衛(wèi)生化學(xué) ppt課件 12色譜概論

色譜分析法概論色譜法是一種重要的分離分析方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用能力不同從而達(dá)到分離目的。IntroductionofChromatography色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography1.色譜法的起源2.色譜法的發(fā)展3.色譜法的分類色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法是什么？(What?)色譜法（Chromatography）與蒸餾、重結(jié)晶、溶劑萃取、化學(xué)沉淀及電解沉淀法一樣，也是一種分離技術(shù)，但它是多種分離技術(shù)中效率最高、應(yīng)用最廣的一種方法。隨著色譜檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，色譜已不僅是一種分離技術(shù)，也是一種分析方法。當(dāng)今的色譜法，包括分離和檢測(cè)兩個(gè)部分，因而通常也稱為色譜分析（chromatographicanalysis）。

色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的起源1903年，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（Tswett）把植物的石油醚浸取液倒入裝有碳酸鈣填充料的玻璃管，然后用石油醚淋洗，在柱管上形成不同顏色的色帶，茨維特稱之為“色譜”。通過(guò)萃取各個(gè)色帶中組分，或分段收集從柱中淋洗出的各色帶的洗出液，便可分離得到浸取液中的葉綠素和其它物質(zhì)。色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatographyPhase1Phase2Phase3色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography1234567“Chromatogram”1－白色吸附劑；2－黃色(葉黃素β)；3－墨綠色(葉綠素)；4－淺綠色；5－黃色(葉黃素α′，α″)；6－白色吸附劑；7－橙黃色(葉黃素α)。色譜法的起源色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的起源此法中所用的玻璃管稱為色譜柱（column）；管內(nèi)填充的固體材料稱為固定相（stationaryphase）；淋洗液稱為流動(dòng)相（mobilephase）。這種方法稱為色譜法（chromatography）。后來(lái)，這種方法也用來(lái)分離無(wú)色物質(zhì)，但色譜一詞仍沿用至今。也有人稱之為層析法。色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的發(fā)展1903年茨維特（Tswett）建立的以吸附劑為固定相的吸附柱色譜法。1935年，產(chǎn)生了用離子交換劑作固定相的離子交換柱色譜法。1941年馬?。∕artin）及辛格（Synge）發(fā)明了以液體為固定相的分配柱色譜法。色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的發(fā)展1944年，馬丁等人用濾紙作分配色譜的載體，建立了紙色譜法。色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的發(fā)展1952年，馬丁等人以氣體作流動(dòng)相，建立了氣相色譜法。這一年，馬丁因其在色譜領(lǐng)域所作的杰出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。氣相色譜儀氣相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的發(fā)展1949年Macllean等在氧化鋁中加入淀粉粘合劑制作薄層板使薄層色譜法（TLC）得以實(shí)際應(yīng)用，而在1956年Stahl開發(fā)出薄層色譜板涂布器之后，才使TLC得到廣泛地應(yīng)用。薄層色譜法色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的發(fā)展1959年出現(xiàn)凝膠過(guò)濾色譜法。色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的發(fā)展1968年前后把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜，出現(xiàn)了高效液相色譜（HPLC）。色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的發(fā)展在二十世紀(jì)的八十年代初，又產(chǎn)生超臨界流體色譜法。色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的發(fā)展在二十世紀(jì)末，在親和色譜的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生了生物色譜法。生物色譜法（Biochromatography）是采用各種具有生物活性的材料（例如，酶、載體蛋白、細(xì)胞膜、活細(xì)胞等）作固定相的一種新興色譜技術(shù)。由于這種具有生物活性的固定相能特異性地結(jié)合與人類生命活動(dòng)有關(guān)的各種生物活性物質(zhì)，所以在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中，可以利用生物色譜技術(shù)，分離和制備各種具有生物效應(yīng)的物質(zhì)。色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的發(fā)展

氣相色譜法和高效液相色譜法的出現(xiàn),使色譜法具有高效、高選擇性、快速、靈敏、所需樣品少、適用范圍廣的特點(diǎn)，并向自動(dòng)化、智能化的方向發(fā)展，成為非常有效的分離分析方法。色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography

廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域---食品及農(nóng)業(yè)/質(zhì)檢/

醫(yī)藥/生命科學(xué)/石化……

色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography用超臨界流體作為流動(dòng)相的色譜法稱為超臨界流體色譜法SupercriticalFluidChromatography

SFC流動(dòng)相和固定相的物理狀態(tài)用氣體作為流動(dòng)相的色譜法稱為氣相色譜法GasChromatograph,GC用液體作為流動(dòng)相的色譜法稱為液相色譜法LiquidChromatograph,LC色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography色譜法的分類（一）按流動(dòng)相和固定相的物理狀態(tài)分類氣相色譜:

氣固色譜（GSC）：固定相為固體吸附劑。氣液色譜（GLC）：固定相為液體（涂布在擔(dān)體或毛細(xì)管壁）。液相色譜:

液固色譜（LSC）：固定相為固體吸附劑。

液液色譜（LLC）：固定相為液體（涂布在擔(dān)體）。超臨界流體色譜：固定相為液體（涂布在擔(dān)體或毛細(xì)管壁）。色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography利用不同組分與固定相的高專屬性親和力進(jìn)行分離的技術(shù)親和色譜法（AC）生物色譜法利用大小不同分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法。又稱為凝膠色譜法排阻色譜法SizeExclusionChromatography，SEC利用組分在離子交換劑上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法離子交換色譜法IonExchangeChromatography，IEC利用組分在固定液中溶解度不同而達(dá)到分離的方法分配色譜法PartitionChromatography利用組分在吸附劑上吸附能力強(qiáng)弱不同而進(jìn)行分離的方法吸附色譜法AdsorptionChromatography按分離機(jī)制分類色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography柱色譜法ColumnChromatography

