第13章-細胞衰老與凋亡

第13章-細胞衰老與凋亡第一頁，共70頁?！吧?、老、病、死”是生命的四個必然的過程人類面臨著三種衰老：①生理性衰老：隨年齡增長所表現(xiàn)出的生理退化，一切生物皆存在②病理性衰老：由于內在或外在原因使人體發(fā)生病理性變化，使衰老提前發(fā)生，稱早衰③心理性衰老：由于心態(tài)的提前老化而影響整體功能第二頁，共70頁。第一節(jié)細胞衰老一、衰老的概念衰老(aging，senescence)：隨年齡增加，生物內環(huán)境穩(wěn)定性下降，結構與生理機能退行性變化，趨向死亡不可逆的過程。衰老發(fā)生在整體水平、種群水平、個體水平、細胞水平以及分子水平等層次。機體的衰老并不等于所有細胞的衰老，但細胞的衰老與機體衰老密切相關第三頁，共70頁。二、細胞的壽限1、Hayflick界限(Hayflicklimitation)：細胞在體外培養(yǎng)條件下，即使條件適宜，細胞也不能無限制地進行分裂，而是有一定界限細胞的分裂能力與個體年齡有關，從胎兒肺得到的成纖維細胞可傳代50次，而從成人得到的肺成纖維細胞只能傳代20次。第四頁，共70頁。2、細胞的壽限各類細胞的壽命各不相同，一般來說，能夠保持持續(xù)分裂能力的細胞相對不容易衰老，分化程度高又不分裂的細胞壽命大多有限第五頁，共70頁。人體細胞的動態(tài)分類人體細胞壽命依增殖，分化，生存時間，分4類①更新組織：執(zhí)行某種功能的特化細胞，一定時間后衰老死亡，由新細胞分化補充，如上皮細胞、血細胞。②穩(wěn)定組織細胞：分化程度較高，功能專一，一般沒明顯衰老，不分裂，但終生保持分裂能力，受破壞時，其余細胞也能分裂，補充失去的細胞，如肝、腎細胞。第六頁，共70頁。③恒久組織細胞：高度分化細胞，一生沒細胞更替，破壞后不能得補充。如神經(jīng)細胞，骨骼細胞和心肌細胞。④可耗盡組織細胞：卵巢實質細胞，一生中逐漸消耗，不能得到補充，最后消耗殆盡。第七頁，共70頁。三、細胞衰老的形態(tài)學特征細胞衰老主要是細胞生理生化的變化，也反映在細胞形態(tài)結構和功能上：1、細胞內水分的減少：蛋白質水合能力下降,衰老細胞水分減少，細胞皺縮，體積縮小。2、核變化:核膜內折，染色體固縮化，端?？s短3、線粒體的變化：隨年齡增大，數(shù)量減少，體積增大，內容物呈網(wǎng)狀化并形成多囊體，mtDNA缺失突變第八頁，共70頁。4、質膜的變化：流動性下降，磷脂減少，不飽和脂肪酸下降；膜脂過氧化，對刺激反應性下降5、內質網(wǎng)的變化：RER趨向減少和無序化6、蛋白質合成：核糖體合成效率及準確性降低7、色素生成及致密體形成：色素生成隨衰老而增加，并在溶酶體或線粒體中沉積第九頁，共70頁。衰老細胞的形態(tài)變化核增大、染色深、核內有包含物染色質凝聚、固縮、碎裂、溶解質膜粘度增加、流動性降低細胞質色素積聚、空泡形成線粒體數(shù)目減少、體積增大、mtDNA突變或丟失高爾基體碎裂包含物糖原減少、脂肪積聚核膜內陷第十頁，共70頁。四、分子水平的變化衰老細胞DNA、蛋白質和脂類等成分損傷，代謝能力降低，主要表現(xiàn)：DNA：復制與轉錄受抑制，個別基因異常激活，端粒DNA丟失，線粒體DNA特異缺失，DNA氧化、斷裂、缺失和交聯(lián)，甲基化程度降低。RNA：mRNA和tRNA含量降低。第十一頁，共70頁。蛋白質：含成下降，蛋白質糖基化、氨甲酰化、脫氨基等修飾，使蛋白質穩(wěn)定性、抗原性、可消化性下降，自由基使肽斷裂、交聯(lián)而變性。aa由左旋變?yōu)橛倚阜肿樱夯钚灾行谋谎趸?，Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丟失，酶分子二級結構、溶解度、等電點改變，酶失活脂類：不飽和脂肪酸被氧化，引起膜脂間或與脂蛋白間交聯(lián)，膜流動性下降。第十二頁，共70頁。五、細胞衰老的分子機制對衰老機理具有不同學說，主要有:差錯學說(Errortheories):強調衰老是由于細胞中的各種錯誤積累引起.遺傳學說(Genetic/Programmedtheories):強調衰老是遺傳決定的自然演進過程。第十三頁，共70頁。（一）差錯學說細胞衰老是細胞成分因內外環(huán)境受損，因缺乏完善修復，使“差錯”積累，導致細胞衰老。根據(jù)“差錯”的“主因”的不同，又可分不同學說。第十四頁，共70頁。1.代謝廢物積累

