第四章基因操作中大分子物質(zhì)分離與分析演示文稿

第四章基因操作中大分子物質(zhì)分離與分析演示文稿目前一頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點目錄1、核酸的提取純化、檢測與保存2、核酸的凝膠電泳3、核酸的分子雜交4、外源基因?qū)胧荏w細胞的方法目前二頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點第一節(jié)

核酸的提取純化、檢測與保存目前三頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點DNA的類型（來源）1、染色體DNA2、病毒和噬菌體DNA3、質(zhì)粒DNA4、線粒體和葉綠體DNA目前四頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點第一部分DNA提取總論目前五頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點一、提取DNA總的原則：

1保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；2其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；3核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；4其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。目前六頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點二、樣本來源：理論上所有有核真核細胞、細菌、病毒都可以提取DNA樣本選擇取決于試驗?zāi)康娜腔蚪M提取最常見的樣本目前七頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點三、DNA提取的基本步驟1、核酸的釋放：

破裂細胞釋放核酸機械法與非機械法（非機械法中溶胞法是應(yīng)用最廣泛的方法）目前八頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點各種組織細胞破碎方法細胞破碎方法

應(yīng)用

Ⅰ機械法1勻漿法機體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細菌、酵母

Ⅱ物理法1超聲法細胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細胞3冷熱交替法細菌、病毒4低滲裂解紅細胞

Ⅲ化學(xué)法1有機溶劑細菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細胞3酶解法細菌、酵母目前九頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點破裂細胞、釋放核酸目前十頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點2、核酸的分離與純化：在含有核酸分子的復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離：非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液目前十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌目前十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點4、DNA鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定目前十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點濃度鑒定1）紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。如計算DNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1時，相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，20μg/ml單鏈寡核苷酸）目前十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點各種堿基的紫外吸收光譜目前十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點2）熒光光度法熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）目前十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點EB與DNA的結(jié)合目前十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點500l全血提取的基因組DNA電泳動物組織提取基因組DNA目前十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點純度鑒定紫外分光光度法：在260nm和280nm處測定DAN溶液的光吸收，純的DNA，低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值表明有RNA的殘留量。

A260與A280之比應(yīng)在1.80；純的RNAA260與A280之比應(yīng)在2.0。

A260/A280比值是純度檢測的重要指標(biāo)。目前十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0核酸的濃度與純度目前二十頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點完整性鑒定凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場中泳動慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜拖尾現(xiàn)象；總RNA電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。目前二十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點目前二十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點DNA片段的降解目前二十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點完整或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶熒光強度積分應(yīng)呈特定的比值，沉降系數(shù)大的核酸區(qū)帶，電泳遷移低，熒光強度積分高；反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強度積分低。

目前二十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點一般而言，28S（23S）RNA的熒光強度約為18S（16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解。若在點樣孔附近有著色條帶，則說明存在DNA的污染。目前二十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點

正常時，28SRNA的熒光強度約為18SRNA的2倍，否則提示RNA的降解目前二十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點5、核酸的貯存——DNA保存

1）短期貯存：

4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。

TE緩沖液的PH與DNA貯存有關(guān)，PH為8時，可減少DNA脫氨反應(yīng)，PH低于7.0時DNA容易變性。2）長期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。目前二十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點第二部分基因組DNA的分離與純化目前二十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點一、DNA樣品準(zhǔn)備

常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細胞等生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存－70℃或液氮目前二十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點二、DNA提?。ㄒ唬┓映樘岱ǎ合扔肊DTA、SDS、蛋白酶K破碎細胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進行沉淀。獲DNA大小為100－150kb。目前三十頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點DNA酚抽提法示意圖目前三十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點主要試劑的作用：

EDTA：1二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；

2降低細胞膜的穩(wěn)定性目前三十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點SDS的作用：1溶解膜蛋白和脂肪，從而使細胞膜破裂溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來3對RNA、DNA酶有抑制作用4與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3