將固定相置于柱管內(nèi)進(jìn)行分離的方法。按照管柱的粗細(xì)和固定相的填充方式又分為：填充柱色譜法（PackedColumn）毛細(xì)管柱色譜法（CapillaryColumn）平面色譜法PlanarChromatography

又稱平床色譜法FlatBedChromatography按平面色譜材料不同可分為：薄層色譜法（ThinLayerChromatography）將固定相涂鋪在玻璃板、鋁箔板或塑料板等上紙色譜法（PaperChromatography）將含水濾紙作固定相的（三）按固定相的形狀分類色譜法緒論色譜法的起源、發(fā)展和分類IntroductionofChromatography1.按流動(dòng)相分氣相色譜（GC）液相色譜（LC）超臨界流體色譜（SFC）3.按固定相在支持體中的形狀分柱色譜平面色譜紙色譜薄層色譜2.按機(jī)理分吸附色譜分配色譜離子交換色譜排阻色譜親和色譜色譜法緒論經(jīng)典液相色譜法IntroductionofChromatography何謂經(jīng)典液相色譜法？傳統(tǒng)的液相色譜法，包括各種柱色譜法、紙色譜法、薄層色譜法等，稱為經(jīng)典液相色譜法。由于經(jīng)典液相色譜法具有樣品容量大、所需設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、成本低，所以適用于樣品的初步分離和提純，也可作初步的定性和定量分析色譜法緒論色譜法的基本步驟IntroductionofChromatography色譜法的基本步驟第一步：根據(jù)試樣分析目的選擇固定相，按操作形式的要求制備成色譜床（裝填成色譜柱，或涂鋪到薄層板上等）。第二步：進(jìn)樣（或點(diǎn)樣）。將處理好的樣品以一定方式加到固定相的一端。第三步是洗脫或展開。將流動(dòng)相以一定速率載運(yùn)樣品連續(xù)通過(guò)固定相，使樣品各組分在兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)中彼此分離。第四步是收集從色譜床上分離的各組分，進(jìn)行檢測(cè)（定性、定量分析）。色譜法緒論色譜法的分離過(guò)程IntroductionofChromatography色譜法的分離過(guò)程

當(dāng)流動(dòng)相攜帶樣品對(duì)固定相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于試樣中各組分性質(zhì)和結(jié)構(gòu)差異，與固定相和流動(dòng)相之間相互作用（如吸附力、溶解力、離子交換力、分子排阻力和親和力等）有微小差別，使得不同組分被流動(dòng)相運(yùn)載移動(dòng)的速率不同，產(chǎn)生差速遷移（differentialmigration），從而使有微小差異的不同組分被分離。

色譜法緒論IntroductionofChromatography色譜法的分離過(guò)程色譜法緒論IntroductionofChromatography色譜分離過(guò)程中的兩個(gè)重要特點(diǎn)：

差速遷移

譜帶展寬差速遷移與防止譜帶展寬是研究色譜分離過(guò)程必須考慮的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。色譜法的分離過(guò)程色譜法緒論IntroductionofChromatography色譜分離過(guò)程中的兩個(gè)重要特點(diǎn)：差速遷移：在色譜分離過(guò)程中，由于試樣中各組分與固定相和流動(dòng)相的作用力不同，使得不同組分被流動(dòng)相運(yùn)載移動(dòng)的速率不同，產(chǎn)生差速遷移，從而使有微小差異的不同組分被分離。

差速遷移是色譜分離的基礎(chǔ)。譜帶展寬：同一組分的分子在色譜分離過(guò)程中會(huì)發(fā)生沿色譜柱縱向的擴(kuò)散分布，使譜帶變寬，稱為譜帶展寬。嚴(yán)重的譜帶展寬會(huì)使相鄰組分色譜峰互相重疊而難以分離。譜帶展寬是影響色譜分離的重要因素。色譜法的分離過(guò)程

吸附柱色譜法的基本原理：吸附劑通常是多孔徑的固體顆粒物質(zhì)，在它的表面存在分散的吸附中心。吸附色譜的實(shí)質(zhì)就是根據(jù)組分在吸附劑上吸附能力的不同來(lái)進(jìn)行分離。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography吸附柱色譜法的基本原理：當(dāng)試樣中組分分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)后，在吸附劑表面將發(fā)生組分分子（X）與吸附在固定相上的流動(dòng)相分子（S）的競(jìng)爭(zhēng)吸附，直到組分分子被吸附到固定相上的速度與其從固定相上解吸下來(lái)的速度相等時(shí)，達(dá)到吸附平衡。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography吸附平衡及吸附平衡常數(shù)Kad可表示如下：

Kad的大小取決于組分分子和吸附劑之間以及組分分子和流動(dòng)相之間作用力的強(qiáng)弱。不同的組分Kad數(shù)值不同，Kad值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難以洗脫；Kad值小表示組分在吸附劑上保留弱，易于洗脫。試樣中各組分由于kad值不同，在柱色譜過(guò)程中得以分離。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography吸附等溫線（adsorptionisotherm）在一定溫度下，組分在吸附劑表面被吸附達(dá)到平衡時(shí)，組分在兩相中濃度相對(duì)關(guān)系的曲線，稱為吸附等溫線。它用于描述組分在吸附劑上的吸附規(guī)律。吸附等溫線的橫坐標(biāo)為流動(dòng)相中組分的濃度，縱坐標(biāo)為被吸附在固定相上的組分的濃度。吸附等溫線通常有直線型，凸線形、凹線形三種。

