第四篇藥物的含量測定方法及驗證

第四篇藥物的含量測定方法及驗證第一頁，共67頁。分析方法方法優(yōu)點方法缺點適用對象容量分析法簡便、準(zhǔn)確度好、精密度高專屬性差化學(xué)原料藥含量測定光譜分析法簡便、快速、靈敏度高專屬性差制劑中溶出度、釋放度測定色譜法靈敏度高、專屬性好操作相對復(fù)雜（低）制劑的含量測定定量方法特點：第二頁，共67頁。第一節(jié)定量分析方法的分類與特點

一、容量分析法（一）容量分析法的特點

操作簡單、快速；比較準(zhǔn)確（RSD＜0.2%）；儀器普通易得。第三頁，共67頁。1.滴定度（T）的概念每1ml滴定液相當(dāng)于被測物質(zhì)的量(mg)2.滴定度的計算aA+bBcC+dD

T=M×a/b×B3.百分含量的計算（原料藥）（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%

F=實際濃度/規(guī)定濃度

（二）容量分析法的有關(guān)計算第四頁，共67頁。（2）剩余滴定法

T——滴定度，每1ml滴定液相當(dāng)于被測組分的mg數(shù)

V——滴定時，供試品消耗滴定液的體積（ml）

V0——滴定時，空白消耗滴定液的體積（ml）F——濃度校正因子

ms——供試品的質(zhì)量

第五頁，共67頁。雙相滴定法測定苯甲酸鈉含量。取本品0.3220g,加水15ml，乙醚30ml與甲基橙3滴，用鹽酸滴定，至水層顯橙紅色，分取水層，置具塞錐形瓶中，加乙醚20ml，振搖，繼續(xù)滴定至持續(xù)橙紅色，消耗鹽酸體積。計算樣品中苯甲酸鈉含量。苯甲酸鈉分子量。第六頁，共67頁。司可巴比妥的含量測定：取供試品，置碘量瓶中，加水10ml，振搖使溶解，精密加溴滴定液（0.1mol/L)25ml，再加鹽酸5ml，立即密塞并振搖1min，暗處靜置15min后，加碘化鉀試液10ml，立即密塞搖勻，用硫代硫酸鈉滴定液滴定，至近終點時加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。已知：樣品消耗硫代硫酸鈉滴定液，空白消耗，每ml溴滴定液（0.1mol/L)相當(dāng)于的司可巴比妥。計算含量第七頁，共67頁。片劑含量測定結(jié)果的計算

第八頁，共67頁。煙酸片含量測定

取本品10片精密稱定為g，研細(xì)，精密稱取，置100mL錐形瓶中水浴加熱溶解后，放冷。加酚酞指示劑3滴，用氫氧化鈉滴定液（)滴定至粉紅色消耗25.02mL。每1mL氫氧化鈉滴定液()相當(dāng)?shù)臒熕?。求供試品中煙酸的?biāo)示百分含量（標(biāo)示量g/片）。第九頁，共67頁。標(biāo)示量%=V×T×F×平均片重W×標(biāo)示量×100%=25.02×××0.3729=99.17%×100%第十頁，共67頁。

二、光譜分析法

（一）紫外-可見分光光度法（200nm～760nm)

靈敏度高，可達(dá)10-7g/ml～

10-4g/ml1.特點準(zhǔn)確度高，RSD（%）<2%

儀器價格低廉操作簡單，易普及，應(yīng)用廣

2.定量：朗伯-比耳定律A=E1%1cmCl

第十一頁，共67頁。

3.儀器校正和檢定

波長校正用汞燈中較強譜線237.38,253.65,275.28,296.73,與

或用儀器中氘燈的與進(jìn)行校正。

吸收度的檢定：用K2CrO7H2SO4液至1000ml

波長(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)

E1%1cm

雜散光檢查：試劑濃度(g/ml)測定波長透光率(%)