….R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性目前三十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細胞中的蛋白質(zhì)蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時仍保持較高活性，可同時使用目前三十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點苯酚的特點：蛋白質(zhì)強變性劑、抑制DNA酶活性苯酚溶于有機溶劑，微溶于水提取DNA前苯酚用Tris-Hcl飽和，防止吸收過多DNA，降低DNA的損失率氧化苯酚會破壞DNA目前三十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要經(jīng)過高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。目前三十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點PH8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA進入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實驗中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。目前三十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點DNA的沉淀1）無水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負電荷，有助于分子之間的聚集。無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過程釋放熱量對DNA的損傷。2）異丙醇沉淀除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子目前三十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點（二）甲酰胺解聚法：破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品?？傻肈NA200kb左右。目前三十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點（三）玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb目前四十頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點DNA玻棒纏繞法示意圖目前四十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點目前四十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點（四）表面活性劑快速制備法：用TritonX-100或NP40表面活性劑破碎細胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。目前四十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點二、DNA的濃縮

1、固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量2、丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積目前四十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點三、DNA回收

主要是從電泳中分離回收DNA片段回收原則：盡量提高回收率去除回收DNA樣品中的污染物目前四十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點（二）從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段（一）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段目前四十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點

DNA的檢測溴乙錠染色：在254nm紫外光下檢測，如需回收最好在300nm紫外光下割膠，否則易使嘌呤斷鏈，在1cm寬帶上可檢到10ngDNA。銀染法：Ag+與DNA形成復(fù)合物，在甲醛還原下可染成黑褐色，靈敏度高200倍，但不能回收。目前四十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點DNA提取試驗中常遇到的問題基因組DNA收率較低或無基因組DNA

樣本材料太少細胞破裂不夠充分，DNA釋放不完全離心力偏小兩相分離不完全……目前四十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點DNA降解的原因樣本不夠新鮮，采集材料過陳舊樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因提取的基因組DNA鹽濃度過高基因組DNA中乙醇未清除凈基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時加入蔗糖的原因加入多糖，保護DNA長度目前四十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點目前五十頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點質(zhì)粒DNA制備

plasmidextraction

目前五十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點質(zhì)粒簡介

質(zhì)粒(plasmid)是細菌內(nèi)獨立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子

其大小范圍從lkb至200kb以上不等。已經(jīng)在形形色色的細菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒.

這些質(zhì)粒都是獨立于細菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。目前五十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點ChromosomeDNAgenomePlasmidDNA質(zhì)粒目前五十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點質(zhì)粒特性

1.分子相對小2.含有高效的自主復(fù)制成分3.不相容性(incompatibility)4.轉(zhuǎn)移性5.選擇的標(biāo)記(selectivemarkers)6.限制性內(nèi)切酶單一切口目前五十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點

細菌收集純化質(zhì)粒DNA細菌培養(yǎng)細菌裂解質(zhì)粒DNA的提取和純化

目前五十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點質(zhì)粒DNA的提取和純化

一、細菌的培養(yǎng)(bacterialculture)1、先分離單個菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。目前五十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點二、細菌的收集(bacterialcollection)

細胞生長過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細菌沉淀最好用生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細去除干凈。

目前五十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點三、細菌裂解細胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。

目前五十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點質(zhì)粒提取的方法堿裂解法(Alkaline)煮沸裂解法SDS裂解法其他目前五十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點質(zhì)粒DNA提取方法的選擇

l

常用的煮沸法，堿法,SDS法均可獲得較滿意效果．至于有人采用堿法提取小量細菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒，用煮沸法或SDS法進行質(zhì)粒DNA的大量分離，只是各個實驗室的習(xí)慣問題。目前六十頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點l選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNA，應(yīng)考慮以下因素：

1．菌株類型（type）

2．質(zhì)粒的大小(size)3．細菌染色體DNA變性條件強弱的控制

(denaturationcondition)質(zhì)粒DNA的小量制備2-5ml質(zhì)粒DNA的大量制備500ml目前六十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點大質(zhì)粒（>15kb）的處理方法：

