第十八章-臨床標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)

第十八章-臨床標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)第一頁，共52頁。常見臨床標(biāo)本1、血液

2、尿液

3、糞便4、

4、膿汁

5、痰

6、穿刺液（胸水、腹水、心包液、關(guān)節(jié)液、腦脊液）

7、膽汁

8、咽拭子

第二頁，共52頁。標(biāo)本采集的基本原則盡早采集

病程早期、急性期、癥狀典型時(shí)、抗生素治療前

無菌采集

標(biāo)本容器須滅菌處理，但不得使用消毒劑選擇合適方法采集適量采集腸熱癥患者，病程第1周采集血液、第2周糞便、第3周尿液安全采集

注意防止污染、避免自身感染

標(biāo)本的運(yùn)送采樣后立即送檢，一般不超過1h痰、尿標(biāo)本應(yīng)保存在4℃；腦脊液、滑膜液應(yīng)25℃保存第三頁，共52頁。檢驗(yàn)的基本程序第四頁，共52頁。初次分離選用的培養(yǎng)基類別血液、骨髓先增菌后接種血、巧、中胸腹水先增菌后接種血、巧、中腦脊液先增菌后接種血、巧、中膽汁先增菌后接種血、中尿液接種血、中糞便接種SS、中痰、咽拭子接種血、巧、中膿、傷口分泌物接種血、巧、中白喉棒狀桿菌接種血、胱氨酸亞碲酸鉀血瓊脂淋病奈瑟菌接種血、MTM真菌沙保羅瓊脂第五頁，共52頁。檢驗(yàn)的報(bào)告方式初步報(bào)告方式

涂片染色、直接鏡檢

從染色性、基本形態(tài)、排列方式幾方面報(bào)告

陽性結(jié)果：檢出XX性XX菌，形似XX菌找到XX性XX菌找到真菌菌絲和孢子

陰性結(jié)果：未找到或未檢出細(xì)菌未查到抗酸桿菌未發(fā)現(xiàn)真菌菌絲或孢子第六頁，共52頁。檢驗(yàn)的報(bào)告方式確定報(bào)告方式經(jīng)分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)及血清學(xué)試驗(yàn)后

報(bào)告

陽性結(jié)果：培養(yǎng)出XX細(xì)菌有XX細(xì)菌生長檢出XX群XX菌培養(yǎng)XX天有XX菌生長

陰性結(jié)果：未培養(yǎng)出細(xì)菌

未檢出細(xì)菌

培養(yǎng)XX天無細(xì)菌生長第七頁，共52頁。第一節(jié)、

血液標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)血液標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)是診斷菌血癥或敗血癥的基本方法。如從患者血液中檢出細(xì)菌，一般應(yīng)視為病原菌。常見的病原菌主要有：

1、革蘭陽性菌：金黃色葡萄球菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、肺炎鏈球菌、腸球菌草綠色鏈球菌

