PCR引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)

PCR引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)1.書寫規(guī)則設(shè)計(jì)引物時(shí)，5’端引物與目的序列正義鏈相同，而3’端引物則與目的序列正義鏈互補(bǔ)，書寫時(shí)從引物的5’端至3’端（即5’端引物不變，3’端引物與目的序列互補(bǔ)并相反）；2.引物長(zhǎng)度一般引物長(zhǎng)度為18~30堿基（不包括5’端添加的修飾），引物太長(zhǎng)和太短都不好；3.GC含量口一般引物序列中G+C含量一般為40%?60%,不要有聚嘧啶或聚嘌呤，尤其3’端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴，上下游引物的GC含量不能相差太大；4.退火溫度口可以用軟件PrimePrimer來(lái)計(jì)算退火溫度，在引物短于20bp時(shí)，可以用公式Tm=4（G+C）+2（A+T）-5估計(jì)Tm值（解鏈溫度），有效引物的Tm為55?65℃之間較好，如果待擴(kuò)增基因的GC含量較高（超過(guò)50%），引物的退火溫度可設(shè)計(jì)得高一點(diǎn)，例如接近65℃，因?yàn)樘岣咄嘶饻囟瓤梢越档头翘禺愋詳U(kuò)增。一對(duì)引物的退火溫度應(yīng)盡量接近，相差范圍應(yīng)在5℃之內(nèi)；一般初次PCR使用的退火溫度比計(jì)算出的解鏈溫度低5℃，如果擴(kuò)不出，可試著將退火溫度降低5℃和升高5℃再試一下，但一般不要1℃1℃升，或1℃1℃降，因?yàn)檫@樣效果不大；5.避免與靶DNA的錯(cuò)配口引物要具有特異性，與非特異擴(kuò)增序列的同源性不應(yīng)超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源，可針對(duì)基因組BLAST檢測(cè)，看是否能錯(cuò)配到其它非特異順序上；6.避免引物及模版的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域引物自身避免有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)，若不能避開這一區(qū)域時(shí)，可嘗試7-deaza-2'-脫氧GTP取代dGTP。若有可能，也應(yīng)盡量避免擴(kuò)增含穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的目的片段（可用軟件估計(jì)，一般待擴(kuò)區(qū)域自由能4G小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功）；口7.避免引物二聚體引物之間避免有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)以免形成二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊；8.引物3’端1）3'端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C,以免使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)；2）除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3’端不能發(fā)生錯(cuò)配；3）如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率；4）避免在引物的3?端使用堿基A,以免增加使用Taq酶時(shí)的錯(cuò)配效率；5）如果片斷連入表達(dá)載體或轉(zhuǎn)基因載體，基因后面帶有其它tag,如Hitag,或Fattag,GFP,GUS等，注意設(shè)計(jì)引物時(shí)一定要去掉基因的topcodon,否則tag就沒(méi)有了；但如果這些tag是在基因之前，則注意去掉基因的tartcodon,因?yàn)榇藭r(shí)基因跟在tag之后，用的是載體上tag的tartcodon。注意無(wú)論是前面融合還是后面融合tag,千萬(wàn)要反復(fù)校對(duì)所設(shè)計(jì)的引物,務(wù)必使擴(kuò)出的順序酶切連入終載體后前后順序的讀碼框正確,否則翻譯出來(lái)的蛋白可能完全錯(cuò)誤。9.引物5’端1）引物5’端可進(jìn)行修飾，包括：引入酶切位點(diǎn)、蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列、突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和啟動(dòng)子序列,標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；2）引入5′端修飾可能引起讀碼框移位，可在修飾寡核苷酸和與目的序列互補(bǔ)的寡核苷酸間加入1或2個(gè)堿基確保讀碼框正確；10.其他1）引入酶切位點(diǎn)如果PCR產(chǎn)物要直接酶切后連入終載體，為了能完全酶切，所引入的酶切位點(diǎn)順序的5'端需要加2?3個(gè)保護(hù)堿基，不同的酶需要的保護(hù)堿基數(shù)目不同，可查閱NEB的catalogue或?qū)嶒?yàn)室的Labprotocolfolder；如果PCR產(chǎn)物欲先連入中間載體例如PCR-Blunt或T-vector中然后再連入終載體，則酶切位點(diǎn)的5’端無(wú)需加保護(hù)堿基；2）特殊的粘性末端LIC法、TA克隆、In-Fuion克隆等為特殊載體而發(fā)明的