疫苗的細(xì)胞工程制藥

生物制藥工藝課程疫苗的細(xì)胞工程制藥病毒疫苗制藥

病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制藥病毒性細(xì)胞培養(yǎng)疫苗制藥病毒性動(dòng)物組織疫苗制藥一、病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制藥

受精卵應(yīng)來(lái)自SPF雞群，至少源于未用抗生素藥物的非免疫雞群，以免受母源抗體的干擾和殘留抗生素的影響。從受精卵入孵開(kāi)始至培養(yǎng)全過(guò)程都應(yīng)保持無(wú)菌，要求一定的溫度和濕度，且需不斷翻動(dòng)，然后選擇。選擇一定日齡、發(fā)育正常的胚用于接毒培養(yǎng)。

痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和皰疹病毒等一類(lèi)生物制品，目前仍然利用禽胚特別是雞胚制備，如雞新城疫苗、禽流感疫苗、犬瘟熱雞胚弱毒疫苗等。禽胚疫苗生產(chǎn)的原材料來(lái)源方便、質(zhì)量比較容易控制，制造程序簡(jiǎn)單，不需要過(guò)高的設(shè)備條件，生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量可靠。（一）雞胚選擇雞胚選擇種毒與毒種繼代接毒與收獲配苗（二）種毒與毒種繼代

目前適應(yīng)于雞胚的種毒多系弱毒，包括自然弱毒與人工培育的弱毒兩類(lèi)。各種制苗用的種毒多數(shù)由國(guó)家菌毒種保藏部門(mén)或指定單位保存，保存的種毒多為凍干毒。凍干毒種需按規(guī)定要求在雞胚繼代復(fù)壯，通常繼代3代以上，經(jīng)檢定符合標(biāo)準(zhǔn)后方可作力生產(chǎn)疫苗的毒種，毒種檢定內(nèi)容包括無(wú)菌檢驗(yàn)、毒價(jià)測(cè)定和其他項(xiàng)目的檢定等。一、病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制藥（三）接毒與收獲

雞胚接毒涉及接毒途徑和接毒量?jī)煞矫妗８鶕?jù)不同的病毒與不同疫苗生產(chǎn)程序，選擇最佳接種途徑和接種量。接種途徑：絨毛尿囊膜接種11~12日齡胚尿囊腔接種9~11日齡胚羊膜腔接種10~12日齡胚卵黃囊接種5~8日齡胚如雞新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接種10-3稀釋毒種0.1ml，后者接種10-4稀釋毒種0.1ml。鴨瘟雞胚化弱毒疫苗采用絨毛尿囊膜接種50-100倍稀釋毒0.2ml。1.接毒一、病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制藥

雞胚接毒后培養(yǎng)增殖的時(shí)間和溫度、濕度以及收獲的標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)容物依不同的病毒和不同的疫苗而異。如雞新城疫I系疫苗，接毒后于38.5~39C、相對(duì)濕度60%~70%條件培養(yǎng)增殖，收集接毒后24~48h內(nèi)死亡胚，置0~10C冷卻4~24h，收獲胚液，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，供制備濕苗用。也可收獲胚液、胎兒及絨毛尿囊膜混合制成乳劑制備凍干苗。鴨瘟雞胚化弱毒疫苗，則收集接毒后48~120h內(nèi)死亡的雞胚，冷卻后采取絨毛尿囊膜、尿囊液、胎兒制造凍干苗用。2.培養(yǎng)收獲

按規(guī)定收獲的胚液、胎兒和絨毛尿囊膜乳劑經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后即可進(jìn)行配苗。1.濕苗通常于雞胚液內(nèi)，按每毫升加入青霉素和鏈霉素500~1000U，放置0~10C冷暗處處理后分裝。2.凍干苗經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)后合格的胚液或胚液、胎兒、絨毛尿囊膜乳劑，按比例加入保護(hù)劑，充分混合后濾過(guò)，于濾液內(nèi)按每毫升加入青、鏈霉素500~1000U，混合后分裝凍干。

