色譜法基本概念

關于色譜法基本概念1第1頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月5-1色譜法概述

5-1-1色譜法的特點、分類和作用

5-1-2色譜分離過程

5-1-3色譜流出曲線與術語5-2色譜理論基礎

5-2-1塔板理論

5-2-2速率理論

5-2-3分離度5-3定性定量方法

5-3-1色譜定性分析

5-3-2色譜定量分析目錄第2頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月5-1色譜法概述

5-1-1色譜法的特點、分類和作用

1.概述

混合物最有效的分離、分析方法。俄國植物學家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。色譜法是一種分離技術，試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進行著的分配過程。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。第3頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月

當流動相中攜帶的混合物流經固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質和結構上的差異，與固定相之間產生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。（多次萃?。?/p>

與適當的柱后檢測方法結合，實現混合物中各組分的分離與檢測。

兩相及兩相的相對運動構成了色譜法的基礎第4頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月2.色譜法分類

(1)氣相色譜：流動相為氣體（稱為載氣）。

按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜(2)液相色譜：流動相為液體（也稱為淋洗液）。

按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。離子色譜：液相色譜的一種，以特制的離子交換樹脂為固定相，不同pH值的水溶液為流動相。第5頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)其他色譜方法薄層色譜和紙色譜：比較簡單的色譜方法凝膠色譜法：測聚合物分子量分布。超臨界色譜:

CO2流動相。高效毛細管電泳:

九十年代快速發(fā)展、特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。第6頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月3.色譜法的特點（1）分離效率高

復雜混合物，有機同系物、異構體。手性異構體。（2）靈敏度高

可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質量。（3）分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內可以完成一個試樣的分析。（4）應用范圍廣

氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：

被分離組分的定性較為困難。第7頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月5-1-2色譜分離過程

色譜分離過程是在色譜柱內完成的。填充柱色譜:氣固(液固)色譜和氣液(液液)色譜，兩者的分離機理不同。氣固(液固)色譜的固定相:

多孔性的固體吸附劑顆粒。固體吸附劑對試樣中各組分的吸附能力的不同。氣液(液液)色譜的固定相:

由擔體和固定液所組成。固定液對試樣中各組分的溶解能力的不同。氣固色譜的分離機理:

吸附與脫附的不斷重復過程；氣液色譜的分離機理：氣液(液液)兩相間的反復多次分配過程。第8頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第9頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月1.氣相色譜分離過程

當試樣由載氣攜帶進入色譜柱與固定相接觸時，被固定相溶解或吸附;

隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中揮發(fā)或脫附;

揮發(fā)或脫附下的組分隨著載氣向前移動時又再次被固定相溶解或吸附;

隨著載氣的流動，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反復地進行。第10頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月2.分配系數（partionfactor）K

組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數，用K表示，即：分配系數是色譜分離的依據。第11頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月

一定溫度下，組分的分配系數K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質；每個組份在各種固定相上的分配系數K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。第12頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月3.分配比（partionradio）k

在實際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平衡過程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質量比：

1.分配系數與分配比都是與組分及固定相的熱力學性質有關的常數，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。

2.分配系數與分配比都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數，數值越大，該組分的保留時間越長。

3.分配比可以由實驗測得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；第13頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月4.容量因子與分配系數的關系

式中為相比。填充柱相比：6～35；毛細管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保留時間越長。

VM為流動相體積，即柱內固定相顆粒間的空隙體積；VS為固定相體積，對不同類型色譜柱，VS的含義不同；氣-液色譜柱：VS為固定液體積；氣-固色譜柱：VS為吸附劑表面容量；第14頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月5.分配比與保留時間的關系

滯留因子（retardationfactor）：us：組分在分離柱內的線速度；u：流動相在分離柱內的線速度；滯留因子RS也可以用質量分數ω表示：

若組分和流動相通過長度為L的分離柱，需要的時間分別為tR和tM，則：由以上各式，可得：tR=tM(1+k)第15頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月5-1-3色譜流出曲線與術語1.基線

無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。

2.保留值（1）時間表示的保留值

保留時間（tR）：組分從進樣到柱后出現濃度極大值時所需的時間；

死時間（tM）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時間；

調整保留時間（tR＇）：tR＇=tR－tM

第16頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：

VR=tR×F0F0為柱出口處的載氣流量，單位：mL/min。

死體積（VM）：

VM=tM×F0

調整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

第17頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月3.相對保留值r21

組分2與組分1調整保留值之比：

r21=t′R2

/t′R1=V′R2/V′R1

相對保留值只與柱溫和固定相性質有關，與其他色譜操作條件無關，它表示了固定相對這兩種組分的選擇性。第18頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月4.區(qū)域寬度

用來衡量色譜峰寬度的參數，有三種表示方法：（1）標準偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354（3）峰底寬(Wb)：Wb=4第19頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月5.色譜流出曲線的數學描述

色譜峰為正態(tài)分布時，色譜流出曲線上的濃度與時間的關系為：

當色譜峰為非正態(tài)分布時，可按正態(tài)分布函數加指數衰減函數構建關系式。第20頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月

色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學和動力學問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標及其關系。組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時間：色譜過程的熱力學因素控制；（組分和固定液的結構和性質）色譜峰變寬：色譜過程的動力學因素控制；（兩相中的運動阻力，擴散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；5-2色譜理論基礎第21頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月

塔板理論的假設：

(1)在每一個平衡過程間隔內，平衡可以迅速達到；

(2)將載氣看作成脈動（間歇）過程；

(3)試樣沿色譜柱方向的擴散可忽略；

(4)每次分配的分配系數相同。5-2-1塔板理論-柱分離效能指標1.塔板理論（platetheory）半經驗理論；將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）；第22頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月

