上海市臨檢中心 PCR人員上崗培訓(xùn)班 課件3、PCR 質(zhì)量控制2016.3.21 肖艷群

分子診斷質(zhì)量管理基本內(nèi)容和要求上海市臨床檢驗(yàn)中心肖艷群質(zhì)量管理內(nèi)涵

質(zhì)量管理就是建立一個(gè)體系，使在實(shí)驗(yàn)的全過程中所有影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的環(huán)節(jié)都處于受控狀態(tài)，保證每個(gè)環(huán)節(jié)的協(xié)調(diào)和統(tǒng)一，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果始終可靠分子診斷質(zhì)量管理要求制定依據(jù)

《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2006]73號(hào)）

《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]194號(hào)）

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則

ISO15189(CNAS-CL02)

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明（CNAS-CL36）

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在組織病理學(xué)檢查領(lǐng)域的應(yīng)用說明（CNAS-CL37）基本內(nèi)容

質(zhì)量管理體系

人員

實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、環(huán)境和設(shè)施

設(shè)備與材料

實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)

分析前質(zhì)量控制

分析過程質(zhì)量控制

分析后質(zhì)量控制一、質(zhì)量管理體系

分子診斷實(shí)驗(yàn)室管理

質(zhì)量管理體系建立

文件和記錄管理分子診斷實(shí)驗(yàn)室管理要求

醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)集中設(shè)置，統(tǒng)一管理

以科研為目的的分子檢測(cè)項(xiàng)目,不得向臨床出具檢驗(yàn)報(bào)告,不得向病人收取任何費(fèi)用質(zhì)量管理體系建立

作用?

建立并保持質(zhì)量管理體系有效運(yùn)行的重要基礎(chǔ)?

規(guī)范各項(xiàng)工作，保證工作質(zhì)量

內(nèi)容：質(zhì)量手冊(cè)、程序文件、操作規(guī)程、記錄注意：適合自身實(shí)際情況，可操作性寫你所做的、做你所寫的、記你所做的質(zhì)量管理體系建立

編制實(shí)驗(yàn)室管理文件，應(yīng)包括但不限于以下文件或程序1.組織和人員管理方面的文件，應(yīng)包括實(shí)驗(yàn)室各類人員的崗位職責(zé)、崗位培訓(xùn)、繼續(xù)教育以及定期考核2.

環(huán)境、設(shè)施及安全管理3.

儀器、設(shè)備的采購、驗(yàn)收、使用、維修、校準(zhǔn)4.

檢驗(yàn)試劑及其他相關(guān)消耗品的采購、驗(yàn)收、保管、領(lǐng)用及使用5.

樣品的采集、運(yùn)送、接收、處理及保存6.

檢驗(yàn)方法的選擇、確認(rèn)或驗(yàn)證7.

檢驗(yàn)項(xiàng)目及儀器設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)操作程序的建立和管理8.

檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量保證9.

檢驗(yàn)報(bào)告管理的規(guī)定。其中包括結(jié)果的發(fā)放方式，報(bào)告的格式和內(nèi)容，以及有關(guān)保護(hù)患者隱私的規(guī)定10.

記錄的管理文件或程序，其中應(yīng)包括記錄的修改、保存及期限等要求11.

對(duì)差錯(cuò)事故及不符合工作的糾正及預(yù)防措施12.

對(duì)服務(wù)對(duì)象投訴處理

實(shí)驗(yàn)室所有的文件、程序應(yīng)完整、清晰，現(xiàn)行有效記錄管理

原始記錄和質(zhì)量記錄應(yīng)完整、清晰，電子記錄應(yīng)定期備份。實(shí)驗(yàn)室所有質(zhì)量管理記錄均應(yīng)按相關(guān)規(guī)定保存注：質(zhì)量管理記錄，應(yīng)包括但不限于標(biāo)本接收、標(biāo)本儲(chǔ)存、標(biāo)本處理、儀器和試劑及耗材使用情況、校準(zhǔn)、室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)、檢驗(yàn)結(jié)果、報(bào)告發(fā)放等內(nèi)容

無儀器打印結(jié)果的檢驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)有原始記錄，記錄信息至少應(yīng)包括檢測(cè)日期、方法、試劑品牌、批號(hào)、有效期、檢驗(yàn)結(jié)果、檢驗(yàn)者注：凝膠圖像和斑點(diǎn)雜交原始記錄可通過掃描、拍照等方式保留二、人員要求

實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員?

實(shí)驗(yàn)室至少應(yīng)有2名有臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)上崗證的本單位技術(shù)人員?

開展遺傳性疾病或基于組織、細(xì)胞等分子病理并出具診斷報(bào)告的實(shí)驗(yàn)室，至少應(yīng)有1名具備出具相關(guān)診斷報(bào)告資質(zhì)的本單位醫(yī)師?

