渣焦”蹲在與其PI相同瘋的pH位置夢(mèng)上。PI不同揀的蛋摸白質(zhì)躍泳動(dòng)萌后形詳成位哪置不桃同的艘區(qū)帶荒而得煤到分括離。86優(yōu)點(diǎn)賤：1.有很秋高的照分辨巷率；2.可以欠區(qū)分臨等電歉點(diǎn)只隊(duì)有0.辟01愁p長(zhǎng)H單位岡差異色的蛋宰白質(zhì)巖；3.根據(jù)咱其所銅在位捉置還罷能夠身測(cè)定餓蛋白脂質(zhì)的箭分子撈量；4.對(duì)很曉稀的院樣品磚，最儀后達(dá)敢到高慰度的她濃縮況。87雙向肯電泳（tw達(dá)o-欣di勒me彩ns激io握na燦l責(zé)ge殲l矩el屆ec傅tr軋op掠ho礙re手si瞧s）第一例向采緩用聚享丙烯般酸胺澤凝膠折等電梳聚焦補(bǔ)電泳--PI第二仁向采鍵用SD蓋S一凝福膠電陸泳--分子蓋量由于蘇結(jié)合嚷了蛋智白質(zhì)毒的等氧電點(diǎn)地和分泥子量拼兩種馬完全腳不同的旱特一腐性來迫進(jìn)行拾分離怪，因高此具懼有非真常高民的分威辨率可同按時(shí)分望析幾脂千上肌萬個(gè)巡壽蛋白叫，分些辨率寇高，哀分離他度好霧。是蛋更白質(zhì)嚇組學(xué)奪研究使的核尊心技強(qiáng)術(shù)。88雙向PA附GE89雙向班電泳渣技術(shù)裁缺點(diǎn)戰(zhàn)，具隊(duì)有以污下特總征的止蛋白銹質(zhì)在項(xiàng)二維脹電泳泥中還緩很難晚被檢和測(cè)到評(píng)：①等轉(zhuǎn)電點(diǎn)概（pl勉)值很湖大或倍很小建的，臟比如失大于8和小盼于4的那謎些蛋椅白質(zhì)爽；②分師子質(zhì)離量很摘大的燥蛋白塔質(zhì)，宜比如捐大于l0占0k慢Da的蛋畜白質(zhì)就崖比實(shí)漁際的頌少了朽，而趴大于15捉0k具Da的蛋愚白質(zhì)誰就幾乎完棟全探苗測(cè)不挎到了焰（盡莊管在洽一維議電泳淡凝膠庫(kù)上這蛇些大蛋陸白質(zhì)縫都能場(chǎng)清楚真地被糾觀察專到；③疏備水性稀蛋白占質(zhì)。90免疫完電泳將電泳舟分離和專一僚性免豈疫沉敗淀相結(jié)旦合的毒分析順方法蒸：免疫玻電泳肺法是絹指利塘用凝椅膠電鏟泳與限雙向洽免疫送擴(kuò)散添兩種隙技術(shù)條結(jié)合純的實(shí)頭驗(yàn)方莊法。些在電楚場(chǎng)作樂用下翼標(biāo)本煮中各兼組分擔(dān)因電無泳遷莫移率鬧不同蓄而分難成區(qū)說帶，就然后炸沿電腦泳平鞠行方度向?qū)啬z萍挖一隆溝槽效，將且抗體鄰加入桐溝槽洪內(nèi)，遵使抗億原與覆抗體背相互仆擴(kuò)散粉而形坡成沉穩(wěn)淀線耳。根杠據(jù)沉衣淀線導(dǎo)的數(shù)船量、月位置憐及形鑄狀，況以分壤析標(biāo)訓(xùn)本中行所含慮組分上的性醬質(zhì)。由于腹免疫嗓反應(yīng)臟有很高寄的專跌一性嗓，可用左于鑒定Pr的純度控，分屢析樣肺品中蛋掀白質(zhì)良的組較分。PH不8竄.6本實(shí)妄驗(yàn)常豬用于牌抗原思分析賓及免旦疫性縮慧疾病中的診權(quán)斷。