凋膜止崩液對雌激素負(fù)荷去勢大鼠

?:?敬請各位老師蒞臨指導(dǎo)！陜西中醫(yī)學(xué)院凋膜止崩液對雌激素負(fù)荷去勢大鼠P、PR、GnRHR的影響,、?，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?￡>實(shí)驗(yàn)研究\3>實(shí)驗(yàn)結(jié)果3結(jié)論?研究不同劑量凋膜止崩液對雌激素負(fù)荷去勢大鼠P、PR、GnRHR的影響，揭示藥物在有效部位靶向干預(yù)條件下，HPOA（下丘腦-垂體-卵巢軸）調(diào)節(jié)通道靶端藥物效應(yīng)機(jī)制，探討藥物靶向治療無排卵型功能失調(diào)性子宮出血（ADUB）的分子生物學(xué)機(jī)制，為藥物的臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)材料☆實(shí)驗(yàn)動物健康雌性SD大鼠，體重200g+20go購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。☆主要藥品及試劑凋膜止崩液制劑20ml,陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系提供（組成成分：鴉膽子、莪術(shù)、延胡索）☆主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備實(shí)驗(yàn)研究___實(shí)驗(yàn)方法A組:空白組（假手術(shù)組）B組:模型組（去勢手術(shù)+體內(nèi)雌激素誘導(dǎo)）」C組:小劑量組（模型+凋膜止崩液小劑量）,D組:大劑量組（模型+凋膜止崩液大劑量）B組：行去勢手術(shù)，術(shù)后第三天起肌肉注射苯甲酸雌二醇0.15mg/100g體重，隔日一次，連續(xù)4周。于第5天雙側(cè)宮腔注射0.9%生理鹽水0.3ml/側(cè)。A組：開關(guān)腹手術(shù)，術(shù)后第三天起用高壓滅菌花生油0.3ml/200g體重，隔日肌注一次，連續(xù)4周，觀察大鼠性周期，于動情前期處死取樣。C組：手術(shù)步驟及苯甲酸雌二醇給藥同B組，于給藥后第5天雙側(cè)宮腔注射凋膜止崩液小劑量。D組：手術(shù)步驟及苯甲酸雌二醇給藥同B組，于給藥后第5天雙側(cè)宮腔注射凋膜止崩液大劑量。實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)方法?大鼠局部宮腔用藥，去除子宮內(nèi)膜增生過長的相關(guān)研究尚未有明確報(bào)道，各組大鼠宮腔的用藥量則是根據(jù)臨床人的常用量為0.05g,按各組宮腔內(nèi)注藥量9有效部位提取率及人與大鼠體表面積比，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)研究的數(shù)據(jù)，計(jì)算出的每100克體重大鼠的宮腔灌注量，確定的給藥劑量分別為：?:?C組：0.0005mg/O.3ml/側(cè)?D組：0.001mg/0.3ml/側(cè)—實(shí)驗(yàn)方法?:，放射免疫法測定血清中孕激廠一一一^一一^素含量「觀測指標(biāo)一J?:?連續(xù)陰道涂片查大鼠性周期?:?子宮內(nèi)膜PR、GnRHR免疫組織化學(xué)染色采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)理數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性，以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（X土S）表示,組間差異比較用單因素方差分析，以PC0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.01為有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)研究L標(biāo)準(zhǔn)管加膜式電動吸引器吸取上清液Q煩寐動36。"心’1標(biāo)準(zhǔn)管、3ml-5ml3500r/min（NBS、A、B、C、D、E、F、G）+200卩I標(biāo)準(zhǔn)品加分離劑500|jlOng/ml.Ong/ml、0.lng/ml.0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/mk30ng/ml>100ng/m+標(biāo)記物200（dl1+抗體200卩1（除NSB中加蒸4奪K）37°C電熱恒溫水箱30minUZ連細(xì)I道涂片查大鼠，關(guān)甄二＞,，?大鼠性周期分為四個時期，以動情前期的雌激素水平相對較高，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增生較好，利于受體指標(biāo)的測定及分析子宮內(nèi)膜的生理生物學(xué)機(jī)制。?用細(xì)棉簽以0.9%生理鹽水濕潤后輕輕插入大鼠陰道內(nèi)約0.5cm,慢慢轉(zhuǎn)動一下取出，將帶有陰道分泌物的棉簽在載玻片的后1/3處均勻轉(zhuǎn)動、涂片，在空氣中干燥，放入95%酒精中固定，HE染色，然后在顯微鏡下觀察陰道涂片的細(xì)胞學(xué)變化，以確定大鼠動情周期的不同階段。1DAB顯實(shí)驗(yàn)研究色二2復(fù)染ZX2尹片免疫組化染色強(qiáng)度評定參照Salvesen評分方法，顯微鏡下觀察增生過長子宮內(nèi)膜細(xì)胞胞核或胞漿甲出現(xiàn)的棕黃色或褐色顆粒為陽性細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，染色顆粒定位良好，顆粒染色明顯高于背景。