代謝組學(xué)許國旺

代謝組學(xué)-方法與應(yīng)用

授課教師：吳敬教授授課時(shí)間：2009年11月1*目前一頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)“基因組學(xué)反映了什么是可以發(fā)生的，轉(zhuǎn)錄組學(xué)反映的是將要發(fā)生的，蛋白質(zhì)組學(xué)指出了賴以發(fā)生的，只有代謝組學(xué)才真正反映業(yè)已發(fā)生的?！薄S國旺2*目前二頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)第一章代謝組學(xué)的簡介

第二章代謝組學(xué)的研究方法第四章代謝組學(xué)的應(yīng)用第五章代謝組學(xué)的發(fā)展前景3*目前三頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)組學(xué)時(shí)代4種最重要的組學(xué)4*目前四頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)代謝組學(xué)（Metabonomics/Metabolomics）是通過考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。代謝組（metabolome）是基因組的下游產(chǎn)物也是最終產(chǎn)物，是一些參與生物體新陳代謝、維持生物體正常生長功能和生長發(fā)育的小分子化合物的集合，主要是相對分子量小于1000的內(nèi)源性小分子。代謝物數(shù)量因物種不同而差異較大：植物（200000種）、動物（2500種）、微生物（1500種）5*目前五頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新近發(fā)展起來的一門學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分別從基因和蛋白質(zhì)層面探尋生命的活動，而實(shí)際上細(xì)胞內(nèi)許多生命活動是發(fā)生在代謝物層面的，如細(xì)胞信號釋放（cellsignaling），能量傳遞，細(xì)胞間通信等都是受代謝物調(diào)控的。代謝組學(xué)正是研究代謝組（metabolome）——在某一時(shí)刻細(xì)胞內(nèi)所有代謝物的集合——的一門學(xué)科?；蚺c蛋白質(zhì)的表達(dá)緊密相連，而代謝物則更多地反映了細(xì)胞所處的環(huán)境，這又與細(xì)胞的營養(yǎng)狀態(tài)，藥物和環(huán)境污染物的作用，以及其它外界因素的影響密切相關(guān)。因此有人認(rèn)為，“基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)告訴你什么可能會發(fā)生，而代謝組學(xué)則告訴你什么確實(shí)發(fā)生了?！保˙illLasley,UCDavis）

6*目前六頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)198219831984198919992000200120022004VanDeGreef:

publicationofMSforurineprofilingSadler,BuckinghamandNicholson:

Firstpublicationon1H-NMRofbloodandplasmaNicholson,etal.:Multi-componentanalysisofspectradatafromraturineNicholsonandWilson:

NMRspectroscopyofbiofluidsNicholson:DefinitionofMetabonomicsHaselden,etal.:

FirstindependentPharmapublicationofMetabonomicsNicholson,Lindon,andHolmes:

PublicationinNatureonMetabonomicsHolmesandAnttiExplanationofstatisticsinMetabonomicsIncreasing#ofpublications第一章代謝組學(xué)簡介——代謝組學(xué)的發(fā)展7*目前七頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)代謝組學(xué)的特點(diǎn)：關(guān)注內(nèi)源化合物對生物體系的小分子化合物進(jìn)行定量定性研究上述化合物的上調(diào)和下調(diào)指示了與疾病、毒性、基因修飾或環(huán)境因子的影響上述內(nèi)源性化合物的知識可以被用于疾病的診斷和藥物篩選與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)相比，代謝組學(xué)有以下優(yōu)點(diǎn)：基因與蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化會在代謝物上得到放大，從而使檢測更容易代謝組學(xué)的研究不需要建立全基因測序及大量序列標(biāo)簽（EST）的數(shù)據(jù)庫代謝物的研究種類遠(yuǎn)小于蛋白質(zhì)的數(shù)目研究中采用的技術(shù)更通用8*目前八頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)