NaI1.00220nm＜

NaNO2

5.00340nm＜第十二頁，共67頁。4.對溶劑的要求:220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上溶劑+吸收池A＜0.40＜0.20＜0.10＜

5.測定方法要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3～

對照品比較法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%常用方法吸收系數(shù)法：含量%=(E1%1cm

)x/(E1%1cm

)r×100%

計算分光光度法：VitA的三點校正法比色法第十三頁，共67頁。硫噴妥鈉的含量測定：取供試品，用水稀釋至500ml，精密取1ml用0.4%NaOH溶液定量稀釋至100ml，作為供試品溶液；另取硫噴妥對照品用0.4%NaOH溶液配制濃度為作為對照品溶液。照分光光度法，在304nm波長處分別測得供試品和對照品的吸收度為和，已知1mg硫噴妥相當(dāng)于的硫噴妥鈉，試計算硫噴妥鈉的含量對照品比較法第十四頁，共67頁。（2）吸收系數(shù)法

第十五頁，共67頁。對乙酰氨基酚的含量測定方法為

精密稱取本品，置250ml量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液50ml溶解后，加水至刻度，搖勻，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液10ml，加水至刻度，搖勻。在257nm的波長處測定吸收度為，按C8H9NO2的百分吸收系數(shù)為715計算。第十六頁，共67頁。

（二）熒光分光光度法

靈敏度高，可達(dá)10-12g/ml～

10-10g/ml

在低濃度進(jìn)行測定，防止F與C不成正比及自熄滅作用

1.特點

用基準(zhǔn)物溶液校正儀器靈敏度，防止樣品液熒光衰減靈敏度高，但干擾因素多。制備熒光衍生物，可提高其靈敏度和選擇性。用樣品量少。

第十七頁，共67頁。2.熒光分析儀有二個單色光器—激發(fā)單色光器與發(fā)射單色光器；且激發(fā)光源、樣品池和檢測器成直角。含量測定常用的方法為對照品比較法:Cx=(Rx-Rxb)/(Rr-Rrb)×Cr

收載利血平片第十八頁，共67頁。三、色譜分析法色譜分析法的特點與適用范圍高靈敏度，可達(dá)10-15g/ml～

10-12g/ml高專屬性，強分離能力高效能，可多組分同時定量分析色譜法分類：PC；TLC；柱色譜；GC，HPLC高相液相色譜法分類：吸附；分配；離子交換；排阻色譜等。第十九頁，共67頁。高效液相色譜儀第二十頁，共67頁。色譜柱色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用正相HPLC：極性填充劑，弱極性流動相反相HPLC：固定相極性小于流動相極性，大多C18柱、甲醇、乙腈、水（緩沖液）作流動相。一般色譜柱使用溫度不超過40℃，流動相pH控制在28之間。第二十一頁，共67頁。檢測器

作用——用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。 目前最常用的檢測器主要有：紫外-可見檢測器熒光檢測器電化學(xué)檢測器蒸發(fā)光散射檢測器質(zhì)譜檢測器第二十二頁，共67頁。二極管陣列檢測器色譜圖常規(guī)色譜圖三維色譜圖光譜圖第二十三頁，共67頁。第二十四頁，共67頁。1.對HPLC儀器一般要求色譜柱、流動相按品種項下要求。色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于

重復(fù)性：RSD≤2%

拖尾因子：T=W/2A應(yīng)在0.95～1.05

第二十五頁，共67頁。

正常峰和不正常峰如何判斷？用拖尾因子（對稱因子）：T

T=W/2A第二十六頁，共67頁。

內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量3.測定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法外標(biāo)法測定供試品中主成分含量外標(biāo)一點法含量=×CRAXAR