每張切片隨機(jī)連續(xù)觀察5個高倍鏡視野，每個視野觀察100個細(xì)旋中陽性細(xì)砲的個數(shù)，求平珀值，并由此計(jì)算出陽性細(xì)胞的表達(dá)率。____—53^MP^GnRHR免疫組紀(jì)礙染色一二實(shí)驗(yàn)結(jié)果血清中孕激素水平各組大鼠血清孕激素含量的比較組別空白組模型組小劑量組大劑量組動物數(shù)10101010P(ng/ml)12.25±6.69。20.90±16.7161.73±52.00，56.52±53.19bd注：與模型組比較,aP<0.01,bP<0.05,cP>0.05;與小劑量組比較,dP>0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果血清中孕激素水平IIbd孕激素孕激素空白組對照組小劑量組大劑量蛆注：與模型組比較，aPvO.01,bPv0.05,cP>0.05;與小劑量組比較，dP>0.05o圖1各組血清孕激素示意圖實(shí)驗(yàn)結(jié)果血清中孕激素水平血清中孕激素水平：與空白組比較，模型組P值僅輕度增高，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與模型組比較，小劑量組、大劑量組孕激素水平有不同程度的升高，小劑量組有顯著性差異（P<0.01）,大劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）小劑量組與大劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。'實(shí)驗(yàn)結(jié)果子宮內(nèi)膜PR的表達(dá)各組大鼠孕激素受體陽性細(xì)胞的表達(dá)組別空白組模型組小劑量組大劑量組動物數(shù)10101010PR16.30±11.94a30.58±20.105.14±3.11b2.97±1.85bd注：與模型組比較，aP<0.05,bP<0.01,cP>0.05;與小劑量組比較,dP>0.05o實(shí)驗(yàn)結(jié)果子宮內(nèi)膜PR的表達(dá)孕激素受體空白組模型組小劑量組大劑量組圖2各組大鼠孕激素受體表達(dá)示意圖注：與模型組比較，aP<0.05,bP<0.01,cP>0.05;與小劑量組比較，dP>0.05。A組：陽性細(xì)胞呈少量、散在分布B組:呈現(xiàn)較多含棕黃色顆粒的陽性細(xì)胞C組：少量白細(xì)胞浸潤，可見陽性細(xì)胞D組：大量白細(xì)胞浸潤，偶見陽性細(xì)胞(10x20)實(shí)驗(yàn)結(jié)果子宮內(nèi)膜PR的表達(dá)：?子宮內(nèi)膜PR的表達(dá)：孕激素受體（PR）陽性細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒，空白組大鼠子宮內(nèi)膜可見PR陽性細(xì)胞呈少量散在分布；模型組大鼠子宮內(nèi)膜PR陽性細(xì)胞密度有所增強(qiáng)，二者陽性表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;小劑量組及大劑量組PR陽性細(xì)胞明顯降低，甚至無，與模型組比較有顯著性差異（PV0.01）;小劑量組與大劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。―/實(shí)驗(yàn)結(jié)果子宮內(nèi)膜GnRHR的表達(dá)各組大鼠促性腺激素釋放激素受體陽性細(xì)胞的表達(dá)組別空白組模型組小劑量組大劑量組動物數(shù)10101010GnRHR12.16±8.62c14.01±8.285.16±3.10b3.48±2.13bd注：與模型組比較，aP<0.05,bP<0.01,cP>0.05;與小劑量組比較,dP>0.05o實(shí)驗(yàn)結(jié)果子宮內(nèi)膜GnRHR的表達(dá)空白組模型組小劑量組大劑量組圖4各組大鼠GnRHR表達(dá)示意圖注：與模型組比較，aP<0.05,GnRHRbP<0.01,cP>0.05;與小劑量組比較,dP>0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果子宮內(nèi)膜GnRHR的表達(dá)A組：陽性細(xì)胞呈少量、散在分布B組：陽性細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒C組：少量白細(xì)胞浸潤，可見陽性細(xì)胞D組：大量白細(xì)胞浸潤，偶見陽性細(xì)胞(10x20)實(shí)驗(yàn)結(jié)果子宮內(nèi)膜GnRHR的表達(dá)?促性腺激素釋放激素受體（GnRHR）陽性細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。