衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)資料 第10章 基因克隆技術(shù)-11級(jí)

第十章基因克隆技術(shù)

基因克隆技術(shù)：

利用酶將不同來源的DNA分子在體外進(jìn)行特異性切割、重組連接、組成新的DNA重組子(recombinant),導(dǎo)入宿主細(xì)胞(hostcell),隨著宿主細(xì)胞的繁殖,DNA重組子被擴(kuò)增,從而得到大量子代DNA重組子或其表達(dá)產(chǎn)物的技術(shù)。

目的基因載體重組體酶切連接轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞基因克隆蛋白表達(dá)酶切基因克隆技術(shù)示意圖第一節(jié)基本原理一、DNA的特異性切割二、基因克隆的載體三、DNA片段的連接四、基因克隆的宿主一、DNA的特異性切割限制性內(nèi)切酶是一種核酸水解酶,能識(shí)別特殊的核酸序列,在核酸鏈的內(nèi)部水解切割磷酸二酯鍵。

（一）限制性內(nèi)切酶的分類（二）Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別特點(diǎn)與切割第一節(jié)基本原理（一）限制性內(nèi)切酶的分類

根據(jù)識(shí)別序列和切割位置的一致性差異,分成Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

Ⅰ型和Ⅲ型酶：切割位點(diǎn)不固定,不產(chǎn)生特定的核苷酸片段,在基因克隆中

很少用

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶：有特定的識(shí)別和切割位點(diǎn),識(shí)別序列大約是4bp～12bp

左右,大多數(shù)是6個(gè)bp

廣泛應(yīng)用于基因克隆中第一節(jié)基本原理（二）Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別特點(diǎn)與切割(1)大多數(shù)酶的識(shí)別堿基為4～6個(gè)堿基對(duì),一般都富含GC,識(shí)別位點(diǎn)是嚴(yán)格特異的,只有少數(shù)的酶的識(shí)別位點(diǎn)可變。(2)大多數(shù)識(shí)別位點(diǎn)具有180℃旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性(或稱為雙重對(duì)稱、回文結(jié)構(gòu));(3)識(shí)別順序中的堿基被甲基化修飾后會(huì)影響部分酶的切割作用。1.識(shí)別特點(diǎn)EcoRⅠ識(shí)別位點(diǎn)5’-G/AATTC-3’3’-CTTAA/G-5’第一節(jié)基本原理2.切割位點(diǎn)的表示：限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)通常用“/”符號(hào)表示,如EcoRI的識(shí)別和切割位點(diǎn)如下:5’-G/AATTC-3’5’-GAATTC-3’

3’-CTTAA/G-5’3’-CTTAAG-5’

為了簡(jiǎn)化,人們常常只寫出從5’端到3’端的一條DNA鏈,如將EcoRI的識(shí)別和切割序列表示為5’-G/AATTC-3’。EcoRI第一節(jié)基本原理3.切割形成的末端：（1）粘性末端：DNA雙鏈經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后,形成5’端或3’端突出的堿基末端,稱為粘性末端。粘性末端可與互補(bǔ)的粘性末端形成氫鍵連接或者環(huán)化。（2）平末端：有些限制性內(nèi)切酶切割后,產(chǎn)生平頭，稱為平末端,如SmaI(CCC/GGG)。平末端的DNA雙鏈連接環(huán)化的效率比粘性末端的低。第一節(jié)基本原理BamHⅠCCCGGGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGSamⅠCCCGGGGGGCCCGGGCCC+平末端粘性末端第一節(jié)基本原理二、基因克隆的載體載體的定義：

是攜帶目的DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的一種工具,是能夠在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并具有獨(dú)立復(fù)制能力的DNA。第一節(jié)基本原理載體的分類：根據(jù)其用途不同可分為克隆載體表達(dá)載體轉(zhuǎn)移載體探針載體質(zhì)粒噬菌體柯斯質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)錄病毒酵母人工染色體載體第一節(jié)基本原理(一)質(zhì)粒(plasmid)載體質(zhì)粒的分類：根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制時(shí)DNA聚合酶的不同分為兩類：