外標(biāo)一點法：一種濃度對照物對比樣品中待測組分含量前提：截距接近0，對照品濃度與待測組分濃度接近第二十七頁，共67頁。內(nèi)標(biāo)法：對內(nèi)標(biāo)物要求：a．內(nèi)標(biāo)物須為原樣品中不含組分b．內(nèi)標(biāo)物與待測物保留時間應(yīng)接近且c．內(nèi)標(biāo)物為高純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或含量已知物質(zhì)校正因子（f）=AS/CSAR/CR含量（CX）=fA’S/CS’AX第二十八頁，共67頁。內(nèi)標(biāo)法優(yōu)點：進(jìn)樣量不超量時，重復(fù)性及操作條件對結(jié)果無影響只需待測組分和內(nèi)標(biāo)物出峰，與其他組分是否出峰無關(guān)。內(nèi)標(biāo)法缺點：制樣要求高；須尋找合適內(nèi)標(biāo)物第二十九頁，共67頁。外標(biāo)法特點：

1）不需要校正因子，不需要所有組分出峰

2）結(jié)果受進(jìn)樣量、進(jìn)樣重復(fù)性和操作條件影響大

→每次進(jìn)樣量應(yīng)一致，否則產(chǎn)生誤差第三十頁，共67頁。例：醋酸氫化可的松的含量采用HPLC法測定：取本品對照品適量，精密稱定，加甲醇定量稀釋成每ml約含的溶液。精密量取該溶液和內(nèi)標(biāo)溶液（炔諾酮甲醇溶液）各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取本品適量，同法測定，按內(nèi)標(biāo)法計算含量。已知：對照品取樣為，樣品取樣為，測得對照液中醋酸氫化可的松和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別為5467824和6125843，樣品液中藥物和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別為5221345和6122845，計算本品的含量第三十一頁，共67頁。概述含金屬與鹵素藥物須處理后進(jìn)行測定。處理方法視結(jié)合牢固程度而異。鹵素與芳環(huán)相連牢固；與脂肪族碳相連，結(jié)合不牢固。

含金屬藥物：金屬不直接與碳相連為含金屬的有機藥物，不牢固，一般直接測定；金屬與碳相連為有機金屬藥物，須適當(dāng)處理。

第二節(jié)定量分析樣品前處理方法不經(jīng)有機破壞的分析方法經(jīng)有機破壞的分析方法第三十二頁，共67頁。1、直接測定法金屬元素不直接與碳原子相連的含金屬有機藥物或C-M鍵結(jié)合不牢的有機金屬藥物，在水溶液中可電離，不須破壞直接采用適當(dāng)?shù)姆椒y定如葡萄糖酸鈣中的鈣離子-EDTA絡(luò)合滴定一、不經(jīng)有機破壞的分析方法第三十三頁，共67頁。2、經(jīng)（酸、堿）水解后測定法方法原理（鹵素）：將含鹵素的有機藥物溶于適當(dāng)溶劑中，加氫氧化鈉或硝酸銀溶液加熱回流使其水解，將有機結(jié)合的鹵素，經(jīng)水解作用轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機鹵素離子，然后采用間接銀量法測定。如三氯叔丁醇的測定。間接銀量法：定量加入過量的AgNO3

，過量的硝酸銀以硫氰酸銨為滴定劑，硫酸鐵銨為指示劑滴定。第三十四頁，共67頁。CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH

△回流(CH3)2-CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl

+AgNO3

AgCl↓

+NaNO3

AgNO3+

NH4SCNAgSCN↓+

NH4NO3（淡棕紅色）(Ksp=1.56×10–10)(Ksp=1.0×10-12)Fe3++SCNˉFe(SCN)2+

第三十五頁，共67頁。3、經(jīng)還原后測定法堿性還原后測定方法原理；在氫氧化鈉和鋅粉存在的條件下，有機藥物（多用于含碘有機藥物）加熱回流，發(fā)生還原裂解反應(yīng)，使有機結(jié)合的鹵素（碘）轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機鹵素離子（碘離子），繼而采用間接銀量法或其他方法進(jìn)行測定，如泛影酸的測定。適用范圍：碘原子與苯環(huán)直接相連的藥物。第三十六頁，共67頁。例泛影酸的測定