GenomicsandProteomicsarenotsufficienttodescribereasonsfortoxicityordiseasestate基因組學(xué)和蛋白組學(xué)對于毒性或疾病狀態(tài)的描述是不足的NeitherGenomicsnorProteomicscanproducetimecourseinformationwhichisimportantforanimaltoanimalcomparison基因組學(xué)和蛋白組學(xué)都不能提供動態(tài)信息，但這些信息對于動物間的比較是重要的Metaboliteprofilingproducesinformationonthebiochemicalpathwayseffected代謝物分析能提供生化途徑結(jié)果的信息Monitoringmetabolitesallowsconcurrentorsequentialaffectstobemonitored,e.g.blockingofametabolicpathwayinthelivercanleadtotoxicityinthebrain(hydrazine)代謝監(jiān)控可監(jiān)控即時(shí)或相繼的結(jié)果，例如：阻斷肝臟中代謝途徑會在腦中產(chǎn)生毒性肼Metabonomics,unliketheother“omics”isnon-invasive不像別的組學(xué)研究，代謝組學(xué)是無創(chuàng)的TheNeedforMetabonomicInformation9*目前九頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)代謝組學(xué)研究現(xiàn)狀

代謝組學(xué)屬于全局系統(tǒng)生物學(xué)（Globalsystemsbiology）研究方法，便于對復(fù)雜體系的整體進(jìn)行認(rèn)識．譬如，一個正常工作的人體包括“人體”本身和與之共同進(jìn)化而來且共生的消化道微生物群體（或稱菌群），孤立地研究“人體”本身的基因，轉(zhuǎn)錄子以及蛋白質(zhì)當(dāng)然可以為人們認(rèn)識人體生物學(xué)提供重要信息，但無法提供使人體正常工作不可缺少的菌群的信息．人體血液和尿液的代謝組卻攜帶著包括菌群在內(nèi)的每一個細(xì)胞的信息，因此代謝組學(xué)方法對研究如人體這樣復(fù)雜的進(jìn)化雜合體十分有效．10*目前十頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)不同器官組織具有不同的代謝輪廓，廣譜全采集11*目前十一頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)

代謝組學(xué)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到了包括藥物研發(fā),分子生理學(xué),分子病理學(xué),基因功能組學(xué),營養(yǎng)學(xué),環(huán)境科學(xué)等重要領(lǐng)域.在代謝組學(xué)誕生后的6年里,有關(guān)代謝組學(xué)的研究論文和專利以指數(shù)的形式逐年增長.12*目前十二頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)

代謝組學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)概念的誕生標(biāo)志著研究哲學(xué)由"還原論"向"整體論"的變化.系統(tǒng)生物學(xué)的中心任務(wù)就是要針對生物系統(tǒng)整體(無論它是生物細(xì)胞,多細(xì)胞組織,器官還是生物整體),建立定量,普適,整體和可預(yù)測(QUIP)的認(rèn)知.具體而言,系統(tǒng)生物學(xué)研究就是要將給定生物系統(tǒng)的基因,轉(zhuǎn)錄,蛋白質(zhì)和代謝水平所發(fā)生的事件,相關(guān)性及其對所涉及生物過程的意義進(jìn)行整體性認(rèn)識，從而出現(xiàn)了許多的"組"和"組學(xué)"的新概念.13*目前十三頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)現(xiàn)已提出的一百多個"組"和"組學(xué)",可以大體歸納為"基因組"/"基因組學(xué)","轉(zhuǎn)錄組"/"轉(zhuǎn)錄組學(xué)","蛋白質(zhì)組"/"蛋白質(zhì)組學(xué)"和"代謝組"/"代謝組學(xué)"四個方面.顯而易見,DNA,mRNA以及蛋白質(zhì)的存在為生物過程的發(fā)生提供了物質(zhì)基礎(chǔ)(但這個過程有可能不發(fā)生!),而代謝物質(zhì)所反映的是已經(jīng)發(fā)生了的生物學(xué)事件.因此代謝組學(xué)是對一個生物系統(tǒng)進(jìn)行全面認(rèn)識的不可缺少的一部分,是全局系統(tǒng)生物學(xué)(globalsystemsbiology)的重要基礎(chǔ)14*目前十四頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)第二章微生物代謝組學(xué)的研究方法ChallengesofMetabonomics