液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography三類等溫線與相應(yīng)的色譜峰液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography吸附等溫線（adsorptionisotherm）凸形等溫線：吸附色譜容易出現(xiàn)凸形等溫線，形成拖尾峰。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography凸形等溫線形成原因：吸附劑表面常有多種吸附力不同的吸附點(diǎn)位，溶質(zhì)分子總是先占據(jù)吸附力強(qiáng)的點(diǎn)位，然后再占據(jù)吸附力弱的點(diǎn)位。這樣，溶質(zhì)在濃度低時(shí)被吸附劑吸附得較牢固，濃度高時(shí)吸附力相對(duì)減弱。因此，組分高濃度部分的色譜譜帶中心部分移動(dòng)較快，趕上了色譜譜帶的前沿部分，而色譜譜帶的后沿部分由于吸附較牢固而延遲流出，這樣就形成前緣陡峭，后部拖尾的不對(duì)稱色譜峰。組分濃度較高時(shí)，出現(xiàn)凸形等溫線較多。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography吸附等溫線（adsorptionisotherm）凹形等溫線：吸附色譜出現(xiàn)凹形等溫線的情況較少，形成前緣平緩，后緣陡峭的不對(duì)稱色譜峰。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography凹形等溫線形成原因：有時(shí)因組分濃度較高時(shí)，有時(shí)在吸附過(guò)程中與固定相之間發(fā)生相互作用，影響了吸附劑表面的性能，或組分之間的相互作用，使得譜帶中心的組分高濃度區(qū)域吸附較強(qiáng)，從而移動(dòng)較慢，這樣就形成前緣平緩，后緣陡峭的不對(duì)稱色譜峰。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography吸附等溫線（adsorptionisotherm）直線形等溫線：吸附色譜出現(xiàn)直線形等溫線的情況也較少。這是理想的吸附等溫線。得到對(duì)稱的色譜峰形。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography直線形等溫線形成原因：液相柱色譜法吸附柱色譜法1直線形等溫線的直線斜率是一恒定常數(shù)，相當(dāng)于某組分在兩相中的吸附平衡常數(shù)Kad。2由于Kad恒定，所以譜帶中各處的組分分子都以相等速率向前移動(dòng)，因此得到對(duì)稱色譜峰形。Adsorptionchromatography吸附等溫線（adsorptionisotherm）吸附等溫線僅在較低的濃度范圍內(nèi)呈線性。所謂吸附劑的線性容量就是指吸附等溫線保持線性、能得到正常色譜峰形時(shí)，色譜柱對(duì)樣品的最大負(fù)載量（以每克吸附劑能吸附的樣品量表示）。其實(shí)，在凸形等溫線的起始部分，即低濃度時(shí)，也近似為直線。所以，為了得到較好的色譜峰形，應(yīng)選擇較小的進(jìn)樣量。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography

固定相（吸附劑）吸附柱色譜所用固定相為吸附劑。對(duì)吸附劑的基本要求是：①吸附劑為粒度均勻，有一定機(jī)械強(qiáng)度的細(xì)顆粒；②具有較大的表面積，吸附劑表面的活性程度均勻，即吸附點(diǎn)位的吸附能力大小均勻，吸附劑的線性容量大；③不與流動(dòng)相和被測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；也不溶于流動(dòng)相。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography

常用的吸附劑可分為極性和非極性兩大類。極性吸附劑包括各種無(wú)機(jī)氧化物，如硅膠，氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂及分子篩等；非極性吸附劑最常見的是活性炭。其中最常用的吸附劑是氧化鋁和硅膠。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography硅膠（SiO2·xH2O）有微酸性，適用于分離酸性和中性物質(zhì)，是柱色譜和薄層色譜最常用的吸附劑。為多孔性硅氧烷交聯(lián)結(jié)構(gòu)，表面具有活性基團(tuán)硅羥基，可與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而具有吸附性。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography硅膠（SiO2·xH2O）水能與硅膠表面的羥基結(jié)合生成水合硅羥基，使硅膠失去吸附力。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography硅膠（SiO2·xH2O）當(dāng)加熱至100oC左右又能可逆地除去水，這些表面吸附的水稱為“自由水”，加熱去水過(guò)程稱為活化。可見硅膠的活性與含水量有關(guān)。

液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography硅膠的活化：一般為110oC加熱30min。加熱到200oC，表面吸附水全部脫附，只剩下表面硅羥基，活性最高；加熱至700oC，大部分硅羥基不可逆地變成硅氧烷，對(duì)極性分子喪失吸附選擇性，不再適用于吸附色譜。

液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography

氧化鋁：一種分離能力強(qiáng)、活性可以控制，應(yīng)用較廣的強(qiáng)極性吸附劑。供柱色譜使用的氧化鋁有酸性、中性和堿性三種。酸性氧化鋁適用于分離酸性物質(zhì)，例如羧酸和氨基酸。中性氧化鋁適用于烴、生物堿、萜類、甾族、甙類、酯、內(nèi)酯、醛、酮、醌類化合物，尤其是多環(huán)芳烴的分離，凡是酸性、堿性氧化鋁上可以分離的化合物，中性氧化鋁都能分離。堿性氧化鋁適用于胺類或其它堿性化合物的分離。

液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography與硅膠一樣，氧化鋁也能強(qiáng)烈地吸水，水不易被其它化合物置換，因而使其活性降低。通常也采用加熱方法使其活化。氧化鋁以及硅膠的活性與含水量關(guān)系：活性的強(qiáng)弱用活度級(jí)數(shù)表示，其活性越高，活度級(jí)數(shù)值越小，吸附劑的含水量越低。吸附劑選擇的基本原則是：分離弱極性物質(zhì)一般選用強(qiáng)極性吸附劑，分離強(qiáng)極性物物質(zhì)，應(yīng)選用活性弱一些的吸附劑。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography硅膠、氧化鋁的含水量與活性關(guān)系