取本品約，精密稱定，加氫氧化鈉溶液30ml與鋅粉，加熱回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗滌，濾過，燒瓶與濾器用水洗滌3次，每次15ml，洗液與濾液合并，加冰醋酸5ml與曙紅鈉指示液5滴，用硝酸銀滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于的C11H9I3N2O4。第三十七頁，共67頁。COOHINHCOCH3IIH3COCHN+11NaOH+Zn回流△COONaNH2

H2N+3NaI+2CH3COONa+2Na2ZnO2+H2O第三十八頁，共67頁。酸性還原后測定法方法原理；在醋酸和鋅粉存在的條件下，有機藥物（多用于含碘有機藥物），發(fā)生還原裂解反應(yīng)，使有機結(jié)合的鹵素（碘）轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機鹵素離子（碘離子），采用銀量法測定鹵素離子的含量。第三十九頁，共67頁。二、經(jīng)有機破壞的分析方法（一）、濕法破壞硝酸-高氯酸法：破壞能力強，反應(yīng)激烈，需防止爆炸。適用于生物樣品的破壞，所得的無機金屬離子為高價態(tài)。硝酸-硫酸法：適用于與碳原子結(jié)合牢固的絕大多數(shù)含金屬有機藥物的破壞分解（但不適用于含堿土金屬類有機藥物），所得的無機金屬離子為高價態(tài)。硫酸-硫酸鹽法：常用的硫酸鹽為硫酸鉀，所得的無機金屬離子為低價態(tài)。常用于含砷或銻有機藥物的破壞分析。第四十頁，共67頁。凱氏定氮法-含氮有機藥物定量分析方法

原理：常用凱氏定氮法測定天然有機物(如蛋白質(zhì)、核酸及氨基酸等)的含氮量。含氮的有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后用標(biāo)準(zhǔn)無機酸滴定，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)計算出待測物中的總氮量。第四十一頁，共67頁。CH2NH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2十4H2O十NH3

2NH3+H2SO4(NH4)2SO4

(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+H2O+Na2SO4NH3+H3BO3NH4BO2+H2ONH4BO2+H2SO4+2H2O

(NH4)2SO4+2H3BO3

（直接滴定法）還可用剩余滴定法或甲醛法滴定第四十二頁，共67頁。消解劑：硫酸消解時通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。對某些難以分解的藥物（如含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)藥物），在消解過程中常還需加入輔助氧化劑，以使分解完全并縮短消解時間。常用的輔助氧化劑有過氧化氫和高氯酸，但需慎用。第四十三頁，共67頁。第四十四頁，共67頁。

某一固體樣品中的含氮量是用100g該物質(zhì)(干重)中所含氮的g數(shù)來表示(％)。因此在定氮前，應(yīng)先將固體樣品中的水分除掉。若樣品為液體(如血清等)，可取一定體積樣品直接消化測定。常量法取供試品的量約相當(dāng)于含氮量25~30mg

半微量法供試品取樣量約相當(dāng)于含氮量

第四十五頁，共67頁。中國藥典用本法測定含有氨基或酰胺結(jié)構(gòu)的藥物含量。對于以偶氮或肼等結(jié)構(gòu)存在的含氮藥物，因在消解過程中易于生成氮氣而損失，須在消解前加鋅粉還原后再依法處理；而雜環(huán)中的氮因不易斷鍵而難以消解，可用氫碘酸或紅磷還原為氫化雜環(huán)后再行消解。對于含氮量較高的樣品（超過10%），可在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等作為還原劑，以利于氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘?。第四十六頁，?7頁。（二）、干法破壞1、高溫?zé)胱品?/p>