SampleComplexityandDataHandlingEachsamplehas..,

awiderangeofcompoundclasses

awidevariationinmetaboliteconcentrationsalargenumberofpotentialcomponentsEachgroupofsampleshas…,

manysampleanalysesarerequiredforstatisticalrelevance acomplexrawdatasetthatneedstobeprocessed differencesbetweensamplegroupswhichneedtobehighlighted15*目前十五頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)

代謝組學(xué)(metabonomics／metabolomics)是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想，對生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究方式，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其研究對象大都是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。先進(jìn)分析檢測技術(shù)結(jié)合模式識別和專家系統(tǒng)等計(jì)算分析方法是代謝組學(xué)研究的基本方法。

16*目前十六頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)

代謝組學(xué)利用高通量、高靈敏度與高精確度的現(xiàn)代分析技術(shù)，動態(tài)跟蹤細(xì)胞、有機(jī)體分泌出來的體液中的代謝物的整體組成，借助多變量統(tǒng)計(jì)方法，來辯識和解析被研究對象的生理、病理狀態(tài)及其與環(huán)境因子、基因組成等的關(guān)系?！按x組學(xué)”是一種整體性的研究策略，其研究策略有點(diǎn)類似于通過分析發(fā)動機(jī)的尾氣成分，來研究發(fā)動機(jī)的運(yùn)行規(guī)律和故障診斷等的“反向工程學(xué)”的技術(shù)思路。由于代謝組學(xué)著眼于把研究對象作為一個整體來觀察和分析，也被稱為“整體的系統(tǒng)生物學(xué)”。

17*目前十七頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)研究方法和步驟樣品制備：足量的代表性樣品（-80℃保存）2.數(shù)據(jù)采集和標(biāo)志物識別：常用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、NMR3.數(shù)據(jù)分析：PCA、PLS、ANN4.代謝途徑分析：代謝輪廓分析和代謝組學(xué)分析18*目前十八頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)Thestrategyforlargescalemetabonomicsresearch19*目前十九頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)樣品制備微生物代謝物樣品的制備一般分為微生物培養(yǎng)、淬滅和代謝產(chǎn)物的提取。根據(jù)研究對象、目的和采用的分析技術(shù)不同,所需的樣品提取和預(yù)處理方法各異，不存在一種普適性的標(biāo)準(zhǔn)化方法。微生物代謝組學(xué)研究要求微生物的生長條件是可以控制和重復(fù)的。在一個生物反應(yīng)器中，需要嚴(yán)格控制溫度、pH、培養(yǎng)基組成、溶解氧和二氧化碳等以明確界定生長條件，建立標(biāo)準(zhǔn)的和可重復(fù)的參考培養(yǎng)條件。微生物的培養(yǎng)可以以分批、補(bǔ)料或者連續(xù)培養(yǎng)模式進(jìn)行。由于連續(xù)培養(yǎng)的菌體生理穩(wěn)定，易于控制且重現(xiàn)性較好，所以，大多數(shù)研究者傾向于應(yīng)用生物反應(yīng)器連續(xù)培養(yǎng)操作模式。

20*目前二十頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)在樣品淬滅和代謝物的提取過程中，應(yīng)遵循的原則是：（1）淬滅工藝最好可以立即凍結(jié)細(xì)胞代謝（2）在淬滅過程中要求細(xì)胞膜無明顯損傷，以免胞內(nèi)代謝物外泄。（3）提取過程中應(yīng)該盡可能多的提取胞內(nèi)代謝物。（4）代謝產(chǎn)物不應(yīng)該遇到任何物理或化學(xué)修飾。（5）得到的樣品基質(zhì)應(yīng)與所選擇的分析方法相容。冷甲醇、液氮和熱乙醇是最常用的淬滅方法，而在提取方面由于特定的提取條件往往僅適合某些類化合物目前尚無一種能夠適合所有代謝產(chǎn)物的提取方法應(yīng)該根據(jù)不同的化合物選擇不同的提取方法，并對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

21*目前二十一頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)

對獲得的樣品中所有代謝物進(jìn)行分析鑒定是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟，也是最困難和多變的步驟。