液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography流動(dòng)相（洗脫劑）在吸附柱色譜中，流動(dòng)相的選擇要比固定相更重要。實(shí)際操作中，常常是選定吸附劑后，通過(guò)改變流動(dòng)相的性質(zhì)和組成來(lái)實(shí)現(xiàn)較好的分離。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography流動(dòng)相（洗脫劑）.對(duì)洗脫劑的基本要求：（1）純度合格。

（2）對(duì)樣品有一定的溶解能力，不與樣品和吸附劑發(fā)生不可逆的化學(xué)反應(yīng)。（3）粘度小,能保持一定的洗脫速率。（4）性質(zhì)穩(wěn)定，有一定揮發(fā)性，對(duì)分離組分回收率沒(méi)有干擾。（5）與檢測(cè)手段相匹配。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography流動(dòng)相（洗脫劑）的選擇：洗脫劑選擇通常根據(jù)“相似相溶”的原理。對(duì)極性大的試樣采用極性較強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣則采用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)εo來(lái)衡量。εo越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography流動(dòng)相（洗脫劑）的選擇：常用流動(dòng)相及其極性從大到小的順序是：水，甲醇，乙醇，丙酮，正丁醇，乙酸乙酯，氯仿，乙醚，甲苯，苯，四氯化碳，環(huán)己烷，石油醚。對(duì)于多組分復(fù)雜混合物的分離難以用一種溶劑實(shí)現(xiàn)，可用兩種或兩種以上的溶劑，按一定比例組成混合溶劑進(jìn)行洗脫。

液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography分離條件的選擇（綜合）：選擇吸附柱色譜的分離條件時(shí)，必須從吸附劑，洗脫劑，被分離的物質(zhì)三方面綜合考慮。通常，當(dāng)采用硅膠或氧化鋁作吸附劑時(shí)：對(duì)較強(qiáng)極性組分分離時(shí)，選用吸附活性較弱的固定相，極性較強(qiáng)流動(dòng)相；而對(duì)較弱極性組分分離時(shí)，選用吸附活性較強(qiáng)固定相，極性較弱流動(dòng)相。即吸附色譜中，被分離物質(zhì)與流動(dòng)相極性一致。液相柱色譜法吸附柱色譜法Adsorptionchromatography分配柱色譜法：固定相為涂布在載體上的一層固定液，載體可以用硅膠、多孔硅藻土等惰性物質(zhì)，固定液可選用不同極性的溶劑；流動(dòng)相是與固定液不相混溶的某種溶劑。由于固定相和流動(dòng)相均為液體，故又稱為液液分配色譜法。液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography分配柱色譜法與吸附色譜法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)適用的樣品類型廣；

(2)重現(xiàn)性好；

(3)穩(wěn)定性高；

(4)譜帶對(duì)稱，不拖尾。液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography分配柱色譜法的分離原理液液分配色譜的分離原理是根據(jù)被分離的各個(gè)組分在兩種互不相溶的液體中溶解度不同，即組分在兩相中達(dá)到分配平衡時(shí)具有不同的分配系數(shù)（K=Cs/Cm）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這種分配平衡可在色譜柱中反復(fù)多次進(jìn)行，各組分因分配系數(shù)K不同而產(chǎn)生差速遷移，從而得到分離。液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography色譜法緒論色譜法的基本參數(shù)IntroductionofChromatography1.分配平衡（distributionequilibrium）在一定溫度、壓力下，組分在一小段分配色譜柱的固定相和流動(dòng)相內(nèi)發(fā)生的溶解-揮發(fā)的過(guò)程稱為分配過(guò)程。當(dāng)分配達(dá)到平衡時(shí)，每種物質(zhì)分子在固定相和流動(dòng)相中濃度比例（即，分配系數(shù)）不同，造成不同物質(zhì)分子隨流動(dòng)相向前移動(dòng)的速度不同（即產(chǎn)生差速遷移）。色譜分離過(guò)程是不同物質(zhì)分子在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相之間，多次分配平衡而得到分離的過(guò)程。色譜法緒論色譜法的基本參數(shù)IntroductionofChromatography1.分配系數(shù)（distributioncoefficient）K

在一定的溫度和壓力下，某個(gè)組分在固定相（S）與流動(dòng)相（m）中達(dá)到分配平衡時(shí)的濃度之比，稱為該組分的分配系數(shù)，即，K=Cs/Cm

。色譜法緒論色譜法的基本參數(shù)IntroductionofChromatography分配系數(shù)（distributioncoefficient）K

K值的大小與組分、固定相及流動(dòng)相的性質(zhì)和溫度有關(guān)，與兩相的體積無(wú)關(guān)。不同組分在兩相之間具有不同的分配系數(shù)K，使得不同組分在柱中產(chǎn)生差速遷移而得到分離。分配系數(shù)K的定義是根據(jù)分配色譜類型規(guī)定的。與其意義相近的常數(shù)，在吸附色譜中為吸附平衡常數(shù)，在離子交換色譜中為選擇系數(shù)，在凝膠色譜中為滲透系數(shù)。色譜法緒論色譜法的基本參數(shù)IntroductionofChromatography分配比（partitionratio）k

又稱為容量因子，在一定的溫度和壓力下，某個(gè)組分在兩相分配達(dá)到平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的摩爾數(shù)或質(zhì)量之比，即

k

=ns/nm

或k=ms/mm=CsVs/CmVm=KVs/Vm

式中ns，nm依次為組分在固定相和流動(dòng)相中的摩爾數(shù)，Vs,Vm依次為固定相和流動(dòng)相的體積，ms,mm依次為組分在固定相和流動(dòng)相中質(zhì)量。色譜法緒論色譜法的基本參數(shù)IntroductionofChromatography分配比（partitionratio）k

k值越大，說(shuō)明組分在固定相中的量越多，它是衡量色譜柱對(duì)被分離組分保留能力的重要參數(shù)。k值的大小由組分與兩相的熱力學(xué)性質(zhì)決定，隨溫度、壓力與兩相體積的變化而變化。