(wasteproductaccumulation)代謝產(chǎn)物超量積累危害細胞，引起衰老.褐脂質沉積是典型例子:脂褐質是長壽蛋白和DNA、脂類形成的巨交聯(lián)物。脂褐質結構致密，在溶酶體不能水解也不能外排，在細胞內沉積，阻礙物質交流和信號傳遞，使細胞衰老.老年性癡呆(AD)是由β-淀粉樣蛋白沉積引起。第十五頁，共70頁。2．大分子交聯(lián)(crosslinking)過量的大分子交聯(lián)是衰老的主要因素，如DNA交聯(lián)和膠原交聯(lián)均可損害其功能，引起衰老。在臨床方面膠原交聯(lián)和動脈硬化、微血管病變有密切關系。第十六頁，共70頁。3．自由基學說

(freeradicaltheories)（1）自由基性質:自由基是指在原子核核外層軌道上具有不成對電子的分子或功能基團。如AB兩個原子各提供一個電子通過共價鍵形成分子A:B，這兩個電子是配對的，如發(fā)生均裂,A和B各帶走一個電子形成.A和.B，即稱自由基。第十七頁，共70頁。自由基種類：氧自由基、氫自由基、碳自由基、脂自由基，以氧自由基化學性質最活潑。氧自由基主要包括：超氧自由基.O2，羥自由基.OH和H2O2第十八頁，共70頁。自由基產(chǎn)生的因素：外源性:由環(huán)境輻射、光解、化學物質等引起的內源:由代謝反應產(chǎn)生,是自由基主要來源途徑：①線粒體呼吸鏈電子泄漏產(chǎn)生；②過氧化物酶體的多功能氧化酶催化底物羥化。③機體血紅蛋白、肌紅蛋白可經(jīng)非酶促反應產(chǎn)生自由基。第十九頁，共70頁。（2）自由基對生物大分子的損傷自由基含未配對電子，具高度活性，易與細胞內的生物大分子發(fā)生反應，并發(fā)生傷害①自由基與核酸分子中的堿基發(fā)生加成反應，.OH加到堿基雙鏈上,破壞堿基產(chǎn)生基因突變②自由基可加成到膜脂及不飽和脂肪酸雙鏈,引起脂質過氧化,并產(chǎn)生新的自由基第二十頁，共70頁。③自由基常攻擊肽鏈上的脯氨酸殘基，造成蛋白質斷裂。同時，自由基還引起蛋白質交聯(lián)、破壞蛋白質高級結構④自由基的氧化也常損傷細胞骨架蛋白：肌動蛋白與氧化型谷胱甘肽（GSSG）之間形成二硫鍵，導致分子表面電荷改變，引起大分子聚集第二十一頁，共70頁。(3)衰老的自由基學說美國科學家Harman1955年提出，核心內容:①衰老是自由基對細胞成分的有害攻擊所造成;②該學說提出的自由基是氧自由基;③維持體內適當水平的抗氧化劑和自由基清除劑可延長壽命和推遲衰老第二十二頁，共70頁。正常細胞內存在清除自由基的防御系統(tǒng)，包括①酶系統(tǒng):超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX);②非酶系統(tǒng):VE、醌類物質等電子受體。將銅鋅超氧化物岐化酶基因導入果蠅，使轉基因株具3個拷貝的SOD基因，其壽命比野生型延長1/3。為衰老的自由基學說提供了證據(jù)。第二十三頁，共70頁。4．線粒體DNA突變線粒體是自由基濃度最高的細胞器，氧化磷酸化過程中，1-4%的氧轉為活性氧(ROS)。mtDNA裸露，易受傷害發(fā)生突變，mtDNA復制的聚合酶γ沒校正功能，復制錯誤頻率高。mtDNA突變使呼吸鏈受損，自由基堆積，循環(huán)腦、心、骨骼肌的氧負荷最大，是最易衰老組織第二十四頁，共70頁。5.體細胞突變與DNA修復