新進(jìn)人員應(yīng)完成崗前培訓(xùn)和能力評(píng)估培訓(xùn)與效果評(píng)估

分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有相應(yīng)的學(xué)習(xí)培訓(xùn)制度、計(jì)劃和記錄

定期（每12個(gè)月至少一次）對(duì)學(xué)習(xí)培訓(xùn)效果進(jìn)行評(píng)估注1：工作人員的培訓(xùn)應(yīng)包括與其提供服務(wù)相關(guān)的、本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證和質(zhì)量管理方面的專門培訓(xùn)注2：

a)計(jì)劃制定應(yīng)有針對(duì)性b)員工培訓(xùn)和能力評(píng)審以新進(jìn)人員或轉(zhuǎn)崗人員為重點(diǎn)c)培訓(xùn)形式可以多樣：外出培訓(xùn)、科、組內(nèi)部培訓(xùn)、自學(xué)、交流等d)培訓(xùn)效果評(píng)估形式：考試、操作、通過培訓(xùn)解決問題、通過培訓(xùn)對(duì)自身能力和工作能力的提高e)培訓(xùn)記錄：可包括培訓(xùn)通知、培訓(xùn)課件、培訓(xùn)照片、簽到表、效果評(píng)價(jià)證據(jù)能力評(píng)估方式

直接觀察常規(guī)工作過程和程序，包括所有使用的安全操作

直接觀察設(shè)備維護(hù)和功能檢查

監(jiān)控檢驗(yàn)結(jié)果的記錄和報(bào)告過程、核查工作記錄（實(shí)驗(yàn)室原始記錄、質(zhì)控記錄、定標(biāo)記錄、試劑、使用記錄、儀器保養(yǎng)維護(hù)記錄、儀器維修記錄等）

評(píng)估解決問題的技能

使用特殊材料執(zhí)行一個(gè)給定程序（盲樣檢測(cè)、留樣再測(cè)）人員管理

應(yīng)建立分子診斷技術(shù)人員相關(guān)的教育背景、專業(yè)資格、培訓(xùn)、經(jīng)歷及能力記錄檔案，內(nèi)容包括：a)證書或執(zhí)照復(fù)印件b)教育或以前的工作資料c)職務(wù)說明d)繼續(xù)教育記錄e)能力評(píng)估等三、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、設(shè)施與環(huán)境

普通PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)置原則上分為四個(gè)區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)?

如使用全自動(dòng)擴(kuò)增分析儀，后兩區(qū)可合并?

如使用核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析一體化的全自動(dòng)分析系統(tǒng)，后三區(qū)可合并?

具體實(shí)驗(yàn)室分區(qū)應(yīng)根據(jù)其所使用的技術(shù)平臺(tái)及檢驗(yàn)項(xiàng)目和工作量而定

新一代測(cè)序技術(shù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置原則：工作有序、互不干擾、防止污染、報(bào)告及時(shí)普通PCR實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)物分析區(qū)緩沖區(qū)擴(kuò)增區(qū)緩沖區(qū)標(biāo)本制備區(qū)

試劑準(zhǔn)備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)工作流向注意事項(xiàng)：各區(qū)有獨(dú)立的緩沖區(qū)各區(qū)都有水池各區(qū)有獨(dú)立的通風(fēng)系統(tǒng)（建議有窗戶的房間為PCR實(shí)驗(yàn)室）標(biāo)本制備區(qū)有沖眼器和生物安全柜產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（全基因組低拷貝測(cè)序技術(shù)）測(cè)序區(qū)文庫擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)標(biāo)本與文庫制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)工作流向

標(biāo)本與文庫制備區(qū)：血漿分離、DNA提取、末段修復(fù)與純化、家“A”與純化、接頭連接與純化

文庫擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)：PCR擴(kuò)增與純化、文庫濃度檢測(cè)、pooling

、pooling后文庫定量

測(cè)序區(qū)：測(cè)序前準(zhǔn)備（乳液PCR及磁珠富集）、測(cè)序上機(jī)、信息分析、報(bào)告審核及發(fā)放植入前胚胎遺傳學(xué)診斷（全基因組低拷貝測(cè)序）電泳區(qū)緩沖區(qū)測(cè)序區(qū)文庫檢測(cè)區(qū)緩沖區(qū)擴(kuò)增一區(qū)緩沖區(qū)WGA制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)工作流向WGA制備區(qū)：全基因組擴(kuò)增電泳區(qū)：DNA檢測(cè)及結(jié)果反饋、DNA打斷擴(kuò)增一區(qū)：末端修復(fù)及純化、加“A”與純化、接頭連接與純化、pooling