與原有的各種組學(xué)技術(shù)只分析特定類型的物質(zhì)不同，代謝組學(xué)分析對象的大小、數(shù)量、官能團(tuán)、揮發(fā)性、帶電性、電遷移率、極性以及其他物理化學(xué)參數(shù)差異很大，要對它們進(jìn)行無偏向的全面分析，單一的分離分析手段往往難以保證。色譜、質(zhì)譜、核磁共振、紅外光譜、庫侖分析、紫外吸收、熒光散射、發(fā)射性檢測和光散射等分離分析手段及其組合都被應(yīng)用于代謝組學(xué)的研究。

22*目前二十二頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)23*目前二十三頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)一般來說,選擇代謝物組學(xué)分析方法時(shí),其原則是要同時(shí)考慮儀器和技術(shù)的檢測速度、選擇性和靈敏度,找到一種最適合目標(biāo)化合物的方法。

化學(xué)分析技術(shù)中最常用的是1H核磁共振(1HNMR)以及色譜質(zhì)譜聯(lián)用(X-MS)，如氣相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS)、液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS)和毛細(xì)管電泳耦聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(CE/MS)來分析研究代謝物并為其繪制圖譜。這些技術(shù)的耦聯(lián)可以提高對樣品的分辨率、敏感性及選擇度,有利于對更多的生物體系內(nèi)的代謝物繪制圖譜。24*目前二十四頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)GC/MS、LC/MS和CE/MS可以同時(shí)檢測出數(shù)百種化合物，包括糖類、有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代謝物。GC/MS有很好的分離效率且相對較為經(jīng)濟(jì)，但需要對樣品進(jìn)行衍生化預(yù)處理，這一步驟會耗費(fèi)額外的時(shí)間，甚至引起樣品的變化。受此限制，GC/MS無法分析膜脂等熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)和分子量較大的代謝產(chǎn)物。近來，多維分離技術(shù)如二級氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC-GC-TOF-MS），檢測范圍更廣，但由于實(shí)際應(yīng)用困難和花費(fèi)較高等問題使其并未普遍使用。

25*目前二十五頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)HPLC與GC原理相似，但在進(jìn)樣前不需進(jìn)行衍生化處理，適合那些不穩(wěn)定、不易衍生化、不易揮發(fā)和分子量較大的化合物。HPLC/MS選擇性和靈敏度都較好，但分析的時(shí)間相對較長，且需依賴純的參照物。CE-MS分離樣品效率比普通的色譜質(zhì)譜聯(lián)用要高得多，僅需要極少的進(jìn)液量nL），而且其測試時(shí)間短，試劑成本低。CE-MS在微生物代謝組領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。色譜質(zhì)譜連用技術(shù)具有分離效率高、靈敏度好及經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。但需要解決的主要問題是：大量色譜峰的識別問題以及方法的重現(xiàn)性問題。26*目前二十六頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)NMR是當(dāng)前代謝組學(xué)研究中的主要技術(shù)首先，不同于質(zhì)譜具有離子化程度和基質(zhì)干擾等問題，NMR沒有偏向性，對所有化合物的靈敏度是一樣的；其次，NMR無損傷性，不破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可在一定的溫度和緩沖液范圍內(nèi)選擇實(shí)驗(yàn)條件，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)和動態(tài)的檢測；此外，NMR氫譜的譜峰與樣品中各化合物的氫原子是一一對應(yīng)的，所測樣品中的每一個氫原子在圖譜中都有其相關(guān)的譜峰，圖譜中信號的相對強(qiáng)弱反映樣品中各組分的相對含量，更為直觀。因此，NMR方法很適合研究代謝產(chǎn)物中的復(fù)雜成分。與GC/MS和LC/MS相比，NMR的缺點(diǎn)是靈敏度低，有可能形成信號重疊，且其對樣品制備的要求很高。同時(shí)因?yàn)閯討B(tài)范圍有限，很難同時(shí)測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產(chǎn)物。