9192三、雙測(cè)定嘉純化宅蛋白粉質(zhì)的追分子奴大小測(cè)定飾蛋白享處于柿非變手性條秤件下糟的大會(huì)小一若般可鄙通過從：凝膠拾層析沉降逐平衡需超速筋離心（se爆di阿me籌nt謹(jǐn)at辣io脅neq書ul堪ib滾ri仁umul根tr胞ac寇en獸tr當(dāng)if啦ug已a(bǔ)t罪io圍n)動(dòng)態(tài)兩光散駛射（dy裹na應(yīng)mi久c暈li中g(shù)h吊t由sc照at諸te待ri殘ng居)孔徑杏梯度版聚丙耍烯酰掀胺凝偶膠電菊泳（po壯re貝g尚ra梁di績(jī)en或tpo仁ly逆ac覺ry跡la常mi礎(chǔ)dege悟l宅el慢ec消tr緣瑞op頸ho拍re救si光s）93凝膠宣層析1.凝膠多是一剖類多敏孔性夏高分券子聚畝合物,每個(gè)筑顆粒幼猶如青一個(gè)親篩子.當(dāng)樣窮品溶買液通予過凝格膠柱伐時(shí),相對(duì)誕分子記質(zhì)量吸較大燒的物緊質(zhì)由布于直足徑大常于凝燒膠網(wǎng)暑孔而宏只能躺沿著向凝膠根顆粒屠間的窗孔隙,隨著急溶劑麗流動(dòng),因此美流程批較短,向前舍移動(dòng)站速度獸快而吼首先剃流出爽層析茶柱;2.反之,相對(duì)罪分子通質(zhì)量絡(luò)較小居的物障質(zhì)由借于直為徑小臥于凝蘋膠網(wǎng)泄孔,可自膊由地獎(jiǎng)進(jìn)出底凝膠薄顆粒南的網(wǎng)谷孔,在向芒下移牌動(dòng)過難程中,它們神從凝忌膠內(nèi)境擴(kuò)散盼到膠做?？讕逗笏{(lán)再進(jìn)費(fèi)入另院一凝抵膠顆繭粒,如此闖不斷希地進(jìn)嫂入與漠逸出,使流頓量增諷長(zhǎng),移動(dòng)權(quán)速率鄰慢而誕最后慮流出意層析唐柱.943.而中華等大引小的績(jī)分子,它們娛也能竿在凝購(gòu)膠顆秋粒內(nèi)允外分筒布,部分房誠(chéng)進(jìn)入爐顆粒,從而加在大猴分子主物質(zhì)賄與小茫分子遙物質(zhì)德之間棄被洗證脫.這樣,經(jīng)過露層析毛柱,使混顧合物貨中的贈(zèng)各物政質(zhì)按勞其分殼子大殼小不側(cè)同而姜被分槍離襲。Ve＝－b’骨lo趴gM哄wC’其中b’肅,C’為常庸數(shù)。求即Ve為洗邀脫體轟積，王與lo咬gM駁w也成華線性白關(guān)系旅。我泉們可花以通強(qiáng)過在吹一凝布膠柱罪上分草離多央種已脈知分縱子量鏟的蛋是白質(zhì)貨后，步并根敵據(jù)上暗述的侮線性軍關(guān)系拌繪出決標(biāo)準(zhǔn)乳曲線侍，然語后用奏同一晴凝膠傲柱測(cè)曉出其裁它未搶知蛋再白的雷分子讀量。95沉降鼠平衡踢超速允離心（se雖di旱me壟nt道at劇io吼neq恥ul誓ib勻ri罷umul純tr癥ac襪en沖tr浙if穿ug場(chǎng)at脅io癥n)用該渴技術(shù)炒測(cè)定潑蛋白扶質(zhì)分耕子質(zhì)膀量的饑時(shí)候途，測(cè)衡定的朗是幾幻玉個(gè)絕育對(duì)動(dòng)撇力學(xué)青參數(shù)壺。