外源理化因子，內源自由基均可損傷DNA，使體細胞突變。輻射可致年輕的哺乳動物出現(xiàn)衰老癥狀，與個體正常衰老相似。正常機體存在DNA修復機制，可使損傷DNA修復，年齡增加修復能力下降，使DNA錯誤累積，最終細胞衰老死亡。第二十五頁，共70頁。DNA的修復并不均一，轉錄活躍基因被優(yōu)先修復，在同一基因中轉錄區(qū)被優(yōu)先修復，徹底的修復僅發(fā)生在細胞分裂的DNA復制時期，這是干細胞能永保青春的原因。第二十六頁，共70頁。6．重復基因失活真核生物基因組中存在大量重復序列。主要基因的選擇性重復是基因組的保護機制，也是決定細胞衰老的因素，重復基因的一個拷貝受損或關閉后，其它拷貝被激活，直到最后一份拷貝用完，細胞因缺少某種重要產(chǎn)物而衰亡。小鼠肝細胞重復基因的轉錄靈敏度隨年齡增加而降低，哺乳動物rRNA基因數(shù)隨年齡增加而減少第二十七頁，共70頁。（二）遺傳學說衰老是遺傳決定的自然演進過程，一切細胞均有內在的預定程序決定其壽命，而細胞壽命又決定種屬壽命的差異，外部因素只能使細胞壽命在限定范圍內變動第二十八頁，共70頁。1．程序性衰老

(programmedsenescence)生物的生長、發(fā)育、衰老和死亡都由基因程序控制，衰老是某些基因依次開啟或關閉的結果。小鼠肝中，胚胎早期表達的胞質丙氨酸轉氨酶為A型，隨后停止表達，在衰老時表達B型。第二十九頁，共70頁。其它類似的衰老標志物(markers):如肝中的衰老標志蛋白2也是在老年期表達。衰老還與神經(jīng)內分泌系統(tǒng)退行性變化及免疫系統(tǒng)的程序性衰老有關。第三十頁，共70頁。2．細胞衰老的端粒假說細胞增殖次數(shù)與端粒有關。體細胞染色體端粒DNA隨細胞分裂次數(shù)增加而縮短。細胞DNA復制1次端?？s短1段，至Hayflick點時，啟動DNA損傷檢測點，不可逆退出細胞周期，走向衰亡。人成纖維細胞端粒每年縮短14-18bp，染色體的端粒具細胞分裂計數(shù)器的功能。第三十一頁，共70頁。端粒長度與端粒酶活性有關，端粒酶是一種反轉錄酶，由RNA和蛋白質組成，所含的RNA是合成端粒DNA的模板，而所含的反轉錄亞基則催化端粒DNA的合成。生殖細胞、干細胞和腫瘤細胞端粒酶活性較高，正常體細胞端粒酶活性低，呈抑制狀態(tài)第三十二頁，共70頁。3．長壽基因（longevitygenes）各種動物都有相當恒定的平均壽命和最高壽命，成人早衰癥(Werner‘ssyndrome)病人平均39歲時出現(xiàn)衰老，47歲左右死亡，患嬰幼兒早衰癥的小孩在1歲時出現(xiàn)明顯衰老，12-18歲夭折。由此看物種壽命主要取決于遺傳物質，DNA鏈上可能存在“長壽基因”或“衰老基因”決定個體壽限.第三十三頁，共70頁。