(k=KVs/Vm

)

分配色譜法的固定相分配色譜的固定相就是涂漬在惰性載體表面上的固定液。只有基本不被流動(dòng)相溶解或溶解度很小的固定液才有使用價(jià)值，所以，適用的固定液品種并不是很多。同時(shí)，由于流動(dòng)相極性的微小變化都會(huì)使組分的保留值出現(xiàn)較大的改變，因此，只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問(wèn)題。最常用的強(qiáng)極性固定液為β、β,-氧二丙腈，中等極性的聚乙二醇和非極性的角鯊?fù)榈?。液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography分配色譜法的固定相載體又稱擔(dān)體，僅起負(fù)載固定液作用，是惰性的多孔固體顆粒。要求其有較大的比表面積，且對(duì)樣品無(wú)吸附作用。常用的載體有多孔硅膠、硅藻土、纖維素和有機(jī)支持體如微孔聚乙稀小球等。

液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography流動(dòng)相在液液色譜中，要求流動(dòng)相純度高、粘度小、盡可能不與固定相互溶，即流動(dòng)相與固定相之間極性差別越大越好。此外，為防止固定液的流失，流動(dòng)相須預(yù)先用固定液飽和。液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography流動(dòng)相一般來(lái)說(shuō)，在分配色譜中，固定液對(duì)于被分離組分是一種溶解度較大的溶劑，而選用的流動(dòng)相對(duì)于被分離組分是一種溶解度較小的溶劑。這樣可使組分在兩相中分配比k控制在一定范圍內(nèi)，否則組分會(huì)從柱上很快洗脫下來(lái)而不能獲得良好的分離。液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography正相分配色譜和反相分配色譜液液分配色譜根據(jù)所用流動(dòng)相和固定相的極性，可分為：正相分配色譜(normalphasepartitionchromatography，NPC)反相分配色譜(reversedphasepartitionchromatography,RPC)液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography正相分配色譜：以極性較強(qiáng)的溶劑涂在載體上作為固定相(如-NH2,-CN,-OH)以極性較弱的溶劑(如正己烷)作流動(dòng)相的分配色譜，亦稱常規(guī)分配色譜。適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography反相分配色譜：以極性較弱的溶劑涂在載體上作為固定相(-CnHm)；以極性較強(qiáng)的溶劑（如甲醇，水，乙腈）作流動(dòng)相的分配色譜。適用于非極性及弱極性化合物的分離。其流出順序與正相分配色譜正好相反，即，極性大的先流出，極性小的后流出。可以看出，在分配色譜法中，被分離物質(zhì)與固定相的極性一致。液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography正相分配色譜：常用的固定液有水、不同pH值的水溶液，以及甲醇、乙醇、甲酰胺等極性溶劑。常用的流動(dòng)相有苯、甲苯、環(huán)己烷、乙酸乙酯等。反相分配色譜：常用的固定液有辛烷、氯仿、硅油和石蠟等，常用的流動(dòng)相有水、不同pH值的水溶液，以及甲醇、乙醇、甲酰胺、乙二醇等極性溶劑。液相柱色譜法分配柱色譜法partitionchromatography離子交換色譜法(ionexchangechromatography)

是以離子交換劑為固定相，利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的液相色譜法。主要用于離子型化合物的分離。

離子交換色譜法ionexchangechromatography液相柱色譜法Sober和Peterson于首次將離子交換基團(tuán)結(jié)合到纖維素上，制成了離子交換纖維素，成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離。從此使生物大分子的分離方法取得了迅速的發(fā)展。離子交換基團(tuán)不但可結(jié)合到纖維上，還可結(jié)合到交聯(lián)葡聚糖（S-ephadex）和瓊脂糖凝（Sepharose）上。離子交換色譜法ionexchangechromatography液相柱色譜法離子交換色譜法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊設(shè)備，而且離子交換劑具有再生能力，可以反復(fù)使用。對(duì)于無(wú)機(jī)或生物化學(xué)領(lǐng)域離子性化合物的分離，離子交換色譜是最有效的方法。離子交換色譜法ionexchangechromatography液相柱色譜法離子交換原理在離子交換柱中，待測(cè)物質(zhì)在流動(dòng)相中電離產(chǎn)生的樣品離子X(jué)m和流動(dòng)相離子Ym，與固定相上帶電荷的交換基團(tuán)Rs進(jìn)行離子交換。以單價(jià)離子為例，離子交換反應(yīng)的一般通式可表達(dá)為，

Xm+RsY

Ym+RsX

離子交換色譜法ionexchangechromatography液相柱色譜法由于試樣中各種被測(cè)離子與離子交換劑的相互作用（或稱親和力）有強(qiáng)弱，在流動(dòng)相離子的競(jìng)爭(zhēng)下，作用強(qiáng)的不易洗脫，作用弱的能較快洗脫，在反復(fù)進(jìn)行的離子交換柱色譜過(guò)程中產(chǎn)生差速遷移，因而得到分離。KXY是評(píng)價(jià)分離能力的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。如KXY>1，說(shuō)明X離子交換能力大，難以洗脫；KXY<1，則說(shuō)明X離子交換能力小，容易洗脫。一般來(lái)說(shuō)，X離子電荷越大，水合離子半徑越小，KXY值就越大。離子交換色譜法ionexchangechromatography液相柱色譜法固定相（離子交換劑）通常使用合成的離子交換樹脂（聚苯乙烯）和離子交換纖維素作固定相。按可交換的活性基團(tuán)不同，離子交換劑可分為四種：強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑（交換基團(tuán)為-SO3H）；弱酸性陽(yáng)離子交換劑（交換基團(tuán)為-COOH）；強(qiáng)堿性陰離子交換劑（交換基團(tuán)為-N+R3X-）；弱堿性陰離子交換劑（交換基團(tuán)為-NH2，-NHR或