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌、結(jié)核分枝桿菌

2、革蘭陰性菌腦膜炎奈瑟菌、卡他莫拉菌傷寒及副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌

3、其他病原菌：念珠菌、新型隱球菌第八頁，共52頁。血培養(yǎng)最佳的采血時(shí)機(jī)？第九頁，共52頁。最佳采血時(shí)機(jī)一般于病人發(fā)熱1-2天內(nèi)采集血液標(biāo)本。盡可能在未使用抗菌藥物前采集。對(duì)已經(jīng)使用抗菌藥物的患者，則在下一次使用抗菌藥物之前采集。盡可能在寒戰(zhàn)或發(fā)熱前0.5～1h內(nèi)采集。第十頁，共52頁。血培養(yǎng)瓶的消毒取下頂部保護(hù)性的彈性帽蓋。注意：內(nèi)部的橡皮塞并非無菌的，必須進(jìn)行消毒。75%酒精消毒血培養(yǎng)瓶橡皮塞子60s。將標(biāo)本注入培養(yǎng)瓶內(nèi)。第十一頁，共52頁。采血套數(shù)及采血量應(yīng)在不同部位采集2～3套血培養(yǎng)。應(yīng)在10min內(nèi)完成采血。成人每瓶血培養(yǎng)應(yīng)采8～10ml。兒童每瓶采3～5ml。新生兒0.5ml。嬰幼兒1～2ml，采血量不能超過全血量的1%。增菌培養(yǎng)液與血液的比例為10：1。嬰幼兒不需常規(guī)做厭氧菌血培養(yǎng)。第十二頁，共52頁。感染性心內(nèi)膜炎對(duì)血培養(yǎng)檢測的特殊要求血培養(yǎng)套數(shù)：建議起始采集3套血培養(yǎng)，如果24h內(nèi)報(bào)告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)，共采集5套血培養(yǎng)。解釋：采集多套血培養(yǎng)，其一，可以幫助判斷陽性血培養(yǎng)是真性菌血癥，還是由污染菌引起，因?yàn)橛晌廴揪鸬耐诙嗵籽囵B(yǎng)中僅有一套報(bào)陽性；其二，多套血培養(yǎng)可以提供更充足的采血量，而血量是影響血中微生物檢出的非常重要的因素；其三，多套血培養(yǎng)可幫助判斷是否為持續(xù)性菌血癥。如病人已實(shí)施治療，應(yīng)在增菌培養(yǎng)液中加入相應(yīng)拮抗劑：磺胺類藥物→對(duì)氨基苯甲酸5mg/100ml.青霉素→2u青霉素酶/ml氨基糖苷類、多粘菌素類→聚回香腦磺酸鈉其他抗生素→MgSO45mg/100ml第十三頁，共52頁。血標(biāo)本采集的注意事項(xiàng)應(yīng)從靜脈采血，不建議采集動(dòng)脈血。血培養(yǎng)不宜從靜脈導(dǎo)管或靜脈留置裝置取血。血培養(yǎng)瓶常溫保存，不應(yīng)冷藏；采集血標(biāo)本后請(qǐng)立即送到檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測，如果是夜班采集標(biāo)本，可以放室溫保存（不要冷藏或者放到孵箱內(nèi)，第二天交班請(qǐng)立即送到檢驗(yàn)科。第十四頁，共52頁。血液標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法和操作流程第十五頁，共52頁。3.報(bào)告方式培養(yǎng)7d無菌生長者報(bào)告“培養(yǎng)7d無菌生長”。查見細(xì)菌報(bào)告菌名和藥敏結(jié)果。2.培養(yǎng)瓶中有細(xì)菌生長時(shí)的不同表現(xiàn)。第十六頁，共52頁。第二節(jié)腦脊液標(biāo)本腦脊液的細(xì)菌學(xué)檢查對(duì)于細(xì)菌性腦膜炎的診斷有重要價(jià)值。正常人的腦脊液是無菌的，檢出細(xì)菌提示有細(xì)菌性（急性化膿性、結(jié)核性等）腦膜炎。第十七頁，共52頁。標(biāo)本中常見的病原菌一、革蘭陽性菌

金葡菌

A群（化膿性）鏈球菌

B群（無乳）鏈球菌新生兒肺炎鏈球菌成人結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌二、革蘭陰性菌

腦膜炎奈瑟菌成人流感嗜血桿菌兒童三、真菌

新型隱球菌白色念珠菌第十八頁，共52頁。（一）標(biāo)本的采集由臨床醫(yī)師以無菌操作腰椎穿刺(圖5一3)，抽取腦脊液3一5ml,盛于無菌容器中立即送檢，一般不能超過1h。腦膜炎奈瑟菌離體后能產(chǎn)生自溶素、迅速自溶;肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌也易死亡。因此腦脊液無論涂片或培養(yǎng)、必須于采集后立即送檢或床旁接種，不宜將其置于冰箱保存、否則影響檢出率。第一管作微生物學(xué)檢驗(yàn)、第二管生化和免疫學(xué)檢驗(yàn)、第三管腦脊液常規(guī)。第十九頁，共52頁。腦脊液標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法和操作流程圖第二十頁，共52頁。(1)一般細(xì)菌涂片檢查:

化膿性腦膜炎腦脊液大部分明顯混濁，可直接涂片，無色、透明的腦脊液3000r/min,離心10-15min后涂片，革蘭染色后鏡檢。根據(jù)染色及形態(tài)特征,?？沙醪教崾炯?xì)菌的種類例如，革蘭陰性、凹面相對(duì)的球菌，可能是腦膜炎奈瑟菌；鏈狀排列的革蘭陽性球菌，可能是鏈球菌；長絲狀等多形態(tài)性的革蘭陰性桿菌，可能是流感嗜血桿菌。⑵結(jié)核分枝桿菌涂片檢查:

取腦脊液的離心(3000r/min,30min)沉淀物作抗酸染色，發(fā)現(xiàn)紅色桿菌，報(bào)告“找到抗酸桿菌”。如有纖維團(tuán)，直接取纖維團(tuán)涂片。鏡檢必須非常仔細(xì)，因?yàn)橥谝粡埐Ｆ现荒苷业?一2個(gè)結(jié)核菌。(3)新型隱球菌涂片檢查

取腦脊液的離心沉淀物作墨汁負(fù)染色，加蓋片后高倍鏡檢，黑色背景中見有菌體和較寬的莢膜，可能為“新型隱球菌”。1、涂片檢查（二）檢驗(yàn)方法和操作流程第二十一頁，共52頁。第二十二頁，共52頁。第二十三頁，共52頁。（二）檢驗(yàn)方法和操作流程

2.分離培養(yǎng)

標(biāo)本離心后接種血平板、巧克力平板，5-10％CO235℃培養(yǎng)18-24h，進(jìn)一步鑒定。

血平板CO2環(huán)境培養(yǎng)，易于識(shí)別β溶血鏈球菌和肺炎鏈球菌

巧克力平板CO2環(huán)境培養(yǎng)，有利于檢出肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌。3.報(bào)告方式

培養(yǎng)48小時(shí)，仍無菌生長者報(bào)告“培養(yǎng)2天無細(xì)菌生長”。查見細(xì)菌報(bào)告細(xì)菌，報(bào)告菌名和藥敏結(jié)果。

第二十四頁，共52頁。第三節(jié)痰標(biāo)本下呼吸道的痰液是無細(xì)菌的，而經(jīng)口腔咳出的痰帶有多種上呼吸道的正常寄生菌（如草綠色鏈球菌）。若從患者痰標(biāo)本中查見致病菌或條件致病菌，提示有下呼吸道感染。常見的病原菌主要有：（1）革蘭陽性菌

肺炎鏈球菌、A群鏈球菌、金黃色葡萄球菌結(jié)核分枝桿菌、白喉棒狀桿菌（2）革蘭陰性菌

卡他布蘭漢菌、腦膜炎奈瑟菌流感嗜血桿菌、腸桿菌科細(xì)菌銅綠假單胞菌、嗜肺軍團(tuán)菌（2）其他病原菌

放線菌、奴卡菌、真菌、肺炎支原體第二十五頁，共52頁。（一）痰標(biāo)本的采集標(biāo)本采集方法

(1)自然咳痰法

(2)支氣管鏡采集法

(3)氣管穿刺法

(4)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)本收集法：收集24h痰液以提高陽性檢出率。第二十六頁，共52頁。

呼吸系統(tǒng)標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法和操作流程第二十七頁，共52頁。（二）檢驗(yàn)方法和操作流程

1.肉眼觀察包括顏色、粘度、有無血絲或膿。2.涂片檢查

其一、確定標(biāo)本是否適合作培養(yǎng)，在低倍鏡下觀察白細(xì)胞和上皮細(xì)胞的數(shù)目多少來評(píng)定(如表)；其二、初步判定是否有病原菌存在。分級(jí)白細(xì)胞（個(gè)）上皮細(xì)胞（個(gè)）A>25<10B>25<25C<10>25痰標(biāo)本鏡下分類注：A、B兩種情況的痰標(biāo)本適合做培養(yǎng)，C不合適，應(yīng)重新留標(biāo)本第二十八頁，共52頁。（1）一般細(xì)菌涂片挑取膿性或血性痰液制成薄而均勻的涂片，革蘭染色后鏡檢。（2）結(jié)核分枝桿菌涂片

①挑取膿性或血性痰液制成薄而均勻的涂片，作抗酸染色鏡檢。②濃集法菌檢根據(jù)所見結(jié)果報(bào)告“找到(或未查到)抗酸桿菌”。（3）放線菌及諾卡菌涂片