3.滅活苗

收獲雞胚液經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)及毒價(jià)測(cè)定合格后，按規(guī)定比例加入平衡液，按不同病毒的滅活溫度、時(shí)間進(jìn)行滅活，加入相應(yīng)的佐劑，制備成滅活疫苗，放置4-10C保存。（四）配苗一、病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制藥病毒性禽胚疫苗制藥工藝流程受精卵禽胚毒株種毒滅活病毒液鑒定培育檢驗(yàn)檢驗(yàn)配制原料佐劑配苗、乳化滅活疫苗含病毒尿囊液或禽胚組織含病毒懸液配苗活疫苗保護(hù)劑分裝、凍干分裝滅活原料種子擴(kuò)增收獲配制純化病毒懸液接種二、病毒性細(xì)胞培養(yǎng)疫苗制藥

用于制苗用的種毒應(yīng)經(jīng)毒力、最小免疫量、安全性、無(wú)菌檢定合格，通常為凍干品，由國(guó)家指定的苗毒種保藏部門(mén)檢定分發(fā)。領(lǐng)取的種毒應(yīng)按規(guī)定在細(xì)胞繼代培養(yǎng)適應(yīng)后用作毒種，制苗用毒種應(yīng)按規(guī)定控制在一定代數(shù)以?xún)?nèi)，或?yàn)闈穸径痉N，或?yàn)閮龈啥痉N。

細(xì)胞培養(yǎng)疫苗有細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗和細(xì)胞培養(yǎng)活疫苗兩類(lèi)，前者多以強(qiáng)毒毒株培養(yǎng)增殖制造，后者則用弱毒毒株增殖生產(chǎn)，兩者的制造程序既有相同之處，又有區(qū)別。由于病毒不同與疫苗性質(zhì)不同，所采用的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)方法也有所不同。（一）種毒與毒種繼代

制造疫苗用的細(xì)胞大體為原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞兩類(lèi)，根據(jù)病毒種類(lèi)、疫苗性質(zhì)與工藝流程選擇不同的細(xì)胞。選擇的依據(jù)包括：病毒的適應(yīng)性高、毒價(jià)高、細(xì)胞來(lái)源方便、制備簡(jiǎn)單、生命力強(qiáng)。如豬瘟兔化弱毒牛睪丸細(xì)胞疫苗采用犢牛睪丸原代細(xì)胞；脊髓灰質(zhì)炎活疫苗選擇vero細(xì)胞；狂犬病弱毒細(xì)胞適應(yīng)疫苗采取BHK21細(xì)胞增殖病毒等。（二）細(xì)胞制備

二、病毒性細(xì)胞培養(yǎng)疫苗制藥

培養(yǎng)細(xì)胞和增殖病毒用的營(yíng)養(yǎng)液又稱(chēng)培養(yǎng)液，通常分為細(xì)胞培養(yǎng)用的生長(zhǎng)液和病毒增殖用的維持液，兩者不同的之處通常只是生長(zhǎng)液內(nèi)含有5%-10%的血清；維持液血清濃度為2%-5%。不同細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)條件不盡相同。目前常用的細(xì)胞培養(yǎng)方法為靜止培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，至于微載體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)在我國(guó)尚處于試驗(yàn)之中。（三）接毒與收獲