27*目前二十七頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)數(shù)據(jù)分析平臺

在代謝組學(xué)研究中，大多數(shù)是從檢測到的代謝產(chǎn)物信息中進(jìn)行兩類(如基因突變前后的響應(yīng))或多類(如不同表型間代謝產(chǎn)物)的判別分類以及生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。由于生物樣品的組成復(fù)雜，在得到分析對象的原始譜圖后，首先需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理(歸一化和濾噪)，消除干擾因素，保留有用信息。數(shù)據(jù)的解析可分為如下3個基本步驟：(1)提取出色譜分離后未能有效分開的代謝物峰并得出其相應(yīng)濃度；(2)根據(jù)其保留時(shí)間及質(zhì)譜圖等信息鑒別有效峰所代表的化合物；(3)根據(jù)代謝數(shù)據(jù)建立代謝網(wǎng)絡(luò)模型。28*目前二十八頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)

代謝組學(xué)分析得到的是信息含量豐富的多維數(shù)據(jù)，應(yīng)用模式識別和多維統(tǒng)計(jì)分析等方法能從這些大量的數(shù)據(jù)中充分挖掘出其中的信息，這些方法能夠?yàn)閿?shù)據(jù)降維，使它們更易于可視化和分類。目前數(shù)據(jù)分析常用的兩類算法是基于尋找模式的非監(jiān)督方法(unsupervisedmethod)和有監(jiān)督方法(supervisedmethod)。

非監(jiān)督方法是用來探索完全未知的數(shù)據(jù)特征的方法，對原始數(shù)據(jù)信息依據(jù)樣本特性進(jìn)行歸類，把具有相似特征的目標(biāo)數(shù)據(jù)歸在同源的類里，并采用相應(yīng)的可視化技術(shù)直觀地表達(dá)出來。應(yīng)用在此領(lǐng)域的常見方法有聚類分析(clusteranalysis)和主成分分析(principalcomponentsanalysis，PCA)等。

29*目前二十九頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)聚類分析依據(jù)物以類聚的原理分析具有相似性的事物，將分類對象置于一個多維空間中，根據(jù)事物彼此不同的屬性進(jìn)行辨認(rèn)，將性質(zhì)相近的歸入一類，這樣歸在同一類的事物具有高度的相似性；聚類分析就是把事物按其相似程度進(jìn)行分類，并找出每一類事物共同特征的分析工具。

具體到代謝組學(xué)中，被歸入一類的物質(zhì)有相同的特征，可能有相同的功能作用，這樣通過同一類事物中一個研究較為清晰的物質(zhì)可以推斷該類中其他物質(zhì)的功能作用。聚類分析過程通常可分為以下步驟：數(shù)據(jù)收集并且收集相應(yīng)的變量；產(chǎn)生一個相似矩陣；決定把目標(biāo)總體細(xì)分為幾類，及其對每一種類別相應(yīng)的定義；實(shí)施聚類分析，產(chǎn)生結(jié)果。

30*目前三十頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)主成分分析是目前應(yīng)用最為廣泛的多維分析方法之一。PCA的特點(diǎn)是將分散在一組變量上的信息集中到某幾個綜合指標(biāo)，即主成分(principalcomponent，PC)上，利用這些主成分來描述數(shù)據(jù)集內(nèi)部結(jié)構(gòu)，實(shí)際上也起著數(shù)據(jù)降維的作用。主成分是由原始變量按一定的權(quán)重經(jīng)線性組合而成的新變量。這些變量具有以下性質(zhì)：1)每一個PC之間都是正交的；2)第1個PC包含了數(shù)據(jù)集的絕大部分方差，第2個次之，依此類推。這樣，由頭2個或3個PC作圖，就能夠很好地代表數(shù)據(jù)集所包含的生物化學(xué)變化