、缺口平移文庫檢測(cè)：測(cè)序區(qū)：擴(kuò)增前準(zhǔn)備（乳液PCR及磁珠富集）、測(cè)序儀上機(jī)數(shù)據(jù)分析、報(bào)告發(fā)放遺傳病診斷+腫瘤診斷與治療（雜交捕獲測(cè)序技術(shù)+Sanger測(cè)序驗(yàn)證）電泳區(qū)測(cè)序區(qū)

文庫檢測(cè)區(qū)

文庫擴(kuò)增區(qū)

雜交鋪獲區(qū)

DNA打斷區(qū)

標(biāo)本與文

試劑準(zhǔn)備（擴(kuò)增二區(qū)（擴(kuò)增一區(qū)）庫制備區(qū)區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)標(biāo)本與文庫制備區(qū)：DNA提取及檢測(cè)、純化測(cè)OD、末端修復(fù)與純化、加“A”與純化、Adapter連接與純化雜交捕獲區(qū)：Pre-Captured-PCR與純化

、OD值檢測(cè)及pooling、雜交、洗脫與純化文庫擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)：Post-Captured-PCR與純化、Pooling及文庫定量檢測(cè)測(cè)序區(qū)：測(cè)序前準(zhǔn)備（C-Bot制備)、測(cè)序儀上機(jī)數(shù)據(jù)分析、結(jié)果解讀、Sanger驗(yàn)證、報(bào)告發(fā)放Sanger測(cè)序驗(yàn)證標(biāo)本與文庫制備區(qū)：DNA提取與檢測(cè)、目的片段PCR反應(yīng)準(zhǔn)備擴(kuò)增一區(qū)：目的片段擴(kuò)增與純化、測(cè)序PCR前準(zhǔn)備電泳區(qū)：電泳擴(kuò)增二區(qū)：測(cè)序PCR擴(kuò)增與純化測(cè)序儀上機(jī)、結(jié)果分析與解讀、報(bào)告發(fā)放高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)室設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)

電泳區(qū)：DNA提取、DNA純化后大小檢定等步驟需用電泳，單獨(dú)成區(qū)，但不同的檢測(cè)項(xiàng)目可共用

測(cè)序區(qū)：應(yīng)根據(jù)使用儀器要求設(shè)定溫、濕度（一般為恒溫恒濕實(shí)驗(yàn)室，2小時(shí)內(nèi)溫度波動(dòng)不超過2℃）

分區(qū)設(shè)置可根據(jù)自動(dòng)化儀器設(shè)備做適當(dāng)區(qū)間整合

無創(chuàng)產(chǎn)前篩查實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)血漿提取為胎兒微量DNA，為防止污染，不能與其他項(xiàng)目的標(biāo)本制備區(qū)共用

其他：實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)、生物安全柜等要求參照普通PCR實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、設(shè)施與環(huán)境

實(shí)驗(yàn)室有足夠的空間保證：標(biāo)本處置符合分析前、后樣本分區(qū)放置、儀器放置符合維修和操作要求、打印檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)交叉污染的控制

標(biāo)本接收區(qū)建議放在四個(gè)區(qū)域以外的房間

開展基于組織的分子病理項(xiàng)目宜有獨(dú)立的切片制備和前處理（脫蠟、水化）區(qū)域

。脫蠟、水化應(yīng)在通風(fēng)設(shè)施中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、設(shè)施與環(huán)境

各工作區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)記

進(jìn)入和使用實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域應(yīng)有明確的限制和措施，防止患者和其他非相關(guān)人員的隨意進(jìn)出

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所用儀器和檢測(cè)過程對(duì)環(huán)境溫、濕度的要求，規(guī)定實(shí)驗(yàn)室溫、濕度允許范圍，有效實(shí)施監(jiān)控，并有記錄

不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染實(shí)驗(yàn)室工作要求

進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)按照單一方向進(jìn)行

不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用

不同的工作區(qū)域宜使用不同的工作服，工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)不得將工作服帶出

工作結(jié)束后，必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行消毒?？墒褂每梢苿?dòng)紫外燈在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60～90cm內(nèi)照射

實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行

有消毒和清潔相關(guān)的記錄實(shí)驗(yàn)室工作要求

實(shí)驗(yàn)室所有操作應(yīng)符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》

標(biāo)本處理需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋

所有經(jīng)過檢測(cè)的反應(yīng)管不得在擴(kuò)增區(qū)打開

凝膠電泳、雜交、測(cè)序等應(yīng)在產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行，應(yīng)注意此區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的污染

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格管理實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，醫(yī)療廢棄物應(yīng)按《醫(yī)療廢棄物管理?xiàng)l例》進(jìn)行管理四、設(shè)備與材料