一個37歲的成人早衰癥患者

第三十四頁，共70頁。正常兒童（左）和嬰幼兒早衰癥患者第三十五頁，共70頁。細胞衰老時，衰老相關基因(SAG)表達活躍，人1號、4號及X染色體上發(fā)現(xiàn)SAG。線蟲均壽命3.5d,age-1突變,提高均壽命65%，最大壽命110%,該突變型有較強的抗氧化酶活性早老綜合癥患者體內解旋酶基因存在突變，該基因位于8號染色體短臂，稱WRN基因。淀粉樣蛋白前體基因(APP)突變，導致基因產(chǎn)物β淀粉樣蛋白易于在腦組織中沉積，引起AD。第三十六頁，共70頁。第二節(jié)細胞壞死與凋亡死亡是生命的普遍現(xiàn)象，但細胞死亡并非與機體死亡同步。正常組織中，常發(fā)生“正常”的細胞死亡，它是維持組織機能和形態(tài)所必需。細胞死亡的方式通常有2種：①細胞壞死(necrosis)。②細胞凋亡(apoptosis)。第三十七頁，共70頁。一、細胞壞死細胞受到化學因素(如酸、堿、毒物)、物理因素(如熱、輻射)和生物因素(如病原體)等環(huán)境因素傷害，引起細胞死亡的現(xiàn)象。是一種被動死亡第三十八頁，共70頁。細胞壞死初期，細胞質膜通透性增加，線粒體和ER腫脹、崩解，結構脂滴游離、空泡化，蛋白質顆粒增多，核發(fā)生固縮。胞質蛋白變性、凝固或碎裂，嗜堿性核蛋白降解，細胞質呈強嗜酸性，壞死細胞蘇木精/伊紅染色，胞質呈紅色，原有微細結構消失壞死后期，細胞膜破裂，細胞內容物流出，引起周圍組織炎癥反應。第三十九頁，共70頁。細胞壞死與凋亡的形態(tài)區(qū)別

第四十頁，共70頁。二、細胞凋亡(cellapoptosis)又稱程序性細胞死亡(PCD)：是細胞接受基因指令后的主動死亡。凋亡的細胞散落在正常組織中，無炎癥反應，不遺留疤痕。死亡細胞的碎片很快被巨噬細胞或相鄰細胞所清除，不影響其它細胞的功能第四十一頁，共70頁。程序性細胞死亡表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學特征：①核酸內切酶活化，使染色質DNA在核小體連接部位斷裂，形成約200bp整數(shù)倍的核酸片段，凝膠電泳圖譜呈梯狀；②染色質在核膜下聚集成染色質塊，細胞不斷脫水，胞質凝縮，核膜在核孔處斷裂，細胞以出芽方式形成凋亡小體（apoptoticbody）；第四十二頁，共70頁。③凋亡小體內有結構完整的細胞器、凝縮的染色質，可被鄰近細胞吞噬消化，始終有膜封閉，沒內溶物釋放，不引起炎癥。第四十三頁，共70頁。細胞凋亡和細胞壞死的區(qū)別區(qū)別點細胞凋亡細胞壞死起因生理或病理性病理性變化或劇烈損傷范圍單個散在細胞大片組織或成群細胞細胞膜保持完整破損染色質凝聚在核膜下呈半月狀呈絮狀細胞器無明顯變化腫脹、內質網(wǎng)崩解細胞體積固縮變小腫脹變大凋亡小體有，被鄰近細胞或巨噬細胞吞噬無，細胞自溶，殘余碎片被巨噬細胞吞噬基因組DNA有控降解，電泳圖譜呈梯狀隨機降解，電泳圖譜呈涂抹狀蛋白質合成有無調節(jié)過程受基因調控被動進行炎癥反應無，不釋放細胞內容物有，釋放內容物。第四十四頁，共70頁。左:正常胸腺細胞；右:凋亡胸腺細胞(注意凋亡小體)