96原理順：當(dāng)Pr樣品駁在相神對(duì)較痕低的微離心擇速度賄（但光還是陣處于屆超速巴范圍委）下朝離心廢時(shí)，差在一宰個(gè)從具離心列管頂偉部指智向底籠部的叫、越都往底辟部越賣大的簽沉降淺力作慚用下者，Pr分子反很快拼形成鑼一個(gè)狂從離孟心管族頂部目往下嫌逐漸騙增加爆的連形續(xù)Ｐr濃度于梯度淘；與名此同個(gè)時(shí)，票將有茶一個(gè)芒方向泥與離殃心力河相反務(wù)的擴(kuò)朵散力汪作用哈于Pr上；弦當(dāng)沉蘋降離迅心進(jìn)純行一狼定時(shí)嘆間之南后，丹作用役于Pr上的僻離心摔力和腐擴(kuò)散碗力（青前者這與蛋儉白在別離心膛管中查所在脈位置沉離軸悔心的貫距離肉成正脈比例弦，后奔者與Pr濃度化成正趨比）腔正好瞞相互乒消除舅，這熄樣使裝得蛋拾白樣己品的真表面處辨于一醉個(gè)平切衡狀君態(tài)而恐不再仙移動(dòng)陪；在撤這種蹤蝶平衡貿(mào)條件克下，映不同娃部位Pr濃度敘與所柜在部團(tuán)位離警軸心殃的距奴離之賊間的錢關(guān)系攔與蛋額白質(zhì)槳分子筐質(zhì)量構(gòu)成某愿種數(shù)挑學(xué)關(guān)卻系。9798動(dòng)態(tài)仍彈性敲光散擁射是通托過測(cè)哭定蛋低白顆址粒的底直徑塞、然碎后與繼標(biāo)準(zhǔn)互蛋白麥樣品州比較戲而推儲(chǔ)算蛋野白分墨子質(zhì)割量的納方法禽。這種撇測(cè)定需技術(shù)萬也可侄通過咬觀察撇樣品悠是單自分散樂性的饅（mo諷no墳di涼sp臺(tái)er蟲se犁d）還消是多楚分散撲性的陣（po夾ly么di做sp妄er-se躍d）而煉反映筋所測(cè)行蛋白柴樣品哲是否腳均一恒。99孔徑殃梯度先電泳這是妻通過討制備好具有榆一定心范圍擁的從大蕉到小絲式孔徑梯度肌的聚丙北烯酸賭胺凝次膠，然沒后讓途蛋白脈在非葬變性惰條件拖下在蠟這種肥凝膠收上電航泳而惹進(jìn)行母的。經(jīng)過寨低電需流條陰件下顫的較范長(zhǎng)時(shí)囑間的授電泳捆，蛋碎白質(zhì)村分子五將在蝴凝膠郵中與掏其直哥徑相吹等的閃孔徑戚處停判下（芒因?yàn)榻Y(jié)再往醒下凝詳膠中墻的孔越徑比絮蛋白鉛直徑隨?。┹^。通祥過與優(yōu)同時(shí)搜在膠貫中電沖泳的標(biāo)準(zhǔn)剪樣品閑比較我們靈就可艘以知杜道蛋噸白在虹這種擊非變涂性條途件下賴的分蔬子質(zhì)糞量。優(yōu)點(diǎn)疼：１.所獲榆得的奪是天紐奉然狀讓態(tài)下吸的蛋害白分岔子大膚小。2.如果雞蛋白搖分子速能夠咳在這謀種低系電流途電場(chǎng)避中長(zhǎng)時(shí)間虹保持屆穩(wěn)定殲的話股，這略種方殿法比歐較蜻經(jīng)濟(jì)墾。10綠0質(zhì)譜質(zhì)譜漲是一寧種在址化學(xué)暗中被隨廣泛光采用住的、腦測(cè)定劑原子使或分?jǐn)⒆淤|(zhì)芒量方贈(zèng)法中遠(yuǎn)最直惹接、蜓最準(zhǔn)甜確的菌方法延。10潤(rùn)1用質(zhì)本譜測(cè)唯定蛋虎白質(zhì)訂分子堵質(zhì)量籃的總兆的原此理：首先顫純化庸好的斤蛋白取樣品來要被哈轉(zhuǎn)變晌成揮發(fā)飛和帶困電（即良解離翅）狀另態(tài)，嶼電離捷后的梢蛋白雪質(zhì)分驚子（泉帶有高多個(gè)倉(cāng)電荷伯）然深后進(jìn)收人一炎個(gè)真紗空加慕速電昂場(chǎng)中曾，之融后，悄不同備質(zhì)荷述比（m/槐z）的依蛋白釀分子季表現(xiàn)秧出的淺行為〔或者事在外六加磁魄場(chǎng)中佩的偏捉轉(zhuǎn)、喇或者咳抵達(dá)察固定稅探測(cè)盒器的旺所謂婚“飛賭行時(shí)廚間（ti辟me延o按f襖fl晶ig筋ht需,泳TO芒F)蔽"緊〕不一俱樣。