病毒接種培養(yǎng)有同步與異步之分，前者在細(xì)胞分裝同時(shí)或不久接種毒種，進(jìn)行培養(yǎng)，如貓、犬傳染性腸炎疫苗(細(xì)小病毒)；后者在細(xì)胞形成單層后接種毒種，如流行性乙型腦炎細(xì)胞培養(yǎng)疫苗。通常在細(xì)胞形成單層后傾去培養(yǎng)液，按1%-2%量接種毒種，經(jīng)吸附后加入維持液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，待出現(xiàn)70%-85%以上細(xì)胞病變時(shí)即可收獲。病毒培養(yǎng)液收獲時(shí)間和方法依疫苗性質(zhì)而定，可將培養(yǎng)瓶?jī)鋈跀?shù)次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收??；或在病毒增殖培養(yǎng)過(guò)程中可收獲5-7次毒液，細(xì)胞毒液經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)、毒價(jià)測(cè)定合格后供配苗用。二、病毒性細(xì)胞培養(yǎng)疫苗制藥（四）配苗1．滅活疫苗不同滅活劑對(duì)不同病毒的作用也不同。向細(xì)胞毒液內(nèi)按規(guī)定加入滅活劑，在一定的溫度下作用一定的時(shí)間，有的滅活劑還需加入阻斷劑中止滅活。滅活疫苗配置通常都需加入佐劑，充分混合、分裝，制成滅活疫苗。2．凍干苗細(xì)胞毒液內(nèi)按比例加入保護(hù)劑或穩(wěn)定劑，充分混合、分裝，進(jìn)行冷凍真空干燥制成凍于疫苗。二、病毒性細(xì)胞培養(yǎng)疫苗制藥病毒性細(xì)胞疫苗制藥工藝流程動(dòng)物或胚胎組織毒株種毒滅活病毒消化鑒定培育培養(yǎng)檢驗(yàn)檢驗(yàn)配制原料佐劑傳代細(xì)胞配苗（混勻、乳化）滅活疫苗細(xì)胞懸液生長(zhǎng)細(xì)胞配苗活疫苗保護(hù)劑原苗分裝、凍干分裝滅活原料原料細(xì)胞培養(yǎng)液配制剪碎種子鑒定擴(kuò)增收獲配制滅菌三、病毒性動(dòng)物組織疫苗制藥

病毒在易感動(dòng)物體內(nèi)可大量增殖，但在各器官組織、部位中增殖病毒的量卻有很大的差異，利用病毒增殖迅速、含毒量高的組織制造的疫苗稱(chēng)為組織疫苗(tissuevaccine)。動(dòng)物組織疫苗包括動(dòng)物組織滅活疫苗和動(dòng)物組織弱毒活苗兩類(lèi)，前者多數(shù)由強(qiáng)毒株制造，如豬瘟結(jié)晶紫疫苗、狂犬病羊腦組織疫苗；后者均以弱毒株生產(chǎn)，如豬瘟兔化弱毒乳兔組織疫苗、牛瘟兔化弱毒組織疫苗等。

動(dòng)物質(zhì)量直接影響到組織疫苗的質(zhì)量，特別是對(duì)疫苗的安全性和效力有著決定性的作用，動(dòng)物必須符合下列標(biāo)準(zhǔn)：(1)應(yīng)該是清潔級(jí)(二級(jí))以上的等級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，即無(wú)規(guī)定的人獸共患性病原體動(dòng)物；(2)應(yīng)是對(duì)所接種病毒易感性高的動(dòng)物，即在品種、年齡和體重方面合乎要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。（一）動(dòng)物選擇

種毒既可用抗原性?xún)?yōu)良、致死力強(qiáng)的自然毒株臟器組織毒或強(qiáng)毒株增殖培養(yǎng)物，也可用弱毒株組織毒種。無(wú)論何種種毒都須經(jīng)純粹、抗原性和免疫原性檢查合格后使用。接種途徑依病毒性質(zhì)和目的而異，例如豬瘟結(jié)晶紫苗，采取豬肌肉注射血液毒種；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳靜脈注射脾淋毒種；狂犬病疫苗，用兔腦毒種接種綿羊腦內(nèi)途徑感染。幾種動(dòng)物常用的接種途徑如下：1.腦內(nèi)注射：顱前后中線(xiàn)5mm平行線(xiàn)與瞳孔橫線(xiàn)交叉處。2.靜脈注射：家兔由耳靜脈注入；雞自翅下肢靜脈注入。3.肌肉注射：選擇腿部、胸部、臀部等肌肉豐滿(mǎn)處注射。4.皮下注射：家兔和豚鼠可選擇在腹部或后腿內(nèi)注射。5.腹腔注射：家兔與豚鼠可選腹股溝處刺入腹腔。（二）種毒與接種三、病毒性動(dòng)物組織疫苗制藥