1.嚴(yán)緊型：由DNA多聚酶Ⅲ復(fù)制,復(fù)制拷貝數(shù)低,一個(gè)細(xì)胞可復(fù)制1～5個(gè)質(zhì)粒。

2.松弛型：由DNA多聚酶Ⅰ復(fù)制,拷貝數(shù)高,一個(gè)細(xì)胞至少可復(fù)制30～50個(gè)質(zhì)粒。質(zhì)粒的概念：質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體之外的、可自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA;其幾乎完全裸露,很少有蛋白質(zhì)結(jié)合,易于分離純化。第一節(jié)基本原理質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成的----如pBR322，pUC18。第一節(jié)基本原理pBR322載體的特點(diǎn)：⑴屬松弛型質(zhì)粒,有復(fù)制起始位點(diǎn)ori，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)可存在100～200個(gè)拷貝,當(dāng)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成和染色體復(fù)制受抑時(shí),可繼續(xù)大量擴(kuò)增至上千個(gè)拷貝。⑵質(zhì)粒分子相對(duì)較小(3kb～10kb),一般只能接受小于20kb的外源性基因插入片段;⑶具有多個(gè)單酶切位點(diǎn),便于外源基因的插入;⑷有選擇性標(biāo)記,便于重組子的篩選：含氨芐青霉素抗性基因(Ampr)和四環(huán)素抗性基因(Tetr)。

第一節(jié)基本原理pUC18質(zhì)粒的特點(diǎn)1.只有氨芐青霉素抗性基因,使其相對(duì)分子量更??；2.將多個(gè)單酶切位點(diǎn)集中在一起,形成了多克隆酶切位點(diǎn),便于定向插入外源基因,并減少載體的自身環(huán)化;3.藍(lán)白斑篩選：引入LacZ基因（編碼半乳糖苷酶的α肽—N端146AA）,由于多克隆酶切位點(diǎn)位于Lac基因的前端,當(dāng)有外源性基因片段插入,如果影響了α肽基因的開放讀碼框架,則無α肽產(chǎn)生。不能形成有活性的β-半乳糖苷酶，菌落呈現(xiàn)白色。α肽LacZΔM15的基因產(chǎn)物β-半乳糖苷酶IPTGX-gal藍(lán)色C端AA--宿主菌中N端146AA—質(zhì)粒中第一節(jié)基本原理λ噬菌體載體

M13噬菌體載體第一節(jié)基本原理(二)噬菌體載體(三)柯斯質(zhì)粒載體(四)病毒載體(五)酵母質(zhì)粒載體和酵母人工染色體載體三、DNA片段的連接DNA片段的連接：在體外利用DNA連接酶(DNAligase)將目的基因和載體共價(jià)連接構(gòu)成重組DNA分子。DNA連接酶：催化兩個(gè)雙鏈DNA片段相鄰的5’端磷酸與3’端羥基之間形成磷酸二酯鍵,它既能催化雙鏈DNA中單鏈切口的封閉,也能催化兩個(gè)雙鏈DNA片段進(jìn)行連接。第一節(jié)基本原理DNA連接酶主要有兩種:（1）T4噬菌體DNA連接酶

:

粘性末端:效率高平末端（2）大腸桿菌DNA連接酶:

粘性末端

不能催化DNA分子的平端連接第一節(jié)基本原理體外DNA片段的連接方法有三種:①粘性末端的連接：

用T4或E.coliDNA連接酶。②平末端的的連接：

用T4DNA連接酶連接。③人工接頭連接：先在DNA片段末端加上人工接頭,使其形成粘性末端,然后再行連接。第一節(jié)基本原理四、基因克隆的宿主基因克隆的宿主：

指能夠讓外源重組子大量擴(kuò)增和表達(dá)的細(xì)胞。常用的宿主：

原核生物宿主：細(xì)菌真核生物宿主：酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和植物細(xì)胞第一節(jié)基本原理理想的基因克隆宿主應(yīng)該具有如下的特點(diǎn):

①能夠高效吸收外源DNA,即能發(fā)展成為感受態(tài)細(xì)胞;②具有使外源DNA進(jìn)行高效復(fù)制的酶系統(tǒng)；③不具有限制修飾系統(tǒng),故不會(huì)使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源DNA發(fā)生降解;④一般為重組缺陷型(RecA-)菌株,使克隆載體DNA與宿主染色體DNA之間不發(fā)生同源重組;⑤便于進(jìn)行基因操作和篩選;⑥具有安全性,應(yīng)該對(duì)人、畜、農(nóng)作物無害或無致病性等。第一節(jié)基本原理(一)原核生物宿主