將痰液用生理鹽水洗滌數(shù)次，挑取黃色顆?；虿煌该鞯闹唿c(diǎn)，置載玻片上、覆以蓋玻片、輕輕擠壓，置高倍鏡下觀察其結(jié)構(gòu)、如見中央為交織的菌絲，末端呈放線狀排列，然后揭去蓋玻片。干燥后作革蘭和抗酸染色鏡檢。如查見中間菌絲部分為革蘭陽性，四周放射菌絲為革蘭陰性，而抗酸染色陰性，可報(bào)告為“找到染色、形態(tài)疑似放線菌”;如查見革蘭染色結(jié)果與放線菌相同，而抗酸染色弱陽性者，可報(bào)告為“找到染色、形態(tài)疑似奴卡菌”;肉眼觀察未見黃色顆粒，革蘭染色與抗酸染色均為陰性，報(bào)告為陰性。第二十九頁，共52頁。結(jié)核分枝桿菌第三十頁，共52頁。奴卡菌第三十一頁，共52頁。

3.培養(yǎng)（1）培養(yǎng)標(biāo)本的選擇：應(yīng)選擇粘液膿痰作涂片，排除不合格的標(biāo)本。（2）痰標(biāo)本培養(yǎng)前處理：用無菌生理鹽水將痰洗滌3次，加入等量的1%胰酶溶液（PH7.6)，35oC水浴90min，使痰液均質(zhì)化后備用。（3）分離培養(yǎng)處理后痰液接種于血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和麥康凱(或EMB，中國藍(lán))瓊脂平板，置5%-10%二氧化碳環(huán)境中，35℃培養(yǎng)18-24h,根據(jù)菌落及形態(tài)特點(diǎn)，作出初步判斷然后按各類細(xì)菌特征進(jìn)行生化鑒定，并同時(shí)作藥物敏感測定。4.報(bào)告方式痰標(biāo)本培養(yǎng)48小時(shí)后僅有草綠色鏈球菌生長而無致病菌生長，報(bào)告“正常菌群”。查出致病菌，報(bào)告菌名和藥敏結(jié)果，同時(shí)報(bào)告細(xì)菌的量化指標(biāo)(表5-3)，如“少量、中等或多量”。第三十二頁，共52頁。分級(jí)劃線區(qū)菌落數(shù)目第1區(qū)第2區(qū)第3區(qū)少見（+）<10少量（++）>10<5中等（+++）>10>5<5多量（++++）>10>5>5表5-3痰標(biāo)本在平板上的菌落量化指標(biāo)第三十三頁，共52頁。第四節(jié)尿標(biāo)本中段尿培養(yǎng)加計(jì)數(shù)對(duì)于泌尿道感染的診斷有重要價(jià)值。細(xì)菌培養(yǎng)必須結(jié)合菌落計(jì)數(shù)辨別是否為病原菌。正常人中段尿細(xì)菌數(shù)≤103cfu/ml第三十四頁，共52頁。（一）尿液標(biāo)本的采集1.中段尿采集法最常用2.直接導(dǎo)尿采集法易造成逆行感染，盡量不用3.留置導(dǎo)尿管收集尿液法注意不能從尿液收集袋中采集標(biāo)本4.膀胱穿刺法第三十五頁，共52頁。（二）尿液標(biāo)本中常見的病原菌細(xì)菌中80％為革蘭陰性桿菌，20％為革蘭陽性菌第三十六頁，共52頁。（三）檢驗(yàn)方法和操作流程【涂片檢查】

取離心沉淀物涂片（1）一般細(xì)菌革蘭染色、鏡檢、報(bào)告（2）淋病奈瑟菌革蘭染色、鏡檢，如發(fā)現(xiàn)腎形雙球菌，可報(bào)告“檢出革蘭陰性雙球菌，位于細(xì)胞內(nèi)（或外），形似淋病奈瑟菌”（3）念珠菌革蘭染色、鏡檢，如發(fā)現(xiàn)芽生孢子和假菌絲，且革蘭染色陽性時(shí)，可報(bào)告“檢出念珠菌”。（4）結(jié)核分枝桿菌抗酸染色、鏡檢，如在藍(lán)色背景中查見紅色桿菌，報(bào)告“找到抗酸桿菌”。第三十七頁，共52頁。尿液標(biāo)本細(xì)菌檢驗(yàn)方法和操作流程第三十八頁，共52頁。（三）檢驗(yàn)方法和操作流程