-NR2）。離子交換色譜法ionexchangechromatography液相柱色譜法離子交換樹脂的指標(biāo)（1）交聯(lián)度（degreeofcrosslinking）

以應(yīng)用最廣泛的聚苯乙烯型合成樹脂為例，它是以聚乙烯為直鏈，二乙烯苯把直鏈交聯(lián)起來(lái)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。二乙烯苯稱為交聯(lián)劑。樹脂中交聯(lián)劑的含量叫交聯(lián)度，以重量百分比表示，范圍從1%到16%。交聯(lián)度大，樹脂網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，網(wǎng)孔小，大離子難進(jìn)入，交換速率慢，選擇好，適用于分子量較小的離子性物質(zhì)分離。交聯(lián)度小，網(wǎng)孔大，交換速率快，選擇差，適用于分子量較大的離子性物質(zhì)分離。離子交換色譜法ionexchangechromatography液相柱色譜法離子交換樹脂的指標(biāo)（2）交換容量（exchangecapacity）指每克干樹脂能參加交換反應(yīng)的活性基團(tuán)數(shù)，單位為mmol/g或mmol/ml，其值反映樹脂交換的能力。（3）粒度

指離子交換樹脂顆粒的大小，用樹脂溶脹態(tài)后，樹脂能通過(guò)的篩孔數(shù)表示。制備純水多用10~50目，色譜分析一般為100~200目。離子交換色譜法ionexchangechromatography液相柱色譜法流動(dòng)相離子交換色譜的流動(dòng)相大多為水緩沖溶液，有時(shí)也可混入甲醇或乙醇等有機(jī)溶劑。通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）就可調(diào)整樣品組分的保留值。1.增加鹽離子濃度，則削弱試樣離子的競(jìng)爭(zhēng)交換能力，使試樣離子保留值降低。2.流動(dòng)相pH值的變化，能導(dǎo)致可解離化合物在溶液中電離度發(fā)生變化。如果電離度增大，則試樣的保留值也增大。3.如在流動(dòng)相中添加有機(jī)溶劑，可使峰的拖尾得到改善，調(diào)節(jié)試樣組分保留值。

離子交換色譜法ionexchangechromatography液相柱色譜法凝膠色譜法(gelchromatography)又稱尺寸排阻色譜法(sizeexclusionchromatography)。它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品各組分的液相色譜法。對(duì)于水溶性試樣采用水溶液為流動(dòng)相，稱為凝膠過(guò)濾色譜法(gelfiltrationchromatography)；對(duì)于非水溶性試樣采用有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，稱為凝膠滲透色譜法(gelpermeationchromatography)。凝膠色譜法gelchromatography液相柱色譜法凝膠色譜法應(yīng)用：用于分離高分子化合物并測(cè)定其分子量；用于除去高分子（如蛋白質(zhì)，核酸，多糖等）溶液中低分子量雜質(zhì)，此操作叫脫鹽；用于不穩(wěn)定生物高分子稀溶液的濃縮；用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸、多糖、激素、抗生素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。

凝膠色譜法gelchromatography液相柱色譜法凝膠色譜法分離原理凝膠色譜是以依據(jù)物質(zhì)組分分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。凝膠色譜的固定相為化學(xué)惰性多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴。當(dāng)樣品組分進(jìn)入色譜柱，體積大的分子不能滲透到孔穴中而被排除，較早地被淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透進(jìn)入較大的孔穴；小分子可完全滲透進(jìn)所有孔穴，最后洗出。此過(guò)程在色譜柱內(nèi)循環(huán)重復(fù)進(jìn)行，使樣品分子按分子大小先后由柱中流出，得到分離。凝膠色譜法gelchromatography液相柱色譜法凝膠色譜法gelchromatography液相柱色譜法固定相凝膠色譜固定相種類很多，按機(jī)械強(qiáng)度不同可分為軟質(zhì)、半硬質(zhì)及硬質(zhì)凝膠三類(通常用凝膠含水量來(lái)判斷）。葡聚糖凝膠是最常用的凝膠，它由葡聚糖經(jīng)稀鹽酸降解后，用環(huán)氧丙烷交聯(lián)制成。凝膠的交聯(lián)度越小，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔隙就越大，吸水量就越大，其機(jī)械強(qiáng)度就越小。凝膠色譜法gelchromatography液相柱色譜法固定相常用的交聯(lián)葡聚糖凝膠，交聯(lián)聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠，屬于軟質(zhì)凝膠，適用于水溶液體系，主要用于分離生物高分子，如酶、蛋白質(zhì)、核酸以及多糖類。半硬質(zhì)交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，常用于有機(jī)溶劑系統(tǒng)，可分離各種高分子聚合物。凝膠色譜法gelchromatography液相柱色譜法流動(dòng)相凝膠色譜的流動(dòng)相必須能溶解樣品，并且與固定相凝膠性質(zhì)相似，能浸潤(rùn)凝膠，防止凝膠吸附作用。當(dāng)采用軟性凝膠時(shí)，流動(dòng)相必須能使凝膠溶脹。溶劑的粘度要低，因?yàn)楦哒扯热軇┩拗品肿訑U(kuò)散作用而影響分離效果。選擇溶劑還必須與采用的檢測(cè)器相匹配。常用的流動(dòng)相有水和四氫呋喃、甲苯、鄰二氯苯、二氯乙烷、氯仿、苯、二甲基酰胺等。凝膠色譜法gelchromatography液相柱色譜法經(jīng)典液相柱色譜法與儀器分析的色譜新技術(shù)比較，選擇性差，分離速度慢，分離重復(fù)性和靈敏度較低。但是，此法柱內(nèi)徑大，樣品容量大，且不需要特殊的儀器設(shè)備，操作方便，因而成本低。它適用于樣品分組分離或初步分離，純樣品制備，亦用于試樣的脫色，脫脂，共存干擾物去除等初步純化。在有機(jī)合成，天然產(chǎn)物，植物化學(xué)，中草藥成份分離等領(lǐng)域，以及環(huán)境、食品、勞動(dòng)等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域仍是必備的分離純化手段。液相柱色譜法特點(diǎn)和應(yīng)用