第四十五頁，共70頁。第三節(jié)細胞凋亡的分子機理細胞凋亡和增殖是生命的基本現(xiàn)象，是維持體內細胞數(shù)量動態(tài)平衡的基本措施。在胚胎發(fā)育階段以細胞凋亡清除多余的和已完成使命的細胞，保證了胚胎的正常發(fā)育；在成年階段通過細胞凋亡清除衰老和病變細胞，保證了機體健康。第四十六頁，共70頁。細胞凋亡是受基因調控的精確過程apoptosis的途徑主要有:1、胞外信號激活細胞內凋亡酶caspase；2、線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase活化的caspase可將胞內重要蛋白降解，引起細胞凋亡。第四十七頁，共70頁。一、凋亡相關的基因和蛋白細胞凋亡的調控涉及許多基因，包括一些與細胞增殖有關的原癌基因和抑癌基因。其中研究較多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。第四十八頁，共70頁。1．Caspase家族Caspase屬半胱氨酸蛋白酶，近似線蟲ced-3，是引起細胞凋亡的關鍵酶，被信號途徑激活后，能將細胞內蛋白質降解，使細胞不可逆走向死亡第四十九頁，共70頁。特點有：①酶活性依賴于半胱氨酸殘基的親核性；②在天冬氨酸后切斷底物，命名為caspase(cysteineaspartate-specificprotease)；③都由2大、2小亞基組成的異四聚體，大、小亞基由同一基因編碼，前體切割產(chǎn)生2個活性亞基第五十頁，共70頁。Caspase的研究源自于對線蟲的研究線蟲生命周期短，細胞數(shù)量少，成熟的成蟲若是雌雄同體則有959個體細胞，約2000個生殖細胞。若是雄蟲則有1031個體細胞和約1000個生殖細胞。神經(jīng)系統(tǒng)由302個細胞組成，這些細胞來自于407個前體細胞，這些前體細胞中有105個發(fā)生了程序死亡。第五十一頁，共70頁。RobertHorvitz采用體細胞突變方法發(fā)現(xiàn)共有14個基因在C.elegans細胞凋亡中起作用。在細胞凋亡的實施階段起作用的主要有3個：Ced-3、Ced-4和Ced-9。Ced-3和Ced-4的作用是誘發(fā)凋亡。Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用，使凋亡不能發(fā)生，Ced-9功能不足胚胎因細胞過度凋亡而死亡第五十二頁，共70頁。人類與線蟲ced-3同源的基因是白介素-1β轉換酶(ICE)基因，該酶能將白介素前體切割為活性分子，故名。人類已發(fā)現(xiàn)11個ICE同源物，分2亞族：ICE亞族,參與炎癥反應；第五十三頁，共70頁。ced-3家族又可分為:執(zhí)行者(executioner)：caspase-3、6、7，可直接降解胞內結構蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通過自催化或自剪接方式激活；啟動者(initiator)：caspase-8、9，受到信號后，能以自剪接激活，引起caspase級聯(lián)反應，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7。第五十四頁，共70頁。ICE家族成員A：3類caspase：藍色參與炎癥反應，紅色為執(zhí)行者，綠色為啟動者；B：caspase-3的結構模型；C：caspase-3的活化過程第五十五頁，共70頁。細胞中還有caspase抑制因子，稱IAPs(inhibitorsofapoptosisproteins)，屬一個龐大的蛋白家族。能通過BIR結構域(baculovirusIAPrepeatsdomain)與caspase結合，抑制其活性。第五十六頁，共70頁。2．Apaf-1Apaf-1稱凋亡酶激活因子-1(apoptoticproteaseactivatingfactor-1)，線蟲同源物為ced-4，在線粒體參與的凋亡途徑中具重要作用。Apaf-1含3個結構域：①CARD:能召集caspase-9；②ced-4同源結構域，能結合ATP/dATP；③C端結構域，含色氨酸/天冬氨酸重復序列，細胞色素c結合到該域，引起Apaf-1多聚化而激活第五十七頁，共70頁。Apaf-1能激活Caspase-3，但需細胞色素c(Apaf-2)和caspase-9(Apaf-3)參與。Apaf-1/細胞色素c復合體與ATP/dATP結合后，Apaf-1就可通過其CARD結構域召集caspase-9，形成凋亡體(apoptosome)，激活caspase-3，啟動caspase級聯(lián)反應。第五十八頁，共70頁。3．Bcl-2家族Bcl-2為凋亡抑制基因，是膜整合蛋白，功能相當于線蟲的ced-9。已發(fā)現(xiàn)19個同源物，在線粒體參與的凋亡途徑中起調控作用，能控制線粒體中細胞色素c等凋亡因子的釋放。第五十九頁，共70頁。Bcl-2成員含1-4個Bcl-2同源結構域(BH1-4)，并常有一個羧端跨膜結構域。BH4是抗凋亡蛋白所特有的結構域，BH3是與促進凋亡有關的結構域。依功能和結構可將Bcl-2基因家族分2類，抗凋亡：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；是促進凋亡：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，第六十頁，共70頁。Bcl-2蛋白主要位于線粒體外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。大多數(shù)促凋亡蛋白位于胞質，一旦細胞受到凋亡因子誘導，即向線粒體轉位，通過寡聚化在線粒體外膜形成跨膜通道，或開啟線粒體的PT孔，使線粒體中凋亡因子釋放，激活caspase，導致細胞凋亡。第六十一頁，共70頁。

Bcl-2家族第六十二頁，共70頁。4．FasFas又稱APO-1/CD95，屬TNF受體家族。分布于胸腺細胞，激活T和B淋巴細胞、巨噬細胞、肝、脾、肺、心、腦、腸、睪丸和卵巢細胞等。Fas蛋白與Fas配體結合后，會激活caspase，使靶細胞凋亡。第六十三頁，共70頁。5．p53一種抑癌基因，功能是在G期監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細胞增殖，直到DNA修