原核生物宿主常用細(xì)菌,其中大腸桿菌最常用,也有使用枯草桿菌和乳酸菌的。第一節(jié)基本原理（二）真核生物宿主真核生物宿主常用的有:1.酵母菌

2.動(dòng)物細(xì)胞

3.昆蟲細(xì)胞第一節(jié)基本原理第二節(jié)基本步驟基因克隆基本步驟包括：①分離或合成目的基因；②構(gòu)建重組DNA：

將目的基因在體外插入載體形成重組DNA；③將重組DNA導(dǎo)人宿主細(xì)胞；④重組體的篩選、鑒定和分析。一、目的基因的獲得目的基因：即需要克隆的外源基因。目的基因的獲得：化學(xué)合成法：制備小片段DNA片段PCR或RT-PCR限制性內(nèi)切酶切割或機(jī)械切割目的片段（一）全細(xì)胞DNA的制備（二）質(zhì)粒DNA的制備（三）RNA的制備（一）全細(xì)胞DNA的制備細(xì)菌動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞可用商品化的試劑盒(二)質(zhì)粒DNA的制備根據(jù)染色體DNA與質(zhì)粒DNA的兩種差異,可將它們分離：一是分子大小的差異：染色體DNA>質(zhì)粒DNA;二是構(gòu)型的差異：染色體DNA----線狀,

質(zhì)粒DNA----超螺旋環(huán)狀。1.根據(jù)分子大小分離原理：通過仔細(xì)控制溶解細(xì)胞的條件,減少染色體DNA碎片,離心沉淀大分子的染色體DNA,質(zhì)粒DNA仍然留在上清液中,然后再繼續(xù)除去蛋白質(zhì)、RNA,濃縮回收質(zhì)粒DNA。缺點(diǎn)：染色體DNA的斷裂是不可避免的,因此該類方法的提純效果欠佳。2.根據(jù)分子構(gòu)型分離

(1)堿變性法原理：是利用線性DNA在一個(gè)狹窄的pH范圍(12.0～12.5)內(nèi)會(huì)發(fā)生變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA不變性的特點(diǎn)將二者分離的方法。

目前的質(zhì)粒提取試劑盒,多是在此基礎(chǔ)上開發(fā)的。

(2)溴乙錠-氯化絕密度梯度離心法(三)RNA的制備制備RNA的關(guān)鍵：盡量減少RNA酶的污染RNA酶來源：除細(xì)胞內(nèi)外,人體的汗液唾液中、灰塵、各種試驗(yàn)器皿和試劑中。去除RNA酶的污染的方法：常采用二乙基焦碳酸鹽(diethylpyrocarbonate，DEPC）處理：

即用DEPC浸泡用具或用含DEPC的水配制試劑，以去除外源性RNA酶的污染。內(nèi)源性RNA酶

酚、氯仿：不但能使蛋白質(zhì)和核酸解聚,還可使蛋白質(zhì)變性而抑制酶活性;

異硫氰酸胍、鹽酸胍：是強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑,使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失,溶解蛋白質(zhì),核蛋白迅速與核酸分離。

RNA酶抑制蛋白(RNasin)

二、載體的準(zhǔn)備1.純化。2.酶切及去磷酸化：一般需經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割,為了減少載體的自身環(huán)化,連接前有時(shí)需要去磷酸化處理。(一)限制性內(nèi)切酶切割標(biāo)準(zhǔn)的酶切體系：一般是指1μg底物DNA,在推薦的反應(yīng)緩沖液和反應(yīng)溫度下,于50μl反應(yīng)總體積中,用1個(gè)單位的限制性內(nèi)切酶切割1小時(shí)。在實(shí)際工作中,內(nèi)切酶可稍微過量,使用2～5U,在推薦的溫度下一般酶切2小時(shí)。酶切片段的純化：膠回收方法最常用,既終止了酶切反應(yīng),又純化了酶切片段。有商品試劑盒供選用。星星活性：某些限制性核酸內(nèi)切酶在特定條件下,可以在不是原來的識(shí)別序列處切DNA,即所謂的Star活性。導(dǎo)致DNA的非特異性切割。避免星星活性可采取的措施：（1）避免加入過多的限制性內(nèi)切酶。因?yàn)槊敢罕４嬷幸话慵佑休^高濃度的甘油,反應(yīng)體系中甘油濃度過高,是產(chǎn)生Star活性的最常見原因。（2）控制在pH中性和高鹽濃度下進(jìn)行反應(yīng)也有一定的效果。(二)去磷酸化去磷酸化：限制性內(nèi)切酶切割后的載體DNA,用堿性磷酸酶處理,除去5’端磷酸基團(tuán),形成5’-OH,自身便不能環(huán)化,只與外源性目的基因片段連接（未經(jīng)堿性磷酸酶處理的,經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶切割的）形成重組子。堿性磷酸酶：小腸堿性磷酸酶(CIP）：較為常用。細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)