平面色譜法

(PlanarChromatography)又稱平床色譜法，是將固定相涂鋪在平面載體上，用溶劑把樣品展開而分離的一種液相色譜法。它包括薄層色譜法和紙色譜法。薄層色譜法是20世紀(jì)50年代，在柱色譜和紙色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分離分析技術(shù)。根據(jù)分離原理，它又可分為吸附、分配、離子交換及凝膠色譜等類型，通常所指的薄層色譜法屬吸附色譜。薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法方法原理薄層色譜法是將吸附劑（固定相）均勻地涂鋪在表面光潔的玻璃、塑料或鋁鉑上制成薄層板。把待分析樣品滴加在薄層板一端的起始線上（稱為點(diǎn)樣）。放入密閉容器（稱層析缸或展開槽）中以適當(dāng)?shù)娜軇ㄒ卜Q展開劑）展開。在薄層板上吸附劑的毛細(xì)管作用下，溶劑載帶著試樣緩緩移動(dòng)，各組分在兩相之間不斷地發(fā)生吸附、解吸的重復(fù)過(guò)程。由于不同組分的吸附系數(shù)不同，移動(dòng)速率不同，展開一定時(shí)間后，各組分互相分離，在薄層板的不同位置上形成不同的斑點(diǎn)。薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法方法原理各組分在薄層上的位置用比移值Rf表示

Rf值與物質(zhì)性質(zhì)以及流動(dòng)相和固定相性質(zhì)有關(guān)，還受色譜操作條件的影響。當(dāng)色譜條件一定時(shí)，物質(zhì)的Rf值為定值，Rf值可作為定性的依據(jù)。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法方法原理由于影響Rf值的因素較多，Rf值難以重復(fù)。為消除因色譜操作條件而引起的誤差，建議用相對(duì)比移值Rst，定義為：

Rst為樣品組分移行距離與參考物質(zhì)移行距離之比，它可消除系統(tǒng)誤差，更適宜作定性參考。參考物質(zhì)可以是另外加入的物質(zhì)，也可以是樣品中的另一組分。薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法

吸附劑薄層色譜最常用的吸附劑是硅膠和氧化鋁，粒度較細(xì)，約為200目（10~40μm）左右。當(dāng)這兩種吸附劑不適宜時(shí)才選用其它吸附劑，如聚酰胺、硅藻土、纖維素等。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法展開劑薄層色譜的展開劑可用單一溶劑，也可用混合溶劑。常用溶劑及其選擇原則與液相吸附柱色譜法相同，即從被分離組分極性，吸附劑活性和展開劑的極性三個(gè)因素綜合考慮：當(dāng)分離極性較小的物質(zhì)時(shí)，應(yīng)選用活性級(jí)別較低（活性較強(qiáng)）的吸附劑，極性較小的展開劑。

當(dāng)分離極性較大的物質(zhì)時(shí)，應(yīng)選用活性級(jí)別較高（活性較弱）的吸附劑，極性較大的展開劑。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法展開劑實(shí)際工作中，選擇展開劑常通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索。一般先用單一溶劑進(jìn)行展開，根據(jù)待測(cè)組分在薄層板上的分離效果，進(jìn)一步考慮改變展開劑的極性或用多種混合溶劑按一定比例混合試驗(yàn)，直到能良好分離為止。通常要求組分的Rf值在0.2～0.8之間，各組分的Rf值之差大于0.05，以防斑點(diǎn)重疊。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法展開劑在用多元混合展開劑時(shí)，各種溶劑所起作用不同。占比例大的溶劑在展開過(guò)程中主要起溶解物質(zhì)和基本分離作用。占比例較小的溶劑主要起調(diào)整改善各組分Rf值的作用。一般選用極性比分離物質(zhì)極性低的溶劑為主要溶劑，否則將使Rf值太大或跟隨溶劑到前沿。在分離酸性或堿性組分時(shí)，在展開劑中加入少量酸或堿，可使這些物質(zhì)斑點(diǎn)集中，提高分離度。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法

操作技術(shù)1.薄層板的類型、制備和活化（1）類型

薄層板有不加粘合劑的軟板和加粘合劑的硬板兩種類型。軟板無(wú)商品，須自制。硬板有商品，也可以自制。常用的粘合劑有煅石膏(Gypsum,2CaSO4·H2O)、羧甲基纖維素鈉（CMC—Na），淀粉和聚丙烯酸（為高效薄層板常用粘合劑）。硬板商品有：硅膠G（含煅石膏作粘合劑）、硅膠H（不含粘合劑）、硅膠HF254、硅膠GF254、硅膠HF254+366及高效硅膠薄層板等。F代表含熒光劑，在254nm或366nm紫外光下可觀察到熒光，這類薄層板適用于本身不發(fā)熒光且不易顯色的試樣。氧化鋁也因是否含粘合劑或熒光劑而分為氧化鋁G，氧化鋁GF254及氧化鋁HF254等品種。薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法