護(hù)利用窮所測(cè)甜得的斃質(zhì)荷捏比以攝及蛋羞白所雨帶的決電荷褲值，篩計(jì)算慎機(jī)軟浴件很銳快就間會(huì)正筆確地序給出身所測(cè)網(wǎng)蛋白棉分子桐的質(zhì)梅量。10級(jí)2用質(zhì)燭譜測(cè)氏定蛋誰白質(zhì)忌的分部子質(zhì)出量，謊精確粉一般倒可達(dá)0.轟01步%，是姻目前急進(jìn)行辨蛋白騾質(zhì)分女子量盞測(cè)定速最準(zhǔn)銜確的受方法膨（其篩準(zhǔn)確講度超飄過SD磁S-糕PA灶GE、彈抱性光柳散射甘和孔毀徑梯潮度聚凈丙烯膚酰胺謀凝膠用電泳附，甚寨至分全析超活速離事心等堂）。質(zhì)譜販技術(shù)現(xiàn)在翠也可維直接病用于家：氨基何酸序謝列的按測(cè)定蛋白脹質(zhì)的箱翻譯船后修番飾的大鑒定蛋白初質(zhì)組運(yùn)學(xué)研最究工龍作。10教3四、環(huán)測(cè)定拒蛋白粒質(zhì)的夠氨基痛酸序貢列蛋白葛質(zhì)被豆純化憲出來斜，需攪要進(jìn)繁一步左獲取成其基市因序燦列，最好峰測(cè)定釋其部級(jí)分的選或全夠部的旦氨基諒酸序女列。自動(dòng)倒氨基粘酸測(cè)械序儀10音4五、兩用抗露體探芬測(cè)特總異蛋選白質(zhì)鋒分子抗體季是當(dāng)糾外源鏟入侵笨物（疾包括回蛋白獅質(zhì)）乘與脊畫椎動(dòng)蛋物體使內(nèi)的崗免疫酷系統(tǒng)睡接觸續(xù)后產(chǎn)搬生的以、能數(shù)與入任侵物公特異榜結(jié)合御的防障御性揪蛋白香質(zhì)分勸子。這種豬高度世特異拍、高售度靈飄敏的抗體和一抗炕原結(jié)合趴反應(yīng)唇現(xiàn)在垃被廣封泛地?fù)?yīng)用扒于檢測(cè)船微量疾蛋白的存莫在情鄰況。10舒5目前產(chǎn)應(yīng)用抗體研究肚蛋白遠(yuǎn)質(zhì)的沉方法孤主要哀包括浴下面撐幾種褲：１.蛋白慰質(zhì)印且跡2.免疫姓共沉超淀10欺6(一）怨蛋白木質(zhì)印窗跡（We河st忙er臣n侍bl機(jī)ot刊ti擺ng）是一簽種使衡用廣纏泛的突檢測(cè)捉蛋白蟲質(zhì)的除方法壘。這種昆方法浸與研護(hù)究核意酸時(shí)遠(yuǎn)用的育印跡核法原趁理非潮常類拿似－丙－蛋白梯質(zhì)印濤跡法是利講用抗據(jù)原一敞抗體暫之間植的特黎異結(jié)頌合反煎應(yīng)而蝦檢測(cè)披的；核酸帖類的毒印跡挺法是利思用核齊酸分臣子之座間通蜓過特啊異堿左基配要對(duì)法皆則而爺形成最雜交灰分子景這一幅原理夢(mèng)而檢筋測(cè)的10辛7蛋白小質(zhì)印潑跡－－檢測(cè)趕時(shí)，株蛋白圍質(zhì)混籍合物除（一定般是餐細(xì)胞寇抽提特物）存通過址電泳煙被分裙開，隊(duì)蛋白躬質(zhì)被翼（一科般通演過電盜場(chǎng)的少作用漿）轉(zhuǎn)癢移到魔一種跪特別休的膜禮（如恢硝化洽纖維富膜等摸）上嫂，然瓣后讓宅特異誕的抗?jié)擉w與蠢固定籍在膜胡上的瓣特異孫抗原暫蛋白痕結(jié)合抗原發(fā)一抗末體之腥間結(jié)嘴合的高度灣特異橡性使得槐用某記種蛋白質(zhì)為分子攔制備錄的特彼異抗氣體分旦子只鐮與膜饑上的施這種蠢蛋白鞋質(zhì)分醫(yī)子結(jié)瓶合，前而不夠與膜繼上存斃在的碗成千盆上萬興種其吧他蛋霉白質(zhì)擊發(fā)生剩相互織作用蠻。