DB63T 1908-2021青稞種子純度SNP分子標(biāo)記鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB21青海省DB63地方標(biāo)準(zhǔn)DB/TXXXX—2021(報批稿)青海省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDBTXXXXXXXX前言本文件按照GB/T1.1─2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定國科學(xué)院西北高原生物研究所提出。海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。單位：中國科學(xué)院西北高原生物研究所、青海省農(nóng)作物種子站。文杰、孔豆豆。海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳監(jiān)督實施。1DBTXXXXXXXX青稞種子純度SNP分子標(biāo)記鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了青稞種子純度SNP分子標(biāo)記鑒定相關(guān)術(shù)語和定義、儀器設(shè)備及試劑、溶液配制、KASP與統(tǒng)計、種子純度計算等技術(shù)要求。于青稞品種(系)和種質(zhì)資源種子純度檢測。范性引用文件，GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣GBT43.4農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗GBT43.5農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度鑒定GBT682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GBT19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法GBT0988多酚類植物基因組DNA提取純化及測試方法定義件。物定時優(yōu)先選用的一套SNP引物。4儀器設(shè)備及試劑本文件所使用的水均為一級水，符合GB/T6682的要求。除非另有說明，在分析中僅使用分析純試溶液配制KASP物信息2DBTXXXXXXXXKASP擇操作程序1樣品準(zhǔn)備1.1扦樣作復(fù)檢，另一份用于備份。.1.2發(fā)芽GBT3.4的規(guī)定進行發(fā)芽，發(fā)芽籽粒(種子)數(shù)需≥50個。.3葉片采取葉一心時，按單株采取真葉進行樣品制備。2樣品制備按照GB/T19495.3的規(guī)定進行DNA的提取。按照GB/T3543.5的規(guī)定，每各待檢品種制備的DNA樣品個單株；單提、單檢。GBT中的DNA純度、濃度測試進行DNA質(zhì)量檢測。SNP：性對照(NTC，即除由等量的超純水替代DNA樣品外，余所加試劑完全一致)。DNA樣品盡量往PCR避免放在PCR板的四個角上，每塊PCR板盡量只檢測一個待檢品種。2)依待檢樣品量按照表1，配制一定體積的KASP基因分型混合液。配制前所有試劑均應(yīng)短暫地渦的體積；引物原液稀釋至10μmol/L。PMastermix5Primer_Allele[FAM]Primer_Allele[HEX]3DBTXXXXXXXXrimerCommon1183)使用微量移液器將步驟2)中的KASP基因分型混合液分別加入到步驟1)已加入DNA樣品的PCR視的膜將PCR板密封，然后離心(轉(zhuǎn)速3000rpm，時間30sec)。KASP光定量PCR儀上進行，程序設(shè)置見表2。112sec℃3secsec)當(dāng)數(shù)據(jù)對應(yīng)的熒光信號較低，分群較散時，可以增加循環(huán)后進行熒光讀取，同時保證NTC沒有行熒光數(shù)據(jù)的讀取。9數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計的記為N2；一致性品種也可參照附錄D進行判定，根據(jù)送檢樣品在該位點的等位變異進行記錄和計數(shù)統(tǒng)P數(shù))，按公式(1)計算：P=100%.................................................................(1)N1—一致性品種種子數(shù)；N2—不一致性品種種子數(shù)。4DBTXXXXXXXXA(資料性)劑A.1主要儀器設(shè)備RggA.2主要試劑A.3主要耗材lPCR的膜、一次性丁腈手套。5DBTXXXXXXXX(資料性)BDNA試劑B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二納鹽(EDTA)(pH8.0)溶液B.1.21mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)(pH8.0)溶液節(jié)pH至8.0，定容至50ml。