31*目前三十一頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)有監(jiān)督方法如果存在一些有關(guān)數(shù)據(jù)的先驗(yàn)消息和假設(shè)，有監(jiān)督方法比非監(jiān)督方法更適合且更有效。有監(jiān)督方法在已有知識的基礎(chǔ)上建立信息組(classinformation)，并利用所建立的組對未知數(shù)據(jù)進(jìn)行辨識、歸類和預(yù)測。在這類方法中，由于建立模型時(shí)有可供學(xué)習(xí)利用的訓(xùn)練樣本，所以稱為有監(jiān)督學(xué)習(xí)。應(yīng)用于該領(lǐng)域的常見方法有線性判別分析(lineardiscriminationanalysis)、偏最小二乘法-顯著性分析(PLS-discriminationanalysis)和人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)(artificialneuralnetworks，ANN)32*目前三十二頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫在信息時(shí)代，代謝組學(xué)的分析離不開各種代謝途徑和升華數(shù)據(jù)庫，利用網(wǎng)絡(luò)資源進(jìn)行研究是必不可少的，與基因組學(xué)和蛋白組學(xué)已有較完善的數(shù)據(jù)庫供搜索使用相比，目前代謝組學(xué)研究尚無類似的功能完備數(shù)據(jù)庫。DOME(/dome.html)有許多關(guān)于代謝物的原始數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，分析結(jié)果用多維統(tǒng)計(jì)軟件處理后可用于OMEs的瀏覽器(BROME)瀏覽。

MetaCyc()是一個關(guān)于代謝物的數(shù)據(jù)庫，闡述了超過150種生物體中的代謝途徑，包含了從大量的文獻(xiàn)和網(wǎng)上資源中得到的代謝途徑、反應(yīng)、酶和底物的資料。

MMP(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme)對主要代謝途徑及涉及的關(guān)鍵酶進(jìn)行了詳盡的描述。

ArMet()是一個涵蓋大部分植物代謝組學(xué)研究工作的網(wǎng)站，包含了這些工作開展的時(shí)間，甚至還有詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟，并將代謝物信息標(biāo)準(zhǔn)化，以便于研究者交流。33*目前三十三頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)第三章代謝組學(xué)的應(yīng)用代謝組學(xué)在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用

(一)微生物分類,突變體篩選以及功能基因研究

經(jīng)典的微生物分類方法多根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)以及對不同底物的代謝情況進(jìn)行表型分類。最近,隨著分子生物學(xué)的突飛猛進(jìn),基因型分類方法如16SrDNA測序,DNA雜交以及PCR指紋圖譜等方法得到了廣泛應(yīng)用。然而,某些菌株按照基因型與表型兩類方法分類會得出不同的結(jié)果。因此,根據(jù)不同的分類目的聯(lián)合應(yīng)用這兩類方法已成為一種趨勢。BIOLOG等方法在表型分類中應(yīng)用較為廣泛,但是,代謝譜分析方法(metabolicprofiling)異軍突起,逐漸成為一種快速、高通量,全面的表型分類方法。34*目前三十四頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)采用代謝組分類時(shí),可以通過檢測胞外代謝物來加以鑒別。常用的胞外代謝物檢測方法為樣品衍生化后進(jìn)行GC2MS分析、薄層層析或HPLC2MS分析,最后通過特征峰比對進(jìn)行分類。Bundy等采用NMR分析代謝譜成功地區(qū)分開臨床病理來源以及實(shí)驗(yàn)室來源的不同桿菌(bacilluscereus)。除了表型分類外,代謝組學(xué)數(shù)據(jù)可以應(yīng)用于突變體的篩選。在傳統(tǒng)研究中的沉默突變體(即未發(fā)生明顯的表型變化的突變體)內(nèi),突變基因可能導(dǎo)致了某些代謝途徑發(fā)生變化,通過代謝快照(metabolicsnapshot)可以發(fā)現(xiàn)該突變體并研究相應(yīng)基因的功能。35*目前三十五頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)(二)發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化

發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化需要檢測大量的參數(shù),利用代謝組學(xué)研究工具可以減少實(shí)驗(yàn)數(shù)量,提高檢測通量,并有助于揭示發(fā)酵過程的生化網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,從而有利于理性優(yōu)化工藝過程。Buchholz等采用連續(xù)采樣的方法研究了大腸桿菌在發(fā)酵過程中的代謝網(wǎng)絡(luò)的動力學(xué)變化。他們在葡萄糖缺乏的培養(yǎng)液培養(yǎng)的大腸桿菌中加入葡萄糖,并迅速混勻,按每秒4～5次的頻率連續(xù)取樣。利用酶學(xué)分析、HPLC/LC2MS等手段監(jiān)測樣品中多達(dá)30種以上的代謝物、核苷以及輔酶,從而解析了葡萄糖以及甘油的代謝途徑和底物攝取體系。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析建模,發(fā)現(xiàn)在接觸葡萄糖底物后的15～25s范圍內(nèi),大腸桿菌體內(nèi)發(fā)生的葡萄糖代謝物變化與經(jīng)典生化途徑相符,但隨后的過程則與經(jīng)典途徑不符,推測可能存在新的未知調(diào)控步驟。Takors認(rèn)為,通過上述代謝動力學(xué)研究,掌握代謝途徑及網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵參數(shù),將直接有利于代謝工程的優(yōu)化,包括菌株的理性優(yōu)化以及發(fā)酵參數(shù)的調(diào)控。