色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數：n，則三者的關系為：

n=L/H理論塔板數與色譜參數之間的關系為：保留時間包含死時間，在死時間內不參與分配!第23頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月2.有效塔板數和有效塔板高度

單位柱長的塔板數越多，表明柱效越高。用不同物質計算可得到不同的理論塔板數。組分在tM時間內不參與柱內分配。需引入有效塔板數和有效塔板高度：第24頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月3.塔板理論的特點和不足(1)當色譜柱長度一定時，塔板數n

越大(塔板高度H越小)，被測組分在柱內被分配的次數越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。

(2)不同物質在同一色譜柱上的分配系數不同，用有效塔板數和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質。(3)柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數K相同時，無論該色譜柱的塔板數多大，都無法分離。(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實驗結果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。第25頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月5-2-2速率理論-影響柱效的因素1.速率方程

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，

u：載氣的線速度(cm/s)

減小A、B、C三項可提高柱效；存在著最佳流速；

A、B、C三項各與哪些因素有關？第26頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月A─渦流擴散項

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現象減輕，色譜峰較窄。第27頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月B/u—分子擴散項

B=2νDgν

：彎曲因子，填充柱色譜，ν<1。

Dg：試樣組分分子在氣相中的擴散系數（cm2·s-1）

(1)存在著濃度差，產生縱向擴散;(2)擴散導致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;(3)分子擴散項與流速有關，流速↓，滯留時間↑，擴散↑;(4)擴散系數：Dg

∝(M載氣)-1/2；M載氣↑，B值↓。第28頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月

k為容量因子；Dg

、DL為擴散系數。df:有效液膜的厚度。

減小擔體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質阻力。C·u—傳質阻力項

傳質阻力包括氣相傳質阻力Cg和液相傳質阻力CL即：

C=（Cg+CL）第29頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月2.載氣流速與柱效——最佳流速載氣流速高時：

傳質阻力項是影響柱效的主要因素，流速，柱效。載氣流速低時：

分子擴散項成為影響柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導數有一極小值。以塔板高度H對應載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。第30頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月3.速率理論的要點(1)組分分子在柱內運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達到等因素是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。(2)通過選擇適當的固定相粒度、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質，但又加劇了分子擴散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。第31頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月5-2-3分離度

塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質對的實際分離程度。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。難分離物質對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差──色譜過程的熱力學因素；區(qū)域寬度──色譜過程的動力學因素。色譜分離中的四種情況如圖所示：①柱效較高，△K(分配系數)較大,完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，△K較大,但分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。第32頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月分離度的表達式：R=0.8：兩峰的分離程度可達89%；R=1：分離程度98%；R=1.5：達99.7%（相鄰兩峰完全分離的標準）。第33頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相鄰兩峰的峰底寬近似相等），引入相對保留值和塔板數，可導出下式：第34頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）分離度與柱效

分離度與柱效的平方根成正比，r21一定時，增加柱效，可提高分離度，但組分保留時間增加且峰擴展，分析時間長。（2）分離度與r21

增大r21是提高分離度的最有效方法，計算可知，在相同分離度下，當r21增加一倍，需要的n有效減小10000倍。

增大r21的最有效方法是選擇合適的固定液。第35頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月例題1：

在一定條件下，兩個組分的調整保留時間分別為85秒和100秒，要達到完全分離，即R=1.5。計算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長是多少？解：r21=100/85=1.18

n有效=16R2[r21/(r21—1)]2=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1547（塊）

L有效=n有效·H有效=1547×0.1=155cm

即柱長為1.55米時，兩組分可以得到完全分離。第36頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月例題2：

在一定條件下，兩個組分的保留時間分別為12.2s和12.8s，計算分離度。要達到完全分離，即R=1.5，所需要的柱長。解：分離度：塔板數增加一倍，分離度增加多少？第37頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月5-3定性定量方法

5-3-1色譜定性分析1.利用純物質定性的方法

利用保留值定性：通過對比試樣中具有與純物質相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數據之間的對比。

利用加入法定性：將純物質加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。2.利用文獻保留值定性（利用相對保留值r21定性）

相對保留值r21僅與柱溫和固定液性質有關。在色譜手冊中都列有各種物質在不同固定液上的保留數據，可以用來進行定性鑒定。第38頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月

又稱Kovats指數(Ⅰ)，是一種重現性較好的定性參數。測定方法：將正構烷烴作為標準，規(guī)定其保留指數為分子中碳原子個數乘以100（如正己烷的保留指數為600）。其它物質的保留指數（IX）是通過選定兩個相鄰的正構烷烴，其分別具有Z和Z＋1個碳原子。被測物質X的調整保留時間應在相鄰兩個正構烷烴的調整保留值之間如圖所示：3.保留指數第39頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月4.與其他分析儀器聯用的定性方法

小型化的臺式色質譜聯用儀（GC-MS；LC-MS）色譜-紅外光譜儀聯用儀；組分的結構鑒定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD第40頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月5-3-2色譜定量分析1.峰面積的測量

（1）峰高（h）乘半峰寬（Y1/2）法：近似將色譜峰當作等腰三角形。此法算出的面積是實際峰面積的0.94倍：

A=1.064h·Y1/2

（2）峰高乘平均峰寬法：當峰形不對稱時，可在峰高0.15和0.85處分別測定峰寬，由下式計算峰面積：

A=h·（Y

0.15+Y

0.85

）/2

（3）峰高乘保留時間法：在一定操作條件下，同系物的半峰寬與保留時間