藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制

藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)

及過程控制中國藥品生物制品檢定所馬仕洪2010年5月26日上海website:e-mail:tel:

地址：北京市天壇西里2號(hào)郵編：100050

藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制藥品因素環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢查破壞試驗(yàn)方法驗(yàn)證過程控制2藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷3藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制微生物檢查的過程控制一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施（硬件——物質(zhì)保障）二、檢驗(yàn)程序（軟件——有效的結(jié)果）三、結(jié)果判斷（調(diào)查——可靠的結(jié)論）4藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)操作環(huán)境關(guān)鍵設(shè)備對(duì)照培養(yǎng)基物質(zhì)保障5藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)潔凈實(shí)驗(yàn)條件有效性：整體10000級(jí)、局部100級(jí)。安全性：保護(hù)樣品、人員和環(huán)境。可操作性：方便、快捷、順暢。潔凈實(shí)驗(yàn)條件的維護(hù)、驗(yàn)證陽性菌實(shí)驗(yàn)室達(dá)到P2生物安全標(biāo)準(zhǔn)6藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制實(shí)驗(yàn)室改造示例：原布局圖

擬定布局圖

建議布局圖1

建議布局圖2

實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)——中檢所微生物實(shí)驗(yàn)室7藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的管理與維護(hù)：1、屏障系統(tǒng)的有效性壓差、風(fēng)速、微粒、照度（外包服務(wù)合同）2、清潔、靜態(tài)與動(dòng)態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫酒精棉球分離微生物新潔爾滅分離微生物8藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：頭狀葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）9藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制（二）、操作環(huán)境1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺(tái)10藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點(diǎn)評(píng)隔離器？驗(yàn)證困難，滅菌不徹底：假陽性滅菌劑殘留：假陰性生物安全柜？動(dòng)態(tài)驗(yàn)證困難，不適合多任務(wù)的檢驗(yàn)活動(dòng)超凈工作臺(tái)經(jīng)典、廉價(jià)、適合多任務(wù)的檢驗(yàn)活動(dòng)。提高實(shí)驗(yàn)室新風(fēng)供給、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控可以揚(yáng)長避短11藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制搽拭實(shí)驗(yàn)菌株菌液計(jì)數(shù)回收計(jì)數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7%金黃色葡萄球菌646093.8%菌液稀釋、分液的誤差為：5.5%表面搽拭操作的回收率大于99%12藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制（三）、關(guān)鍵設(shè)備

微生物檢查薄膜過濾儀一次性薄膜過濾培養(yǎng)器應(yīng)急檢驗(yàn)用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器13藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制（四）、對(duì)照培養(yǎng)基

培養(yǎng)基適用性（靈敏度）；培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標(biāo)準(zhǔn)化）。對(duì)照培養(yǎng)基理化評(píng)價(jià)（可控性）生物學(xué)評(píng)價(jià)（有效性）回收率比較MPN比較生長曲線比較生態(tài)評(píng)價(jià)某些CRS原則固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法14藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制二、檢驗(yàn)程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷15藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制二、檢驗(yàn)程序接受任務(wù)實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備樣品核對(duì)實(shí)驗(yàn)操作過程監(jiān)控培養(yǎng)觀察有效的結(jié)果物質(zhì)保障16藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系編寫說明及批準(zhǔn)頁1實(shí)驗(yàn)室概況1.1實(shí)驗(yàn)室簡介1.2實(shí)驗(yàn)室通訊資料1.3實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可項(xiàng)目/參數(shù)表1.4實(shí)驗(yàn)室平面圖及功能區(qū)域1.5儀器設(shè)備總覽1.6常備試劑耗材一覽表1.7實(shí)驗(yàn)室發(fā)展目標(biāo)2管理規(guī)范2.1安全管理2.2業(yè)務(wù)流程2.3人員管理（6個(gè)SOP）2.4樣品管理（3個(gè)SOP）3標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程3.1檢驗(yàn)工作SOP（13個(gè)）3.2儀器操作SOP（30個(gè)）3.3實(shí)驗(yàn)記錄SOP（9個(gè)）4實(shí)驗(yàn)室保障4.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、設(shè)備及消耗品供應(yīng)商確定原則4.2實(shí)驗(yàn)室設(shè)施服務(wù)商4.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備供應(yīng)商4.4實(shí)驗(yàn)室消耗品供應(yīng)商17藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制（一）、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備應(yīng)堅(jiān)持“平戰(zhàn)結(jié)合”，物質(zhì)準(zhǔn)備有備無患，應(yīng)隨時(shí)保證“來之能戰(zhàn)”。尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實(shí)驗(yàn)器材等。18藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——無菌室專用酒精棉球制備

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——場地清潔

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——臺(tái)面清潔

19藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制（二）、樣品核對(duì)盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安全性、有效性；仔細(xì)核對(duì)樣品及樣品資料，高度關(guān)注媒體公布樣品（問題樣品），同時(shí)盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)、比較分析；樣品外觀檢查、完整性檢查。20藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制樣品外觀檢查——欣弗