36*目前三十六頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)(三)環(huán)境微生物研究

微生物降解是環(huán)境中去除污染物的主要途徑。深入了解污染物在微生物內(nèi)的代謝途徑,將有助于人們優(yōu)化生物降解的條件,從而實(shí)現(xiàn)快速的生物修復(fù)。這些代謝中間體大都通過萃取、分析方法進(jìn)行逐個研究,并借助專家經(jīng)驗(yàn)擬合出代謝途徑,其動力學(xué)過程亦很少觸及。代謝組學(xué)方法的采用有可能改變這一現(xiàn)狀。Boersma等采用代謝組學(xué)方法研究氟代酚的微生物降解途徑。氟代化合物具有特殊的19F核磁共振屬性,19F的核磁共振靈敏度與1H核相近;由于生物體內(nèi)無內(nèi)源性19F核磁信號,因而無本底干擾。所有19F核磁信號均可歸結(jié)于異生素及其代謝物。19F核的化學(xué)位移值寬,約為700ppm(1H為15ppm,13C為250ppm)。較寬的化學(xué)位移導(dǎo)致19F在不同取代物的峰圖不易產(chǎn)生重疊。因此,借助核磁共振技術(shù)可以更方便地研究含氟化合物的代謝中間體。37*目前三十七頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)代謝生物學(xué)在藥物研發(fā)和疾病研究中的應(yīng)用代謝組學(xué)在疾病動物模型的確證、藥物的篩選、藥效及毒性評價(jià)、作用機(jī)制和臨床評價(jià)等方面有著廣泛的應(yīng)用。Nicholson研究小組利用NMR代謝組學(xué)技術(shù)，在藥物毒性評價(jià)方面開展了深入研究，結(jié)果表明代謝組學(xué)方法可判斷毒性影響的組織器官極其位點(diǎn)，推測藥物相關(guān)作用機(jī)制確定與毒性有關(guān)的簽字生物標(biāo)志物；變在此基礎(chǔ)上建立棵供毒性預(yù)測的專家系統(tǒng)及毒物影響動物內(nèi)源性代謝物隨時(shí)間的變化軌跡。代謝組學(xué)在疾病的研究中的應(yīng)用主要包括病變標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、疾病的診斷、治療和愈后的判斷。目前報(bào)道較多在疾病研究的應(yīng)用，如新生兒的代謝紊亂、冠心病、膀胱炎、高血壓和精神系統(tǒng)疾病等。38*目前三十八頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)

Nicholson及其工作組發(fā)現(xiàn)了給予氨基半乳糖的大鼠可以被分為有反應(yīng)和無反應(yīng)兩組，而這兩組動物可以根據(jù)它們在給藥前的尿代謝物來區(qū)分，他們第一次提到藥物代謝組學(xué)的概念，并將其定義為“根據(jù)用藥前代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)來預(yù)測對個人進(jìn)行藥物或外來物的干預(yù)的結(jié)果”。39*目前三十九頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)NMRAcquisitionandGilson215ControlSystemNMRflowprobeN2

gasVarianInova600Shieldedmagnet120ulflowprobeGilson215autosamplerBiomek?RobotRefrigeratedMetabolismCage(0oC.)FrozenStorage+NaN3DeuteratedBufferTSPDataProcessing40*目前四十頁\總數(shù)四十五頁\編于十八點(diǎn)SynthesisEfficacy/HTSEfficacy/InVivoLeadTOXINDP1P2P3