采用溫和處理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid損傷減少小質(zhì)粒（<15kb）的處理方法：

無需特殊處理，堿裂解方法等均可使用目前六十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點四、細菌的裂解和質(zhì)粒DNA的提取

(bacterialandplasmidextraction)在NaOH存在的強堿性（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細胞壁和裂解細胞，并使細胞的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA（一）堿裂解法(Alkaline)目前六十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點細胞被裂解后，細胞壁、膜的碎片、變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成大的復(fù)合物當(dāng)pH調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA重新恢復(fù)天然的超螺旋在高鹽條件下沉淀，經(jīng)離心分離，質(zhì)粒DNA保留在上清液中目前六十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點堿裂解法示意圖目前六十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點1~4ml培養(yǎng)細菌收集細菌破裂溶解染色體基因組和蛋白質(zhì)變性、質(zhì)粒變性變性的細菌基因組形成網(wǎng)狀、蛋白質(zhì)變性、質(zhì)粒復(fù)性SolutionISolutionIISolutionIII分離、純化質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA提取流程目前六十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點堿裂解法提取質(zhì)粒的試劑及主要成分:

(mainregeantsandcomponents)SolutionI:Tris-HCl;EDTA;glucoseSolutionII:NaOH;SDSSolutionIII:CH3COOH目前六十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點質(zhì)粒DNA電泳圖譜目前六十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點堿裂解提取質(zhì)?？赡艽嬖诘膯栴}少量純化質(zhì)粒是，多少菌液比較合適？

2ml細菌可獲得10~15μg質(zhì)粒加入SolutionII后溶液應(yīng)該澄清，如出現(xiàn)渾濁可能存在的情況？菌體量過大菌液與SolutionI混合不充分在熱或堿的條件下時間過長會導(dǎo)致什么結(jié)果？質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)不可逆變性

目前六十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點（二）SDS裂解法將細菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細胞壁，再用SDS裂解去壁細胞，從而溫和地釋放質(zhì)粒到等滲液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA。目前七十頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點由于條件溫和，該法特別適用于大質(zhì)粒DNA（>15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會與細胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。目前七十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點RNA的分離與純化

RNAisolationandpurification目前七十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點一、關(guān)于RNase酶RNA易被RNase水解，RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中RNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵功能RNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復(fù)。Rnase不需要二價陽離子激活目前七十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點RNase酶目前七十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點去除RNase的污染及強有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵。必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性。1.內(nèi)源性RNA酶（intrinsicRNase）目前七十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點2.外源性RNA酶(extrinsicRNase)主要來源：被污染的緩沖液細菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶，必須丟棄自動移液裝置目前七十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點3.實驗室采取避免RNA酶污染的措施設(shè)置專門RNA移液裝置小份保存緩沖液設(shè)置專門的RNA電泳裝置準(zhǔn)備溶液或緩沖液時，使用無RNA酶的器皿、焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水等分離RNA過程中使用RNA酶抑制劑目前七十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點1.變性劑(denaturant)選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強烈的胍類變性劑）使用蛋白酶K(proteinaseK)使用陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉二、RNA酶抑制劑和變性劑目前七十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點胍類變性劑(carbamidine)：胍鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑。蛋白質(zhì)變性劑中作用最強的是異硫氰酸胍和鹽酸胍，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成隨機卷曲狀態(tài)。鹽酸胍抑制RNA酶作用強，變性作用較異硫氰酸胍弱。異硫氰酸胍自身可形成氫鍵，在還原劑存在下斷裂氫鍵。變性劑作用原理目前七十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對RNA的降解。2.RNA酶抑制劑(RNaseinhibitor)目前八十頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點（1）DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。

OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O==DEPC水制備：0.1%DEPC在37°C處理1h，并高壓滅菌15min。玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37°C處理1h或室溫下過夜。DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的過程中不使用DEPC。目前八十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十一點（2）RNA酶的蛋白抑制劑許