實(shí)驗(yàn)室必須有合適、充分、質(zhì)量可靠的儀器、設(shè)備、試劑、耗材、輔助品，適用于各類型、各種工作量的需求，以保證檢驗(yàn)質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)室所使用的儀器、商品試劑、耗材、輔助品必須符合國家相關(guān)規(guī)定儀器：必須三證齊全試劑：必須CFDA批準(zhǔn)（高通量測(cè)序試點(diǎn)單位可在限定范圍內(nèi)開展LDT，藥監(jiān)認(rèn)可？）儀器要求

各類儀器設(shè)備均有專人保管，制定維護(hù)保養(yǎng)計(jì)劃，比對(duì)/校準(zhǔn)程序，編制年度校準(zhǔn)、檢定計(jì)劃，并有執(zhí)行記錄。??維護(hù)保養(yǎng)計(jì)劃應(yīng)有維護(hù)參數(shù)、維護(hù)周期，如何維護(hù)等（含氯消毒液腐蝕作用應(yīng)注意，75%乙醇）校準(zhǔn)計(jì)劃中應(yīng)有校準(zhǔn)儀器、校準(zhǔn)單位、校準(zhǔn)周期、校準(zhǔn)參數(shù)、校準(zhǔn)符合要求的判斷標(biāo)準(zhǔn)

維護(hù)、比對(duì)/校準(zhǔn)的頻度應(yīng)參照國家計(jì)量部門或制造廠商的要求進(jìn)行，廠商沒有規(guī)定的則每年至少進(jìn)行一次。應(yīng)有正規(guī)的校準(zhǔn)報(bào)告儀器校準(zhǔn)

需對(duì)加樣系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)

需校準(zhǔn)/檢定儀器：擴(kuò)增儀、雜交儀、生物安全柜、高速冷凍離心機(jī)、恒溫金屬浴、移液器、溫度計(jì)、溫濕度計(jì)等，開展分子病理項(xiàng)目需定期對(duì)切片機(jī)、撈片水浴槽進(jìn)行校準(zhǔn)

有合格的校準(zhǔn)或檢定報(bào)告（保留校準(zhǔn)原始記錄）關(guān)注：校準(zhǔn)參數(shù)是否齊全、校準(zhǔn)量程是否覆蓋常用檢測(cè)量程、校準(zhǔn)結(jié)果是否符合檢測(cè)要求校準(zhǔn)設(shè)備舉例校準(zhǔn)設(shè)備校準(zhǔn)周期一年校準(zhǔn)單位校準(zhǔn)參數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)溫控系統(tǒng)(溫濕度計(jì)、溫度計(jì)、雜交儀)計(jì)量院/比對(duì)

溫度、濕度（檢測(cè)過程涉及）加樣系統(tǒng)（移液器）1年計(jì)量院/通過認(rèn)

允許誤差、測(cè)量重復(fù)

JJG646-2006性（檢測(cè)過程涉及常用量程）證的廠家光路部分、背景熒光、檢測(cè)系統(tǒng)（擴(kuò)增儀等）1年1年1年廠家/計(jì)量院

溫控部分（溫度準(zhǔn)確度、均一性、溫度升降速率）產(chǎn)品說明書有資質(zhì)的第三

高效過濾器完整性、方機(jī)構(gòu)生物安全柜流入氣流流速、下降

產(chǎn)品說明書氣流流速、氣流模式高速冷凍離心機(jī)廠家/計(jì)量院溫度、轉(zhuǎn)速相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)、比對(duì)

新購設(shè)備在使用前都應(yīng)校準(zhǔn)

內(nèi)部校準(zhǔn)應(yīng)符合CNAS-CL31《內(nèi)部校準(zhǔn)要求》，人員資質(zhì)、環(huán)境要求、測(cè)量不確定度

內(nèi)部比對(duì)記錄信息最少應(yīng)包括：比對(duì)設(shè)備編號(hào)、用于比對(duì)設(shè)備的校準(zhǔn)信息（校準(zhǔn)日期、校準(zhǔn)有效期、校準(zhǔn)單位）、比對(duì)時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備、實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)、比對(duì)設(shè)備實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)、判斷標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)論、比對(duì)人、比對(duì)日期、

科室負(fù)責(zé)人。設(shè)備出現(xiàn)故障時(shí)處理措施

應(yīng)立即停止使用，并加上明顯標(biāo)識(shí)

修復(fù)的設(shè)備如影響儀器性能，必須經(jīng)校準(zhǔn)、檢定（驗(yàn)證）或檢測(cè)滿足要求后方能再次投入使用???可校準(zhǔn)的項(xiàng)目實(shí)施校準(zhǔn)質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果在允許范圍內(nèi)與其他儀器的檢測(cè)結(jié)果比較（5個(gè)樣本，覆蓋測(cè)量范圍，至少4個(gè)樣本測(cè)量結(jié)果偏移<±7.5%