操作技術(shù)1.薄層板的類型、制備和活化（2）制備

薄層板制備的好壞直接影響薄層色譜的效果，薄層要求均勻而且厚度（0.25~1mm）一致。薄層色譜通常采用硬板，用濕法制備，即在加粘合劑的吸附劑內(nèi)按一定比例加水或其它溶劑、溶液，調(diào)成糊狀后鋪層。濕法鋪層有傾注法，刮層平鋪法和涂鋪器鋪層法，其中涂鋪器制板簡(jiǎn)單，制成的板均勻光滑。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法

操作技術(shù)1.薄層板的類型、制備和活化（3）活化把涂好的薄層板于室溫下放平，自然涼干后，放入烘箱加熱活化，活化條件根據(jù)需要而定。硅膠板一般在烘箱中逐漸升溫，維持105~110oC活化30min。氧化鋁板在200oC烘4h可得活性II級(jí)的薄層，150~160oC烘4h可得活性III~IV級(jí)的薄層。常用的氧化鋁和硅膠活性為II~III級(jí)。為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性，薄層板吸附劑的活性應(yīng)保持一致，故分析前應(yīng)對(duì)薄層板的活性進(jìn)行測(cè)定。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法

操作技術(shù)

2.點(diǎn)樣

通常將樣品溶于低沸點(diǎn)且極性與展開劑相似的溶劑，配成1%試液，應(yīng)避免用水，以防樣點(diǎn)在展開時(shí)擴(kuò)散。用直徑小于1mm的毛細(xì)管或微量注射器點(diǎn)樣，也可用濾紙移樣。點(diǎn)樣量要適中，一般斑點(diǎn)直徑不超過(guò)2~3mm，現(xiàn)已有商品點(diǎn)樣裝置可供使用。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法

操作技術(shù)

3.展開

樣點(diǎn)上溶劑揮干后，即可進(jìn)行展開。展開的展開缸要求磨口密閉。常用上行展開法，軟板采用近水平方向（薄層板與水平約成5~10o角），硬板用近垂直方向（薄層板與水平成45o~60o角或垂直）展開。對(duì)Rf值小的物質(zhì)可用下行展開法，即在薄層板上方放置一溶劑槽，用濾紙或紗巾把溶劑引到板的上端，借助重力作用使展開劑下移。此法展開較快，但分離效果不好。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法平面色譜法薄層色譜法

PlanarChromatography薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法操作技術(shù)對(duì)組成復(fù)雜的混合物一次展開不能完全分離時(shí)，可采用二次展開，連續(xù)展開或雙向展開。二次展開是在第一次展開后，待溶劑揮干，再用相同或不同極性的溶劑以同樣的方法再展開一次。薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法當(dāng)用混合溶劑展開時(shí)，要防止產(chǎn)生“邊緣效應(yīng)”（edgeeffect）。邊緣效應(yīng)是指同一組分的斑點(diǎn)在薄層中部比在邊緣移動(dòng)慢的現(xiàn)象。由于展開缸中混合溶劑未飽和，極性弱的溶劑在兩邊緣處易揮發(fā)，使展開劑組成與中部不同，邊緣處含更多極性大的溶劑，洗脫能力強(qiáng)，因此Rf值較大。可用在展開缸內(nèi)襯一濾紙以加速溶劑蒸發(fā)飽和，并將薄層板兩側(cè)邊緣吸附劑刮去1~2mm的方法消除邊緣效應(yīng)。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法操作技術(shù)4.顯色

展開后的斑點(diǎn)若沒(méi)有顏色，則須用顯色方法定位。常用方法有：

（1）紫外光照射法

在紫外光（常用汞弧燈）照射下，如樣品能產(chǎn)生熒光，可觀察熒光斑點(diǎn)；若樣品不產(chǎn)生熒光而吸附劑中含熒光物質(zhì)（如硅膠GF254），板上顯熒光，斑點(diǎn)為暗色。薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法操作技術(shù)4.顯色

（2）氣熏顯色法

將幾粒碘置于密閉容器中，待碘蒸氣飽和后，將展開后的干燥薄層板放入，碘與化合物可逆地結(jié)合，斑點(diǎn)顯淡棕色。薄層板取出后，碘即升華逸出。因此顯色后應(yīng)立即標(biāo)記斑點(diǎn)。

（3）噴灑顯色劑法

軟板一般采用濕態(tài)顯色，硬板應(yīng)在溶劑揮干后才噴顯色劑顯色。此法顯色后的物質(zhì)已被破壞，不能再行回收。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法定性定量

1.定性

薄層色譜法的定性依據(jù)是組分的Rf值，根據(jù)樣品與純品的Rf值對(duì)照定性。由于Rf值受很多因素影響，重現(xiàn)性差，文獻(xiàn)查得的Rf值只能作定性參考。實(shí)際工作中，是將樣品與純品于同一薄層板上以完全相同的條件操作，根據(jù)測(cè)得的Rf值確認(rèn)。也可采用相對(duì)比移值Rst確認(rèn)。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法定性定量

2.定量

薄層色譜通常簡(jiǎn)易的定量方法為：

（1）目視比較定量法

在同一薄層板上比較樣品和純品斑點(diǎn)大小及顏色深淺，估計(jì)樣品的大概含量。

（2）洗脫法

用適當(dāng)?shù)姆椒▽唿c(diǎn)位置的吸附劑全部取下，用溶劑將組分洗脫下來(lái)，再用光度法或其它分析方法定量。此法要求斑點(diǎn)無(wú)拖尾，組分洗脫率要高，比較麻煩費(fèi)時(shí)。目前，比較精確的定量方法是應(yīng)用專用的薄層掃描儀或光密度計(jì)，直接在板上測(cè)量斑點(diǎn)的深淺大小。即薄層掃描定量法。

薄層色譜法

PlanarChromatography平面色譜法薄層掃描法（Quantitati