將有機物灼燒灰化以達(dá)分解的目的。將適量樣品置于瓷坩堝或鉑坩堝中，加入無水碳酸鈉、氫氧化鈣或輕質(zhì)氧化鎂等以助灰化，混勻后，先小火加熱使樣品完全炭化，然后高溫灼燒，使其完全灰化。本法適用于濕法不易破壞完全的藥物以及不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機藥物。第四十七頁，共67頁。2、氧瓶燃燒法系指將有機藥物放入充滿氧氣的密閉的燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別，檢查或含量測定。第四十八頁，共67頁。適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機藥物的分析本法簡便、快速、破壞完全，尤其用于微量樣品分析第四十九頁，共67頁。基本原理有機物充O2燒瓶燃燒產(chǎn)物吸收液→分析儀器裝置和設(shè)備（1）燃燒瓶（2）稱樣材料及稱樣方法：無灰濾紙：適用于固體；紙袋：適用于液體（3）氧氣：采用鋼瓶氧氣，防止導(dǎo)氣管污染。（4）吸收液：定量吸收供試品的燃燒分解產(chǎn)物，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楸阌跍y定的價態(tài)。第五十頁，共67頁。第五十一頁，共67頁。藥物破壞后吸收液定量方法含氟氟化氫水硒素氟藍(lán)比色法含氯氯化氫NaOH水溶液銀量法含溴溴+溴化氫NaOH水溶液+還原劑SO2銀量法含碘各種價態(tài)碘NaOH水溶液+還原劑SO2銀量法含硫三氧化硫H2O2溶液重量法含磷五氧化二磷水磷鉬藍(lán)比色法含硒四價硒+少量六價硒硝酸溶液二氨基萘比色法選擇原則：被測物質(zhì)的種類及所用分析方法第五十二頁，共67頁。3、注意事項：（1）燃燒瓶：大小適宜、干凈、有防爆措施（2）氧氣要充足：燃燒完全（不得有黑色炭化物）（3）產(chǎn)生煙霧應(yīng)完全被吸收：充分振搖煙霧顏色：碘，紫色；溴，紅棕色；氟、氯,白（4）測定氟化物：石英制燃燒瓶第五十三頁，共67頁。

待分解樣品量

燃燒瓶的體積3~5mg（微量分析）150~250ml20~30mg（半微量分析）300~500ml50~60mg1000ml0.6~0.7g或更多2000ml或特殊結(jié)構(gòu)的燃燒瓶第五十四頁，共67頁。

正確選用燃燒瓶的目的在于：樣品能在足夠的氧氣中燃燒分解完全；有利于將燃燒分解產(chǎn)物較快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。第五十五頁，共67頁。需驗證的分析項目1.鑒別試驗；2.雜質(zhì)定量或限度檢查；3.原料或制劑中有效成分含量測定；4.制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的測定；5.溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法。第三節(jié)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第五十六頁，共67頁。一、準(zhǔn)確度

是指用該方法測定結(jié)果與真實值接近的程度，用回收率表示（一）含量測定方法的準(zhǔn)確度

1.原料藥可用已知純度對照品或樣品進(jìn)行測定；或與已建準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。

2.制劑要考察輔料對回收率的影響。采用在空白輔料中加入原料對照品的方法作回收率試驗，然后計算RSD。具體做法：測定高、中、低三個濃度（n=3）,共9個數(shù)據(jù)來評價，回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC法時，一般回收率可達(dá)98%～102%；容量法可達(dá)99.7%～%

第五十七頁，共67頁。

二、精密度

是指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次測定結(jié)果之間的接近程度。

（一）精密度表示方法

1.偏差(deviation,d)d=測得值-平均值=Xi-X

2.標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.相對標(biāo)準(zhǔn)差(relativestandarddeviation,RSD)RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%=S/X×100%第五十八頁，共67頁。（二）重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性

1.重復(fù)性在相同條件下,由一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度.2.中間精密度在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果的精密度。

3.重現(xiàn)性在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果的精密度。第五十九頁，共67頁。

三、專屬性是指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。

（一）鑒別反應(yīng)應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。第六十頁，共67頁。

（二）含量測定和雜質(zhì)測定色譜法和