樣品外觀檢查——刺五加

樣品外觀檢查——雙黃連

樣品完整性真空檢漏

21藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制（三）、實(shí)驗(yàn)操作不斷完善標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP），嚴(yán)格避免實(shí)驗(yàn)室污染。實(shí)驗(yàn)人員培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)環(huán)境檢驗(yàn)結(jié)果待檢樣品原料輔料設(shè)備環(huán)境藥品（食品）人員藥品食品生產(chǎn)過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)22藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制實(shí)驗(yàn)操作——物料進(jìn)場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風(fēng)淋、紫外照射）雙層無菌包裝核心區(qū)外圍實(shí)驗(yàn)操作——人員進(jìn)場一更二更核心操作區(qū)實(shí)驗(yàn)操作——無菌操作技術(shù)23藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制（四）、實(shí)驗(yàn)過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控?zé)o菌檢驗(yàn)框架示意圖24藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制三、結(jié)果判斷長菌與否分離鑒定溯源調(diào)查結(jié)果報(bào)告可靠的結(jié)論有效的結(jié)果物質(zhì)保障25藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制三、結(jié)果判斷

是不是微生物？是什么微生物？微生物來自哪里？幾點(diǎn)思考

參見：《FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗(yàn)潔凈室環(huán)境菌的相似性考察》《藥學(xué)學(xué)報(bào)》，2007，42（11）：1189～1194《判斷無菌檢查陽性結(jié)果有效性的實(shí)驗(yàn)探討》《藥物分析雜志》，

2008，28（05）：66～71

26藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制1、長菌與否？渾不渾濁?物理變化、化學(xué)變化還是生物變化？一靠經(jīng)驗(yàn)二靠實(shí)驗(yàn)三靠嚴(yán)格程序控制避免干擾27藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁物理變化？化學(xué)變化？生物學(xué)變化？（2）、平板上的菌落瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層

菌落or藥渣？28藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制菌落or藥渣？經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗(yàn)延長培養(yǎng)時(shí)間到7天重新劃線培養(yǎng)鏡檢29藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制2、分離鑒定（1）立即轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80℃保存；（3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；（4）如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應(yīng)增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應(yīng)進(jìn)一步鑒定，并逐一保藏。30藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD）核酸鑒定（16sRNA、DNA）

……31藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制3、溯源調(diào)查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株檢驗(yàn)過程監(jiān)控菌株環(huán)境菌（近期、遠(yuǎn)期）現(xiàn)場調(diào)查收集菌株鑒定與相似性分析相結(jié)合傳統(tǒng)方法與新技術(shù)相結(jié)合不同方法的交叉驗(yàn)證32藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制微生物來自哪里？

相似性分析同源性分析脈沖場電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR）

33藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制SamplePreparationAutomatedmeasurementafterdryingofthesamples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms圖不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關(guān)系34藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制TheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellwallcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles...FT-IRspectrumisafingerprintofthecellsBiochemicalStructureofCells35藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制36藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制溯源性分析例1——欣弗事件

圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢37藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制編號(hào)濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）0206G渾濁，劇烈產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）0112G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）0104L顆粒狀懸浮物，振搖能散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）298L；298G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）303L；303G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、陰溝腸桿菌（Enterobacter

cloacae）305L；305G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）306L；306G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）307G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）308L渾濁（Alcaligenesfaecalis）308G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）309L渾濁（Alcaligenesfaecalis）309G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）304G渾濁G-桿菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）38藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcus

capitissspcapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus

cohniissp

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）。監(jiān)測(cè)到的環(huán)境菌株39藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制溯源性分析例2編號(hào)BD鑒定走廊1B.pumilus走廊2M.luteus走廊3/無菌室4C.urealyticum無菌室5K.kristinae無菌室6C.urealyticumC1524-FS.capraeC1524-BS.capraeC1525-B1-1S.warneriC1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidisC1526-F2S.haemolyticus菌株16sRNA鑒定可信度C1524-FS.haemolyticus99%C1524-BS.haemolyticus98%C1526-F2S.haemolyticus100%

雙黃連注射液

利巴韋林注射液FTIR相似性分析DuPontRiboPrinter基因指紋分析40藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制幾點(diǎn)思考（1）、怎樣才算是同一株菌？

需要深入認(rèn)識(shí)微生物本身微生物變異與保守的相對(duì)性；分析方法的可變性與微生物本身的可變性；生物學(xué)先鋒琳恩·馬古利斯(LynnMargulis)曾表示：“如果將一個(gè)特殊的質(zhì)粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會(huì)突然間變成克雷伯氏桿菌”。41藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制幾點(diǎn)思考（2）、什么是最適宜的技術(shù)？

需要深入認(rèn)識(shí)分析微生物的技術(shù)和手段