）?使用留樣再測(cè)結(jié)果進(jìn)行判別(5個(gè)樣本，覆蓋測(cè)量范圍，至少4個(gè)樣本測(cè)量結(jié)果偏移<±7.5%

）

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)檢查由于上述缺陷對(duì)以前所進(jìn)行的檢測(cè)工作的影響，并記錄相關(guān)分析、處理意見耗材、試劑要求

檢驗(yàn)試劑和一次性耗材有專人保管，應(yīng)在有效期內(nèi)使用，并按其規(guī)定的保存要求存放

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)關(guān)鍵耗材、不同批號(hào)試劑進(jìn)行驗(yàn)收??外觀檢查：包裝完整性、溫度要求、有效期等性能驗(yàn)證：不同批號(hào)試劑間的差異、重要耗材的抑制物（如使用不含抑制物免檢，但應(yīng)有注明）a)定性檢驗(yàn)試劑：選擇陰性和弱陽性的樣品，結(jié)果符合預(yù)期b)定量檢驗(yàn)試劑：5個(gè)舊批號(hào)試劑檢測(cè)過的樣品，覆蓋測(cè)量區(qū)間（包括陰性、臨界值、低值、中值和高值），至少4個(gè)樣品測(cè)量結(jié)果偏倚<±7.5%，其中陰性和臨界值樣品必須符合預(yù)期）c)耗材的抑制物驗(yàn)收：參照試劑方法和要求五、實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)

建立信息系統(tǒng)管理制度，制訂計(jì)算機(jī)（辦公用除外）和計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)使用權(quán)限、登陸密碼、維護(hù)的規(guī)定，有計(jì)算機(jī)安全保密和病毒防范的要求，并定期備份計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)，保證信息安全和完整。

包括標(biāo)本接收、報(bào)告發(fā)放流程六、分析前質(zhì)量控制

ISO/IEC

15189對(duì)于分析前程序的明確定義：按照時(shí)間順序，從臨床醫(yī)生開出醫(yī)囑開始，到分析檢驗(yàn)程序時(shí)終止的步驟，包括檢驗(yàn)申請(qǐng)、患者的準(zhǔn)備、原始樣品的采集、運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室并在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行傳輸

這個(gè)過程大部分工作都是醫(yī)生、護(hù)士、護(hù)工等在實(shí)驗(yàn)室以外完成的分析前主要環(huán)節(jié)

確保患者樣品的采集方法正確

在采集過程中確保樣品和信息的完整和準(zhǔn)確性

在檢測(cè)前和檢測(cè)后的樣品的運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程符合規(guī)范

患者樣品處理（例如核酸提?。┓弦?guī)范分析前質(zhì)量要求

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有各類患者準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、運(yùn)送、接收（或拒收）、保存和安全處置的具體要求和操作規(guī)程

標(biāo)本應(yīng)正確采集并符合檢測(cè)要求，特別注意分泌物、痰液、腫瘤組織等樣品留取的注意事項(xiàng)

標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)符合相關(guān)時(shí)間、溫度和生物安全的要求，并進(jìn)行有效監(jiān)控

標(biāo)本接收時(shí)有接收時(shí)間和狀態(tài)記錄分析前質(zhì)量要求

標(biāo)本拒收原因要明確，并有記錄

定期分析標(biāo)本拒收原因，有切實(shí)可行的整改措施

基于組織/細(xì)胞形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)的分子檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)由專業(yè)人員進(jìn)行樣品質(zhì)量評(píng)估，確認(rèn)樣品是否滿足檢測(cè)要求

標(biāo)本檢測(cè)全過程包括核酸提取、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析、保存等應(yīng)能溯源，分子病理檢測(cè)項(xiàng)目在檢測(cè)過程中應(yīng)以病理號(hào)作為原始標(biāo)本、取材標(biāo)本（包埋盒）、蠟塊或切片的唯一性標(biāo)識(shí)

標(biāo)本應(yīng)按相關(guān)規(guī)定保存，并進(jìn)行監(jiān)控和記錄影響因素

標(biāo)本采集時(shí)間

標(biāo)本類型和采集量

標(biāo)本運(yùn)輸和保存

標(biāo)本質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)本采集時(shí)間

血清（漿）：無特殊要求

用于產(chǎn)前診斷等標(biāo)本采集時(shí)間應(yīng)遵循相關(guān)技術(shù)指南要求標(biāo)本采集類型及采集量

標(biāo)本類型的選擇應(yīng)考慮到不影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性以及采集樣本的可能風(fēng)險(xiǎn)

標(biāo)本采集量應(yīng)根據(jù)所測(cè)病原體而定，一般來說，如果樣本的量對(duì)病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴(kuò)增檢測(cè)注意：樣本采集量需考慮到實(shí)驗(yàn)室本身的需求以及復(fù)核實(shí)驗(yàn)所需量

基于組織/細(xì)胞的分子病理項(xiàng)目參照相關(guān)診治指南標(biāo)本運(yùn)送

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測(cè)靶核酸的特性，對(duì)各種臨床標(biāo)本的運(yùn)送條件（溫度、時(shí)間）作出相應(yīng)規(guī)定?