【細(xì)菌培養(yǎng)】1.一般細(xì)菌培養(yǎng)如培養(yǎng)2d無細(xì)菌生長，即可棄去。尿培養(yǎng)的步驟：（1）收集中段尿（2）用10μl標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取尿液接種血平板（連續(xù)劃線）和中國藍(lán)平板（分區(qū)劃線）（3）35℃培養(yǎng)24h

（4）菌落計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)血平板上生長菌落，乘以稀釋倍數(shù)（×100）得出cfu/ml。

若整個(gè)平板菌落多得無法計(jì)數(shù)，可報(bào)告“菌落數(shù)>105/ml”。（5）若≤2種菌生長對(duì)每種菌進(jìn)行鑒定和藥敏；若＞2種菌生長報(bào)告“混合菌群”。第三十九頁，共52頁。2.特殊細(xì)菌培養(yǎng)（1）淋病奈瑟菌培養(yǎng)（2）厭氧菌培養(yǎng)（3）結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)3.報(bào)告方式培養(yǎng)48h無細(xì)菌生長，報(bào)告“2天無細(xì)菌生長”。查見細(xì)菌，報(bào)告菌名及其菌落計(jì)數(shù)（菌落數(shù)/ml）和藥敏結(jié)果。第四十頁，共52頁。第五節(jié)糞便標(biāo)本正常情況下腸道中有多種細(xì)菌。引起感染性腹瀉的病原微生物有：（1）細(xì)菌性：產(chǎn)毒素型腹瀉、侵襲型腹瀉、食物中毒、慢性腹瀉。（2）真菌性（3）病毒性第四十一頁，共52頁。糞便標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法和操作流程第四十二頁，共52頁。（一）標(biāo)本采集1.自然排便法挑取黏液膿血或夾雜假膜部分的糞便2.直腸拭子法直腸拭子標(biāo)本先增菌2-6h后轉(zhuǎn)種。糞便標(biāo)本直接轉(zhuǎn)種SS、中國藍(lán)等選擇培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基選用原則上是一強(qiáng)一弱搭配。第四十三頁，共52頁。（二）檢驗(yàn)方法和操作流程1.涂片檢查糞便標(biāo)本因各種正常菌群含量甚多，僅以染色性和形態(tài)無法分辯是否為病原菌。因此，糞便標(biāo)本一般不作涂片檢查。2.培養(yǎng)判斷糞便培養(yǎng)出的細(xì)菌是否為致病菌，看其是否分解乳糖：致病菌一般不分解乳糖（SS平板上生長無色菌落）；條件致病菌除變形桿菌外，均能分解乳糖（SS平板上生長紅色菌落）（1）沙門-志賀菌培養(yǎng)：①糞便接種于SS平板和中國藍(lán)平板；②挑選SS平板上不發(fā)酵乳糖菌落，分別接種于三糖鐵瓊脂（KIA)和動(dòng)力-吲哚-尿素培養(yǎng)基；③生化反應(yīng)，A-F多價(jià)“O”血清或因子血清進(jìn)行鑒定。第四十四頁，共52頁。（2）致病性大腸埃希菌培養(yǎng)（3）霍亂弧菌培養(yǎng)（4）副溶血弧菌培養(yǎng)（5）小腸結(jié)腸炎耶爾森菌培養(yǎng)（6）空腸彎曲菌培養(yǎng)（7）葡萄球菌培養(yǎng)（8）艱難梭菌培養(yǎng)（9）真菌培養(yǎng)3.報(bào)告方式報(bào)告菌種名稱+藥敏試驗(yàn)結(jié)果第四十五頁，共52頁。第六節(jié)膿液及病灶分泌物標(biāo)本化膿性感染可由單種或多種細(xì)菌引起。常見病原菌主要有革蘭陽性菌：金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、炭疽芽胞桿菌、