三、連接連接：

目的基因+載體DNA重組子載體DNA和外源DNA的比例:不同的載體、不同的連接方式,比例有差異。質(zhì)粒分子作為克隆的載體：當(dāng)載體DNA:目的DNA=1時(shí),利于重組子的形成DNA連接酶(一)粘性末端連接將具有同樣的粘性末端酶切的載體和目的基因按一定比例混合于連接緩沖液中,加入DNA連接酶,由于它們可退火形成雙鏈結(jié)合體,其中的單鏈缺口經(jīng)DNA連接酶封閉后,產(chǎn)生較穩(wěn)定的DNA雜種分子。連接酶的最適作用溫度：37℃,但為了使粘性末端的氫鍵結(jié)合更穩(wěn)定,一般采用較低溫度和較長(zhǎng)作用時(shí)間,如16℃12～16h,或7～9℃2～3d。T-A克隆的連接

PCR產(chǎn)物：TaqDNA聚合酶可在PCR產(chǎn)物3’末端加上1個(gè)脫氧腺嘌呤核苷(A),因此PCR產(chǎn)物兩端可帶1個(gè)突出的A。

T載體：序列兩端都有突出的胸腺嘧啶核苷(T)末端，可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的線性載體。

T-A克隆的連接：將T載體和帶有A末端的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng),通過A-T配對(duì)即可連接得到環(huán)狀質(zhì)粒。PCR產(chǎn)物AAT載體TT重組子(二)平末端連接

只能使用T4噬菌體DNA連接酶,而且平末端連接反應(yīng)效率較低,重組后一般不能原位刪除。平末端連接的兩種DNA片段：平末端+平末端----直接連接平末端+粘性末端非互補(bǔ)的兩個(gè)粘性末端S1核酸酶平末端可降解單鏈DNA和RNA四、外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（一）外源DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞

轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)導(dǎo)（二）外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞

1.外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞

2.外源DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞

3.外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞（一）外源DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化(transformation)：

指把帶有目的基因的重組質(zhì)粒DNA引入受體細(xì)胞的過程。常用方法有化學(xué)法電轉(zhuǎn)法化學(xué)法：

（1）感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)

：是指受體菌能夠接受外源DNA的一種生理狀態(tài),該狀態(tài)下的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的效率與宿主細(xì)胞的感受態(tài)有關(guān)。一般是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期,時(shí)間很短暫，數(shù)量很少,用冷CaCl2處理后,細(xì)胞膨脹成球型，提高了膜的通透性。

（2）原理：轉(zhuǎn)化混合物中的DNA,形成抗DNase的羧基-鈣磷酸復(fù)合物,粘附于細(xì)胞表面,經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理(熱休克，30～90s),會(huì)使受體細(xì)菌中誘導(dǎo)產(chǎn)生出一種短暫的感受態(tài),在此期間它們能夠攝取各種不同來源的DNA,如質(zhì)粒DNA等。高壓電穿孔法(electroporation)：

既可將外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞,又能用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌,通過優(yōu)化電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖長(zhǎng)度和DNA濃度,電穿孔法的轉(zhuǎn)化率比化學(xué)法制備的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率高10～20倍。不能用其它方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)菌通常采用電穿孔法。2.轉(zhuǎn)染(transfection)：是將重組噬菌體DNA直接引入受體細(xì)胞的過程。3.轉(zhuǎn)導(dǎo)將重組噬菌體DNA體外包裝到噬菌體頭部成為有感染力的噬菌體顆粒,再以此噬菌體為運(yùn)載體,通過直接感染大腸桿菌,將頭部重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中,這一過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction),也稱為感染。轉(zhuǎn)導(dǎo)的克隆形成效率常常比轉(zhuǎn)染的高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。(二)外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞1.外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞：（1）磷酸鈣和DNA共沉淀物轉(zhuǎn)染法

是在中性條件下,重組載體以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn),通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),再進(jìn)入細(xì)胞核而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染,是最常用的方法之一。（2）脂質(zhì)體法：是人工制作的具有磷脂雙層包膜的脂質(zhì)小囊,被用作生物大分子(如DNA)的運(yùn)載體,由于其與核酸和細(xì)胞膜都具有高親和性,可在體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

陽(yáng)離子脂質(zhì)體(lipoketin和lipofectamine)能富集DNA,在體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