靶核酸為DNA的標(biāo)本，可室溫下運(yùn)送，建議采集后8h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室?

靶核酸為RNA的標(biāo)本，10

min可室溫運(yùn)送，如所需時(shí)間較長，則應(yīng)在加冰條件下運(yùn)送，建議采集后4h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室?

冰凍組織樣本最好保證其在運(yùn)送過程中不發(fā)生融化?

石蠟包埋組織可室溫下運(yùn)送標(biāo)本保存

靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標(biāo)本的保存對(duì)于核酸擴(kuò)增測(cè)定的有效性極為重要?

靶核酸為DNA的標(biāo)本，2-8℃保存72h,靶核酸為RNA的標(biāo)本應(yīng)-20℃保存。長期保存均應(yīng)凍存-70℃?

純化后的DNA，可在TE緩沖液中2-8℃保存1年

,-20℃可長期保存純化后的RNA應(yīng)于TE緩沖液中-70℃保存?

石蠟包埋組織可在2-8℃長期保存標(biāo)本接收、驗(yàn)收、拒收

接收的標(biāo)本應(yīng)收集在原始容器中，不能接受從其他檢測(cè)如生化、免疫檢驗(yàn)等分出來的標(biāo)本，因其有較大的發(fā)生標(biāo)本間污染的可能性

組織標(biāo)本應(yīng)由有經(jīng)驗(yàn)的工作人員進(jìn)行病理標(biāo)本評(píng)估，腫瘤細(xì)胞所占比例應(yīng)達(dá)到所用檢測(cè)方法的要求

標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)：容器破損、量不夠、時(shí)間不符合要求、重度溶血、重度脂血、評(píng)估質(zhì)量不合格標(biāo)本七、分析過程質(zhì)量控制

檢驗(yàn)項(xiàng)目開展

檢驗(yàn)方法的確認(rèn)與驗(yàn)證

制定和執(zhí)行檢驗(yàn)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

建立質(zhì)量控制程序

檢驗(yàn)結(jié)果的可比性檢驗(yàn)項(xiàng)目開展

臨床需求

臨床價(jià)值

檢驗(yàn)周期（TAT）檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證

應(yīng)制定方法學(xué)驗(yàn)證操作規(guī)程，對(duì)新開項(xiàng)目或?qū)υ许?xiàng)目的儀器、試劑、方法更新時(shí)應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并滿足驗(yàn)證試驗(yàn)的要求并有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)記錄?

定性檢測(cè)項(xiàng)目分析性能驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括：精密度和符合率?

定量檢測(cè)項(xiàng)目分析性能驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括：精密度、正確度、線性范圍、檢出限方法學(xué)驗(yàn)證注意事項(xiàng)

熟悉驗(yàn)證系統(tǒng)

質(zhì)控在控，數(shù)據(jù)才可用

實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：標(biāo)本選擇（標(biāo)本數(shù)量、濃度、不同基因型）試驗(yàn)周期、比對(duì)方法的選擇、結(jié)果統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)獨(dú)立完成性能驗(yàn)證試驗(yàn)，充分了解驗(yàn)證系統(tǒng)的檢測(cè)性能驗(yàn)證的最低要求定量檢測(cè)

至少應(yīng)驗(yàn)證精密度、正確度、測(cè)量區(qū)間（線性）、檢出限；⒈

精密度驗(yàn)證

選取2個(gè)濃度，其中一個(gè)應(yīng)盡可能選擇臨床決定水平的濃度?？擅刻鞙y(cè)定3次，連續(xù)5天。結(jié)果應(yīng)符合廠商聲稱的指標(biāo)。⒉

正確度

可采用下列方式之一a、與參考方法比對(duì)b、測(cè)定參考物質(zhì)c、與公認(rèn)或主流方法比對(duì)⒊

測(cè)量區(qū)間

至少采用廠商聲明測(cè)量區(qū)間內(nèi)的5個(gè)濃度進(jìn)行檢測(cè)。⒋

參考范圍

至少檢測(cè)20例表觀正常人。檢出限定性檢測(cè)