空白組大鼠子宮內(nèi)膜可見GnRHR陽性細(xì)胞呈少量、散在分布，模型組大鼠子宮內(nèi)膜GnRHR陽性細(xì)胞密度無明顯增強(qiáng)，二者陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,小劑量組及大劑量組陽性細(xì)胞明顯降低，甚至無，與模型組比較有顯著性差異（P<0.01）;小劑量組與大劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)之前，根據(jù)前期的動物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察系列研究，有步驟地進(jìn)行了周密的預(yù)實(shí)驗(yàn)，為正式試驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)，預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)論如下：①模型：腺體發(fā)育及背靠背現(xiàn)象|&最佳珀藥方法和用藥劑量,子宮內(nèi)膜去除厚度理想；'③大鼠無?明顯毒性反應(yīng)「④人與Q鼠的用藥比例，為臨床合理用藥奠定知出；為從造膜奇局部用藥，解剖學(xué)的相關(guān)研究趨于成熟，為分子生物學(xué)研笆打下基答實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論A結(jié)合人與大鼠的用藥比例大鼠卵巢切除大鼠子宮內(nèi)膜、陰道粘膜細(xì)胞與人一樣，受排卵前后雌、孕激素水平的影響而發(fā)生周期性的變化人電子顯微鏡下顯示：大鼠子宮內(nèi)膜厚度增加，腺魏鬻毎齬備細(xì)月包病理切片苯甲酸雌二醇肌注多或暫持子膜諸RH生的，內(nèi)界Gn發(fā)膜抗宮外，面內(nèi)拮子或節(jié)方宮的的部調(diào)節(jié)子素致內(nèi)互調(diào)對激導(dǎo)體相或素孕而機(jī)的出激之生是0A釋雌缺增的HP在，而續(xù)O血響素化激持長功影激變刺膜過素巢性性內(nèi)生因卵即續(xù)宮增討論?功血的局部治療以破壞和消融內(nèi)膜甚至淺肌層為重要途徑，現(xiàn)代多采用子宮內(nèi)膜電切除術(shù)，冷凍、微波子宮內(nèi)膜去除術(shù)和宮腔灌注順柄、無水乙醇、止血消炎藥等治法。但每種方法都不同程度的存在著一定的弊端：如術(shù)后并發(fā)癥，且藥物治療的遠(yuǎn)期療效作用機(jī)制尚不明確，無確定的較為理想的治療方案，故本實(shí)驗(yàn)未設(shè)立陽性對照藥物組，而是采用了組間相互對照的原則，用開關(guān)腹空白組、模型組和兩個不同劑量組進(jìn)行比較，更好的顯示由空白組、模型組與藥物組之間的差異。窿調(diào)ER、抑制雌激素介導(dǎo)的腫瘤基因、、轉(zhuǎn)錄，抑制癌細(xì)胞的生長、促進(jìn)雌激素從細(xì)胞內(nèi)排出，拮抗雌激素，對下丘腦■垂體.卵巢軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)，抑制FSH和LH的分泌，抑制GnRH的分泌。在子宮內(nèi)膜腺上皮內(nèi)表達(dá)PR。丿（P、PR）采用天然安宮黃體酮及合成黃體酮拮抗雌激素，逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜增生過長和子宮內(nèi)膜腺癌的治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論生理學(xué)機(jī)制〔孕激素子宮內(nèi)膜增生過長臨床研究I討論箋顫旨標(biāo)（GnRHR）?GnRH由下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞合成，其刺激黃體生成素LH和促卵泡素FSH的合成與釋放，調(diào)節(jié)卵巢和黃體的正常發(fā)育，維持正常生殖生理功能。（生理功能）?性激素可調(diào)節(jié)GnRH的分泌，GnRH可促進(jìn)其效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生更多的GnRHR,GnRHR是介導(dǎo)GnRH功能必不可少的物質(zhì)?？囱芯勘砻髯訉m內(nèi)膜受到GnRH的直接和/或間接的作用，GnRH與其作用部位的受體結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)，作用的大小與作用部位受體的水平有關(guān)。（效應(yīng)機(jī)制）?GnRHR在生育年齡女性整個月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，無論是在增殖期還是黃體期的子宮內(nèi)膜上。也有研究發(fā)現(xiàn)在單純型增生子宮內(nèi)膜、復(fù)雜型增生子宮內(nèi)膜、非典型增生子宮內(nèi)膜組織中均有不同程度的表達(dá)。（生理病理表達(dá)）討論孕激素屬于類固醇激素，傳統(tǒng)理論認(rèn)為人體類固醇激素在腎上腺皮質(zhì)、性腺和胎盤組織中合成,這些類固醇激素分別調(diào)節(jié)人體各種生理功能及代謝過程。近年來的研究表明神經(jīng)系統(tǒng)自身也可以合成并分泌類固醇激素，不需外周內(nèi)分泌腺的幫助，實(shí)驗(yàn)中大鼠已經(jīng)去勢，所以孕激素只可能由腎上腺皮質(zhì)或由神經(jīng)苗體細(xì)胞通過代償直接分泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論結(jié)合30-羥類固醇脫氫異構(gòu)酶上腺皮月DL受體膽固醇n［轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白膽固醇脂—游離膽固醇至邀素合成j損理＞細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶律經(jīng)膠質(zhì)細(xì)月線粒體/實(shí)驗(yàn)結(jié)果