10代8結(jié)合墳了特言異抗若體的躬蛋白窄質(zhì)條極帶可鬼以通扇過能輝與結(jié)孕合在殊抗原區(qū)蛋白龍上的搞所謂黎“第龍一”些抗體皇結(jié)合晌的、邪被一俘種特死異的柿酶／休化學(xué)凡發(fā)光厘基團(tuán)與／熒蕩光基深團(tuán)／膀放射亮性同墳位素病標(biāo)記直的“辜第二卷”抗輕體進(jìn)琴行顯因示。這樣刷我們鹽可以容知道由與特努異抗訓(xùn)體對(duì)牧應(yīng)的永抗原伏蛋白念在檢乞測(cè)的京蛋白姑混合關(guān)物中夢(mèng)是否嶺存在徐？相滾對(duì)量吵是多鈔少？搬如果陰蛋白始混合陜物是掛通過SD顫S-同PA劫GE分開蓬的話忌，被姻檢測(cè)擁蛋白多的分屈子量撲也一悠目了竭然。10拘9（二足）免疫壺共沉到淀（co猶im直mu冶no攻pr鑰ec超ip鉆it以at要io偏n）是一境種在湖體外探測(cè)就兩個(gè)扁蛋白剩分子切之間是否黨存在溉特異相互膊作用袍的方納法。免疫第共沉脾淀的環(huán)原理擋：如巴果兩表個(gè)蛋壤白在貪體外墊系統(tǒng)研中能請(qǐng)夠發(fā)雞生特?fù)萎愊嗾ɑプ鞔钟玫闹嘣?，派那么曉?dāng)用堂兩個(gè)當(dāng)?shù)鞍资嶂械臉O一個(gè)凝所對(duì)溉應(yīng)的篇抗體勇進(jìn)行亭免疫通沉淀限的時(shí)某候，坑另一料個(gè)蛋址白也覺將同歐時(shí)被棍沉淀瓶下來疼。11止0蛋白瞎質(zhì)的虜結(jié)構(gòu)們分析11圍1蛋白懼質(zhì)結(jié)死構(gòu)包未括：共價(jià)應(yīng)結(jié)構(gòu)股和非汪共價(jià)子結(jié)構(gòu)靜態(tài)渡結(jié)構(gòu)惹和動(dòng)乎態(tài)結(jié)福構(gòu)。一級(jí)德結(jié)構(gòu)空間質(zhì)結(jié)構(gòu)11戰(zhàn)2一、渾氨基豪酸序民列測(cè)突定－專一級(jí)夜結(jié)構(gòu)書的測(cè)賺定蛋白臉質(zhì)的賺一級(jí)傻結(jié)構(gòu)適決定令其高側(cè)級(jí)結(jié)袖構(gòu)，腳測(cè)定裳一個(gè)芒蛋白申質(zhì)的鍬一級(jí)虹結(jié)構(gòu)濕是我口們認(rèn)份識(shí)一刪個(gè)蛋熊白質(zhì)截結(jié)構(gòu)集和功說能的亮前提朱之一要。11晉3Ed綁ma索n降解千法：乖是肽翼鏈或午蛋白斬質(zhì)中N-端氨水基酸退序列萌分析澇方法嘴之一很。由策菲爾·埃德宜曼（Pe膠hrEd施ma暢n）首脂先創(chuàng)習(xí)立。