至少應(yīng)驗(yàn)證重復(fù)性和符合率⒈

重復(fù)性

采用弱陽性和陰性樣本各一份（陽性樣本獲取有困難時(shí)可使用質(zhì)控品），每天檢測(cè)3次，連續(xù)測(cè)量5天，符合率>90%。⒉

符合率

可采用下列方法之一a、標(biāo)準(zhǔn)血清盤b、臨床診斷明確的陰性和陽性樣本各10份c、與公認(rèn)或主流方法比對(duì)操作規(guī)程

臨床實(shí)驗(yàn)室開展的每個(gè)項(xiàng)目均應(yīng)有操作規(guī)程且現(xiàn)行有效，標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程至少應(yīng)包含下列內(nèi)容：（1）項(xiàng)目名稱、檢驗(yàn)方法名稱；（2）方法學(xué)原理；（3）試劑品牌、代號(hào)、包裝規(guī)格、內(nèi)含物；（4）儀器品牌、型號(hào)；（5）具體操作步驟（包括主要的儀器測(cè)定參數(shù)）；（6）質(zhì)控品使用方法、使用水平和頻率、質(zhì)控規(guī)則；（7）操作性能概要，如精密度、正確度、線性范圍、可報(bào)告范圍、靈敏度、特異性、方法的局限性（如干擾物質(zhì)等）、操作注意事項(xiàng)；（8）參考值或參考范圍；（9）臨床意義；（10）病人準(zhǔn)備、標(biāo)本要求；（11）參考文獻(xiàn)；（12）編寫者和日期；（13）科主任對(duì)每個(gè)項(xiàng)目操作規(guī)程的簽字認(rèn)可，確定生效日期。

編寫各類儀器設(shè)備的操作規(guī)程，操作規(guī)程中應(yīng)有儀器使用、維護(hù)保養(yǎng)、校準(zhǔn)等內(nèi)容；儀器設(shè)備和檢驗(yàn)項(xiàng)目的簡(jiǎn)易操作卡應(yīng)與正式操作規(guī)程保持一致。質(zhì)控要求

編寫室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)的操作規(guī)程，以監(jiān)控和評(píng)價(jià)分析過程的質(zhì)量

凡出具臨床檢測(cè)報(bào)告的項(xiàng)目均應(yīng)開展室內(nèi)質(zhì)控

凡出具臨床檢測(cè)報(bào)告的項(xiàng)目均應(yīng)參加室間質(zhì)評(píng)室內(nèi)質(zhì)控

目的

監(jiān)測(cè)和控制實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作的精密度，即實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的批內(nèi)和批間重復(fù)性

IQC結(jié)果決定了實(shí)驗(yàn)室即時(shí)測(cè)定結(jié)果的可靠性和有效性質(zhì)控品來源及使用

來源:第三方、試劑盒自帶、自制

品種：臨床標(biāo)本、人工合成

使用:?

凍干質(zhì)控品復(fù)溶時(shí)，要確保所用溶劑的質(zhì)量、所加溶劑的量要準(zhǔn)確、應(yīng)輕輕搖勻，切忌劇烈振搖?

避免反復(fù)凍融

室內(nèi)質(zhì)控最好監(jiān)控核酸提取、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析等標(biāo)本檢測(cè)全過程

基于組織的分子病理陰性質(zhì)控宜能監(jiān)測(cè)包括切片在內(nèi)的全過程質(zhì)控品設(shè)置、數(shù)量

定性檢測(cè)：每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置1份陰性、1份弱陽性和/或陽性質(zhì)控品。如為基因突變、基因多態(tài)性或基因型檢測(cè)，則應(yīng)包括最能反映檢測(cè)情況的突變或基因型樣品，每批檢測(cè)的質(zhì)控品至少應(yīng)有一種基因突變或基因型，并建議在一定周期內(nèi)涵蓋所有的基因型

定量檢測(cè)：每次實(shí)驗(yàn)室應(yīng)應(yīng)使用相應(yīng)濃度的質(zhì)控品和1份陰性質(zhì)控品

弱陽性/陽性質(zhì)控品作用：監(jiān)測(cè)核酸提取和擴(kuò)增的有效性

陰性質(zhì)控品作用：監(jiān)控核酸提取過程中是否發(fā)生污染、試劑是否存在污染質(zhì)控品位置

室內(nèi)質(zhì)控品在擴(kuò)增儀中的排列順序：不宜固定位置,盡可能監(jiān)測(cè)每一個(gè)孔擴(kuò)增有效性

板上雜交和膜上斑點(diǎn)印跡雜交的質(zhì)控：陽性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標(biāo)本平行進(jìn)行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對(duì)結(jié)果的錯(cuò)誤解釋質(zhì)控品均值建立

暫定均值的建立：20d內(nèi)得到20個(gè)數(shù)值，或至少在5d內(nèi)，每天不少于4次重復(fù)檢測(cè)獲得20個(gè)數(shù)值。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行離群值檢驗(yàn)（剔除超過3s外的數(shù)據(jù)），計(jì)算出均值，作為暫定均值

常規(guī)均值的建立：以最初20個(gè)數(shù)據(jù)和三至五個(gè)月在控?cái)?shù)據(jù)匯集的所有數(shù)據(jù)計(jì)算的累積平均數(shù)作為質(zhì)控品有效期內(nèi)的常規(guī)均值，并以此作為以后室內(nèi)質(zhì)控圖的均值