滅菌溫度和時間同B.1.1。BDNA取液(見B.1.2)和4mLEDTA溶液(pH8.0)(見B.1.1)，混合均勻，用超純水定容至400mL。滅菌溫度和B存。B0%乙醇mL用超純水定容至100mL，混合均勻。B0倍DNA溶解液10mLTris-HCl溶液(pH8.0)(見B.1.2)和2mLEDTA溶液(pH8.0)(見B.1.1)，加入50mL超純水，混合均勻，定容至100ml。滅菌溫度和時間同B.1.1，室溫保存。6DBTXXXXXXXX(資料性)KASPC1。KASP物序列(5′–3′)ⅠTCAAAⅠMTGTTGCTCCTTCTGCTGCCCPrimerAlleleHEX]:GTTGTTGCTCCTTCTGCTGCCATAGTAGTAⅠCGGTCGCAACACCTGGATTCGGTCAPrimerCommonCGCTGGCAGCTCCAGGGCAAⅠATTCTGGTCAGGTTGAGGAGATTCTTPrimer_Common:AAGGTTGCCAAGCTCAAAAAGGAGAAATTⅠAMCGTCAGCACTGACTGTCCCPrimerAlleleHEXCTCGTCAGCACTGACTGTCCTⅠATCTGGCGGACAGTTATGGAAⅠGGTTCAAAATⅡGeFAMGCGACGCAGCACGACCGAPrimerAlleleHEX]:GCGACGCAGCACGACCGGCGCAGCGCTGGAAH_2ⅡGeFAMGACAAGGCCAGCGGTGCAGTlleleHEXACAAGGCCAGCGGTGCAGCerCommonTCGTGCACGCCAAGACCTCCAAⅡeFAMCCTCCGGTGGCCGGCGPrimerAlleleHEX:GCCTCCGGTGGCCGGCACAGGCTCCCTT7DBTXXXXXXXXKASP物序列(5′–3′)H_2ⅡeFAMCCACCTCCTTCTCCAGCCGTPrimerAlleleHEX:CACCTCCTTCTCCAGCCGCCAAGATGGGCTTⅡⅡleFAMGGCGGCACCGACGCCGPrimerAlleleHEX]:CTGGCGGCACCGACGCCAAGCCCCGCCGGCCATⅡCCGTAGCAGCeHEXCGCCACCCAACCGTAGCAGTTGCCCTAGGGTTTCCCCTTAH_3ⅡAAAGGCGGTCTGATCCTCAAAGGACAGCCATGAAGTTTAⅡGCH_3ⅡTTGCGTGCTCCCACTTGCGTGCTACTCCTCCCACACCCGTATⅡCTCGGAⅡFAMGCCTCAGCCTCCGCCTCAPrimerAlleleHEX:GCCTCAGCCTCCGCCTCCimerCommonCGGAGGCTGAGGCGGAGCATⅡGTAH_4ⅡeFAMGCGTTTCGCCAGCGCACAGPrimerAlleleHEXGCGTTTCGCCAGCGCACACH_5ⅡeFAMGCGCACCGGTGCGTGCTTPrimerAlleleHEX:GCGCACCGGTGCGTGCTCPrimerCommonCCGAAGAGCTCGGCGTCGAAⅡ8DBTXXXXXXXXKASP物序列(5′–3′)H_4ⅡPrimerCommonCAGGAAGGCGCACCGACACTTAⅡACACGAATTGGCAGCTTCAACACGGerCommonTGCTGTCCAGTTTTCAGCTCCTGTTⅡCCTCATCGTCATⅡGTTCTTGATGGCGTCGTCCGPrimerCommonGAAGAAGCGGCCCAAGCAGCTAⅡGTTGArimerCommonGAAAGTCTTCGCAAAAAGTCCGACGAA]中為標(biāo)記熒光9DBTXXXXXXXX(資料性)物變異位點SNP堿基類型見表D.1。1H_12H_12H_22H_32H_53H_13H_23H_34H_1TRCTMAKCTGGTTGARCYCAKGTGGTTKARCYCAKGTGGTTKTRCYCAKGTGRTCGARCYCAKCTGGTTKARCTCAKGTGRTTGTRCYCAKSYGGTTGTRCYMAKCCGRTTGTRCYMAKSTGGTTKTRYYCAKCCGGTTGTRCYCAKGTGGTCGARCYMAKGTGGTTKTRCYCAKCCGGYCGTRCTMAGCCGGCCGTRCYCAKCCGRCCGTRCTCAKCCGGTCKTRCTCAKCCGGTCGTACTMAKCTGGTTGTRCYMAKCCGRTTGTRCTCAKCTGGTTGARCYMAKCTGRYTGTACTCAGCTGRCTGTACTCAKCTGGTTGCARGGAGCYGGGKTCAGGRARCYGRRGTCAGGRAGCYGRGTTCAGGGAGCCGGGGTCAGGGARCYGRGTTCARGGARCYGRGKTCAGGGAGYYRGGTTDBTXXXXXXXX4H_24H_35H_16H_16H_26H_36H_56H_67H_17H_27H_3CAGGGAGCCGGRTTCAGGGAGCYGGGKTCAGGGAGCYGRGKTCAGGGAGCYGRGTTCAGGRAGYYGGRGTCARGRAGCYGGGKT