動(dòng)物在接種感染后應(yīng)每天觀察和檢查規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo)，指標(biāo)或項(xiàng)目因不同病毒而異。常規(guī)觀察、檢查的項(xiàng)目如食欲、精神和活動(dòng)狀態(tài)、體溫、糞便、尿和血液變化等。根據(jù)觀察的征象和檢查的結(jié)果選出符合要求的發(fā)病動(dòng)物按規(guī)定方式剖殺，采取收集含毒量高的器官組織。如豬瘟結(jié)晶紫疫苗采取發(fā)病豬的血液制備；兔出血癥組織滅活疫苗采集病兔肝臟生產(chǎn)；狂犬病疫苗利用發(fā)病羊的羊腦組織制造。（三）觀察與收獲三、病毒性動(dòng)物組織疫苗制藥

1．組織滅活疫苗

采取收獲的組織經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)及毒價(jià)測(cè)定合格后，按規(guī)定比例加入平衡液和滅活劑（甲醛、酚、結(jié)晶紫等）制成勻漿，然后按不同病毒的滅活溫度、時(shí)間進(jìn)行滅活。如狂犬病疫苗配制按腦組織1:4加入含有甘油及1%酚蒸餾水，于360.5C滅活7天制成；豬瘟結(jié)晶紫疫苗配制，按血毒4份，結(jié)晶紫甘油溶液1份混合，于37C~38C滅活6~8天。2.弱毒組織疫苗

在無(wú)菌操作下剔除臟器上的脂肪與結(jié)締組織等，稱(chēng)重后剪碎，加入適最保護(hù)劑制成勻漿，然后濾過(guò)扣除殘?jiān)浚侔礊V液中的實(shí)際組織量計(jì)算稀釋倍數(shù)，加入余量保護(hù)劑和青鏈霉素500~1000U(g/ml)，充分搖勻后置0~4C冷暗處處理一定時(shí)間后作無(wú)菌檢驗(yàn)與毒價(jià)測(cè)定。合格者進(jìn)行分裝，冷凍真空干燥制成凍干疫苗。

（四）制苗三、病毒性動(dòng)物組織疫苗制藥

病毒性組織疫苗制藥工藝流程動(dòng)物感染動(dòng)物毒株種毒滅活病毒液鑒定培育檢驗(yàn)檢驗(yàn)配制原料佐劑配苗、乳化滅活疫苗含病毒組織含病毒懸液配苗活疫苗保護(hù)劑分裝、凍干分裝滅活原料種子擴(kuò)增收獲配制純化病毒懸液接種毒種：毒種的優(yōu)劣不僅影響疫苗的產(chǎn)量，而且也影響疫苗的質(zhì)量，毒種不純會(huì)產(chǎn)生相互干擾，減毒活疫苗毒種若毒力回升易造成事故，因此毒種的選擇應(yīng)挑選那些致病性低，免疫效價(jià)高而持久，抗原譜廣的，易增殖，便于生產(chǎn)，可在傳代細(xì)胞上傳代的毒種。培養(yǎng)病毒的細(xì)胞：細(xì)胞若有潛在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原體污染均不能用作疫苗生產(chǎn)。對(duì)此因素應(yīng)嚴(yán)格檢查。此外若細(xì)胞本身發(fā)生轉(zhuǎn)化后，不宜于制備活疫苗，只能制備一些滅活疫苗或亞單位疫苗。培養(yǎng)液：培養(yǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)液中多少含有一定量的血清蛋白，在疫苗使用中常會(huì)出現(xiàn)某種程度的過(guò)敏反應(yīng)，為此，應(yīng)盡量使細(xì)胞適應(yīng)于無(wú)血清蛋白的培養(yǎng)基中，以消除過(guò)敏源。甲醛滅活劑的使用：甲醛能使病毒滅