若使用定值質(zhì)控品，均值必須在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用本室現(xiàn)行的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行確定，質(zhì)控品說明書上的原有標(biāo)定值只能作參考常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)、定義及作用符

號(hào)定義作用12S一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出±2s控制限一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出±3s控制限警告13S22SR4S隨機(jī)誤差系統(tǒng)誤差隨機(jī)誤差兩個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+2s或－2s控制限x同一批測(cè)定中，兩個(gè)不同濃度質(zhì)控物的測(cè)定值之間的差值超出4s控制限41S四個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+1s或－1s控制限系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差7T7個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)呈現(xiàn)一個(gè)向上或向下的趨勢(shì)變化10X十個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值的同一側(cè)失控處理

及時(shí)查找原因，采取糾正措施

填寫失控原因分析報(bào)告失控原因分析

陽性質(zhì)控樣本常見的失控原因?

核酸提取中隨機(jī)誤差：如提取過程核酸丟失、有機(jī)溶劑去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物殘留等?

儀器問題：如擴(kuò)增儀孔間溫度不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度不一致性等?

試劑問題：如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶失活、探針純度標(biāo)記效率、核酸提取試劑效率等失控原因分析

陰性質(zhì)控樣本常見的失控原因?

標(biāo)本核酸提取過程中發(fā)生的標(biāo)本間的交叉污染：實(shí)驗(yàn)室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染、標(biāo)本間的交叉污染、強(qiáng)陽性標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器導(dǎo)致污染、強(qiáng)陽性標(biāo)本經(jīng)操作者手導(dǎo)致污染、

翻蓋離心管在較高溫度溫育時(shí)蓋子崩開?

擴(kuò)增產(chǎn)物污染預(yù)防措施

避免基因擴(kuò)增檢驗(yàn)假陽性結(jié)果的措施?????嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)使用帶“濾芯”的吸頭使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標(biāo)本同時(shí)處理）臨床“假陽性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不宜做PCR檢測(cè)

避免基因擴(kuò)增檢驗(yàn)假陰性結(jié)果的措施?避免由于來自于標(biāo)本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標(biāo)本處理中的去垢劑、有機(jī)溶劑的抑制作用的措施：純化核酸；標(biāo)本重復(fù)雙份測(cè)定；稀釋標(biāo)本?定期對(duì)擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查和校準(zhǔn)操作注意事項(xiàng)

在試劑準(zhǔn)備區(qū)配置反應(yīng)混合液，先將dNTP、引物、酶和緩沖液混合后，再分裝

配制反應(yīng)體系時(shí)，應(yīng)注意移液器使用方法，所有液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體混勻要用振蕩器進(jìn)行，不能用移液器吹打，反應(yīng)體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡

分裝的試劑注意冷藏，防止酶試劑失活及有機(jī)大分子降解

優(yōu)先選擇含UNG的試劑盒

試劑經(jīng)充分溶解后混勻，離心后再開蓋，保持試劑均勻性

擴(kuò)增管、樣品處理管及吸頭等實(shí)驗(yàn)用品，均需高壓滅菌

標(biāo)本處理應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)打開風(fēng)機(jī)5-10min，待柜內(nèi)空氣凈化并氣流穩(wěn)定后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作

為防止標(biāo)本間交叉污染，在打開離心管前宜短暫離心操作注意事項(xiàng)

棄上清提取方法，離心時(shí)應(yīng)注意離心管方向，吸棄上清時(shí)不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低

標(biāo)本處理嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，應(yīng)做到處理時(shí)間充分，保證標(biāo)本中的DNA或RNA完全釋放

將提取的核酸加到反應(yīng)體系中后，應(yīng)將純化好的剩余核酸樣本凍存，以免在擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)意外需要重新檢測(cè)。在結(jié)果確定后再將這些樣本按生物污染廢棄物進(jìn)行處理

在判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)先對(duì)擴(kuò)增的熒光信號(hào)作出定性判斷，然后再進(jìn)行定量分析，避免一些非特異熒光信號(hào)對(duì)結(jié)果分析的干擾

擴(kuò)增后的擴(kuò)增管不能在擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)打開處理，應(yīng)用一次性手套包好遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的洗滌間消毒處理

工作結(jié)束后，必須立即對(duì)各工作區(qū)進(jìn)行清潔PCR質(zhì)控其它要求

必要時(shí)，被檢基因組核酸（DNA和/或RNA）濃度應(yīng)符合制造商規(guī)定的要求

實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性判斷標(biāo)準(zhǔn)?

標(biāo)準(zhǔn)曲線平滑均勻，斜率、截距和/或相關(guān)系數(shù)、內(nèi)標(biāo)等參數(shù)的數(shù)值允許變化范圍均應(yīng)在試劑制造商推薦的范圍