堿性磷酸酶的分離純化鑒定

關(guān)于堿性磷酸酶的分離純化鑒定第1頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月分離純化的一般程序選擇材料破碎細胞提取分離純化分析及鑒定第2頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中），AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），原理：第3頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月操作一、取材及勻漿取兔肝2g，剪碎，加入6ml0.01mol/L醋酸鎂和醋酸鈉混合液，充分勻漿。

記錄體積（取0.1ml至一新EP管留作A液，測定時稀釋25倍）二、提取加入2ml正丁醇，攪拌2min，室溫放置30min。過濾，留上清。計體積。第4頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月三、分離純化1、50％丙酮沉淀AKP

加入等體積丙酮，3000rpm×5min，留沉淀，加4ml0.5mol/L醋酸鎂溶解沉淀，記錄體積。（取0.1ml留作B液，稀釋10倍）2、30％乙醇溶解AKP

每ml溶液中加入95％乙醇0.46ml2000rpm×5min，留上清（記錄體積）3、60％乙醇沉淀AKP

每ml溶液中加入95％乙醇0.86ml3000rpm×5min，留沉淀，加3ml0.5mol/L醋酸鎂溶解沉淀，記錄體積。（取0.1ml留作C液，使用時稀釋5倍）第5頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月4、33％丙酮溶解AKP

每ml溶液中加入0.33ml丙酮

2000rpm×5min，留上清（記錄體積）5、50％丙酮沉淀AKP

每ml溶液中加入0.36ml丙酮

3000rpm×15min，留沉淀，

5mlPh8.8的Tris-醋酸鎂溶解沉淀（D液，不稀釋）第6頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月四、分析及鑒定1、堿性磷酸酶的活性測定（磷酸苯二鈉法）2、堿性磷酸酶蛋白含量測定（BCA法）3、比活性及純化倍數(shù)計算第7頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月分光光度法

（Spectrophotometry）根據(jù)物質(zhì)對不同波長的光線具有選擇性吸收（即可產(chǎn)生吸收光譜）的特性而建立起來的一種定量、定性分析的技術(shù)。也稱為吸收光譜法（Absorptionspectrometry）。不需要把欲分析的樣品從混合物中分離開來第8頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）基本原理

光具有波粒二相性。波長和頻率是光的波動性的特征。1、光的基本知識紫外分光光度計（200－400nm）可見光分光光度計（400－760nm）紅外分光光度計（760－1000nm）第9頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月2、定量分析的理論基礎－－Lambert—Beer定律A＝K·L·C吸光度(Aabsorbance,A)消光度(degreeofextinction,E)光密度(opticaldensity,D)K--吸光系數(shù),是物質(zhì)的特征性常數(shù)。第10頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月對比法進行定量分析A樣

=K·L·C樣A標

=K·L·C標A樣A標K·L·C樣K·L·C標C樣C標C樣

=A樣·C標/A標第11頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月單色光、平行光（λmax）溶液均勻、清澈、無散射溶液性質(zhì)穩(wěn)定，比色皿中無化學反應適用于稀溶液（A0.2-0.7）Lambert—Beer定律的適用范圍：第12頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月溶劑空白：當顯色劑及所用其它試劑在測定波長都沒有吸收峰時，可用純?nèi)軇?如蒸餾水)作參比溶液。試劑空白：當顯色前的樣品在測定波長沒有吸收峰，而顯色劑或其它試劑在測定波長處有吸收時，可用不加入樣品的“試劑空白”作參比溶液，這種方式最為常用。參比溶液的選擇第13頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月基本組件及常見分光光度計第14頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月分光光度計的使用1.打開電源預熱15分鐘2.選擇波長（λmax

）3.光標指向Trans4.打開光門，調(diào)節(jié)0％；關(guān)上光門調(diào)節(jié)100％5.重復4一次6.將光標指向ABS7.讀數(shù)第15頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月磷酸苯二鈉堿性磷酸酶苯酚

+磷酸鹽堿性苯酚

+4-氨基安替吡啉+鐵氰化鉀紅色醌式化合物AKP活性測定基本原理－－磷酸苯二鈉法第16頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月單位（ml）空白管標準管ABCD各階段稀釋液酚標準液（0.1mg/ml）Tris-醋酸鎂復合底物液//0.10.10.10.1/0.1////0.1/////333333酶活性單位（U/ml）=A樣A標×0.1×稀釋倍數(shù)37保溫15分鐘各管加入鐵氰化鉀液2ml，靜置15min510nm比色酚標準液濃度稀釋倍數(shù)(PH8.8tris醋酸鎂溶液）//251051第17頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白含量測定基本原理－－BCA法蛋白質(zhì)+Cu2＋

堿性BCA試劑紫色化合物Cu＋二喹啉甲酸，BCA第18頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月單位（ml）空白管標準管ABCD各階段稀釋液蛋白標準液（0.2mg/ml）

蒸餾水BCA試劑

//0.10.10.10.1/0.1////0.1/////1.51.51.51.51.51.5蛋白含量（mg/ml）=A樣A標×0.2×稀釋倍數(shù)37保溫30