質(zhì)譜鄉(xiāng)豐技術(shù)佳－－楚基于栽串聯(lián)既質(zhì)譜湖技術(shù)狐的Ａ恨Ａ測(cè)獸序方地法是根淡據(jù)質(zhì)演譜技犁術(shù)測(cè)嘆定多幕肽分但子質(zhì)偉量的客極高不準(zhǔn)確庸性這一鼻特點(diǎn)秋而設(shè)聚計(jì)的通過散測(cè)定續(xù)蛋白嘆質(zhì)的凍氨基捐酸所對(duì)對(duì)應(yīng)荒的DN摟A編碼菜序列頌上讀出姓（從cD蛇NA序列私直接電讀出匆，或矮從對(duì)名應(yīng)的毀基因錯(cuò)組DN厲A序列紅中的匹外顯經(jīng)子序島列）11鵲4Ed脹ma權(quán)n降解丟法：原理胃：用異紀(jì)硫氰貍酸苯硬酯（PI岡TC）與權(quán)待分息析多幅肽的N-端氨芹基在悔堿性刪條件奮下反罷應(yīng)，碗生成是苯氨花基硫即代甲讀酰胺懇（PT寶C）的裹衍生猾物，冬然后充用酸執(zhí)處理燙，關(guān)廢環(huán)，敘肽鏈N-端被胡選擇厲性地謹(jǐn)切斷濟(jì)，得轉(zhuǎn)到N-端氨認(rèn)基酸粉殘基效的噻掃唑啉或酮苯思胺衍能生物宗。接簽著用翼有機(jī)督溶劑創(chuàng)將該括衍生課物萃校取出適來，懂酸作鮮用下投，該陳衍生手物不嚴(yán)穩(wěn)定承，會(huì)爹繼續(xù)四反應(yīng)厲，形醉成一欺個(gè)穩(wěn)醒定的絕苯基飲乙內(nèi)紋酰硫煙脲（PT截H）衍貴生物正。余蕩下肽視鏈中還的酰醫(yī)胺鍵矩不受孔影響袋。通捐過用HP造LC或電蹄泳法突分析卸生成眠的苯毅乙內(nèi)耐酰硫皆脲（PT眨H-氨基銷酸）敵，可隆以鑒燭定出孟是哪漢一個(gè)剩氨基役酸。潔每反搜應(yīng)一診次，抄結(jié)果愈是得皇到一揪個(gè)去勇掉N-端氨循基酸墊殘基爛的多課肽，輩剩下招的肽蔽鏈可羊以進(jìn)耽入下落一個(gè)喬循環(huán)坡，繼杜續(xù)發(fā)漫生降冠解。11男5優(yōu)點(diǎn)礙：能夠鋼可靠息地測(cè)供定肽血鏈的30個(gè)左尊右氨象基酸害殘基崗序列駱，最殖多可仍以分妙析50厚-6倡0個(gè)氨過基酸偶?xì)埢?。在閱最好滔的條畫件下衛(wèi)，每賺形成湖一次PT村H-氨基況酸，穗效率豎可保耕持在99糖%以上邀。而致且此殘法用百量少防，缺點(diǎn)養(yǎng)：由于Ed稍ma擺n降解烏是以倡化學(xué)傍試劑瘡對(duì)N-端氨漆基的立修飾耕為基叮礎(chǔ)的共，因主此當(dāng)N-端被扛其他籃化學(xué)缸基團(tuán)共所封池閉時(shí)漂，就刃需要椒先去豬除這測(cè)些基刷團(tuán)，憑然后排才能毅進(jìn)行礦測(cè)序賺。此疤外，軋蛋白瓦質(zhì)中哄含有茶半胱激氨酸勻殘基秘時(shí)，紛有時(shí)尼兩個(gè)稱半胱佩氨酸寨殘基煉會(huì)發(fā)胃生二示硫鍵艦交聯(lián)儲(chǔ)。這地種情東況下題，需漫要先份用過領(lǐng)酸將輛二硫脅鍵氧派化為–S滴O3牧H，然俘后才發(fā)能用Ed病ma康n降解佳測(cè)定視序列公。11心6質(zhì)譜瞎技術(shù)天測(cè)定末ＡＡ劉序列亞：１.先測(cè)瓣定某要一肽腐段（惑如：A-B獨(dú)-夕C-土D-穿E-答F-符G-績(jī)-）以楚及從C一末積端或N一末剖端去表除一鍋個(gè)殘法基的碑同一宜肽段鄉(xiāng)豐（如衫：B-船C-割D-橋E-舉F-徑G-）各販自的分子推質(zhì)量，二允者之爬差值部即為艇末端境