第五章基因工程載體

第五章基因工程載體第1頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三載體類型

基因工程所用的載體都經(jīng)過人工重新構(gòu)建細菌質(zhì)粒載體噬菌體衍生載體Cosmid載體（粘粒）噬菌體M13衍生載體Phagemid載體酵母質(zhì)粒載體真核病毒載體2第2頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三克隆載體與表達載體克隆載體：攜帶外源DNA進入受體細胞并使外源DNA大量擴增。表達載體：表達外源基因編碼的蛋白質(zhì)，載體克隆位點的上游應(yīng)含有啟動子，下游含有轉(zhuǎn)錄終止序列。3第3頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié).質(zhì)粒Plasmid質(zhì)粒是存在于細菌細胞染色體外、能自主復(fù)制的小分子環(huán)狀雙鏈DNA分子。又稱為cccDNA（CovalentlyClosedCircularDNA）。4第4頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三野生型質(zhì)粒的大小一般在2-200Kb

基因工程常用質(zhì)粒在2-4Kb之間質(zhì)粒并不是細菌生長所必須的，但可為宿主執(zhí)行一定的遺傳功能，如抗生素的抗性、重金屬離子的抗性、細菌毒素的分泌等。5第5頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒

(plasmid)6第6頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三1.質(zhì)粒類型:

嚴緊型質(zhì)粒(stringentplasmid) 1-5個拷貝/細胞

松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid):

數(shù)十個/細胞 質(zhì)粒在細胞中的拷貝數(shù)有時與寄主的種類有關(guān)。7第7頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三2.質(zhì)粒載體必須具備的條件（1）分子量相對較小，能在細菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。（2）具有一個以上的遺傳標(biāo)志，便于對宿主細胞進行選擇，如抗生素的抗性基因，β-半乳糖苷酶基因（LacZ）等。8第8頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三（3）具有多個限制性內(nèi)切酶的單一切點，便于外源基因的插入。如果在這些位點有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。9第9頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒性質(zhì)不相容性（不親和性）具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同質(zhì)粒，不能穩(wěn)定的存在于同一受體細胞內(nèi)，這種現(xiàn)象稱作質(zhì)粒的不相容性。

10第10頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三3.質(zhì)粒載體的選擇性標(biāo)記抗菌素抗性新陳代謝特性11第11頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三

抗菌素名稱抗菌素作用方式宿主菌抗性機理氨芐青霉素（Amp）干擾細菌細胞壁合成

編碼-內(nèi)酰胺酶,切割A(yù)mp

-內(nèi)酰胺環(huán)氯霉素（Cml）抑菌劑,與50S結(jié)合,干擾編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶,使氯霉素蛋白質(zhì)合成乙?；Щ羁敲顾兀↘an）殺菌劑,與70S結(jié)合,mRNA編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,

發(fā)生錯讀修飾Kan失活鏈霉素（Sm）殺菌劑,與30S結(jié)合,mRNA編碼特異修飾酶

發(fā)生錯讀四環(huán)素（Tet）抑菌劑,與30S結(jié)合，阻止編碼特異蛋白,修飾細菌膜蛋白合成結(jié)構(gòu),阻止Tet通過細胞膜12第12頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三復(fù)制起點氨芐青霉素抗性基因13第13頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三常用的質(zhì)粒載體

1.

pBR322

2.ｐＢＶ220載體是我國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所自行構(gòu)建的大腸桿菌溫控表達載體。

3.

pUC系列:如pUC118、pUC119，兩者之間的差別在于多克隆位點不同。14第14頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三15第15頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三16第16頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三17第17頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三4.融合表達載體如GST融合表達系統(tǒng)。載體中含有細菌的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。當(dāng)基因表達時，表達產(chǎn)物為GST與目的蛋白的融合體。18第18頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三融合表達載體的優(yōu)點表達效率高融合蛋白易純化：抗GST的蛋白質(zhì)作為特異性抗體，用親和層析法從細胞裂解液中純化出融合蛋白；可從融合蛋白中分離出單一的外源蛋白質(zhì)GST與外源蛋白之間克隆上蛋白酶的切割位點，可用適當(dāng)?shù)拿盖懈睢?/p>

19第19頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三例如加裝一段編碼Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接頭片斷，該片斷可被具有蛋白酶活性的凝血因子Ⅹa切割，從Arg后切開。目的蛋白中出現(xiàn)此種序列的可能性極小，因此該方法用途廣泛。20第20頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三QIAexpress6His表達系統(tǒng)重組蛋白質(zhì)的末端帶有6個組氨酸殘基，對帶有Ni離子的層析介質(zhì)有高度的親和力，易于純化。6個組氨酸殘基質(zhì)量小，不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，無需切除。6個組氨酸殘基免疫原性差，重組蛋白可以直接用做抗原。21第21頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三

第二節(jié)噬菌體類

噬菌體是一類細菌病毒的總稱，英文名為Bacteriophage,簡稱phage。噬菌體可以在脫離寄主細胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但必須依賴寄主細胞才能復(fù)制生長。22第22頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三噬菌體（bacteriophage,phage）噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。病毒的特性：個體微小，可以通過細菌濾器沒有完整的細胞結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)和核酸組成專性細胞內(nèi)寄生的微生物可分為12個科23第23頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三噬菌體的生物學(xué)性狀24第24頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三噬菌體的生物學(xué)性狀形態(tài)個體小，需用電子顯微鏡觀察蝌蚪形、微球形和絲形Theblackbarsaresizebarsrepresenting100nm.25第25頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三26第26頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三27第27頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三

用作克隆載體的噬菌體有兩類：一類是λ噬菌體，另一類是M13噬菌體。野生型λ噬菌體經(jīng)過改造，已衍生出100多種克隆載體。λ噬菌體載體分為插入型和替換型(置換型)兩類。目前應(yīng)用較廣的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。

28第28頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三λ噬菌體（lambdaphage)

λ噬菌體是可以感染細菌的病毒，是大腸桿菌的溫和型噬菌體。由外殼蛋白與一個48.5kb的雙鏈線狀DNA分子組成。經(jīng)過改造形成的λ噬菌體載體有較高的轉(zhuǎn)化效率。29第29頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三

在λ噬菌體DNA分子雙鏈的5’端，各有一段由12個核苷酸組成的互補的單鏈凸出序列，即通常所說的黏性末端。在寄主細胞內(nèi)，會通過黏性末端的互補作用，形成環(huán)型雙鏈DNA分子。這種由黏性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點。（cos:cohensiveendsite)30第30頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三3‘CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT3’

在黏性末端的12個堿基中，有10個是GC。通過堿基配對線性分子環(huán)化起來，由此形成的雙鏈區(qū)，叫做cos位點。31第31頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三

λ噬菌體基因組含50余個基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因?qū)Ζ耸删w的生長不是必須的，可以被外源DNA片段取代。

λ噬菌體上有56種限制性內(nèi)切酶的識別位點，約300余切點。比如BamHI分別在第5505、22346、27972、34499和41732處有識別位點。

32第32頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三λ噬菌體的生長途徑

λ噬菌體有溶原和溶菌兩種生長途徑。溶原生長途徑是指λ噬菌體的DNA整合在宿主染色體上，隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制。以原噬菌體的形式潛伏起來。一旦宿主細胞處于某種條件下時，λ噬菌體的DNA脫離染色體，重新進入溶菌生長途徑。33第33頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三溶菌生長是指λ噬菌體在宿主細胞中黏性末端連接，成為環(huán)形DNA分子，借用宿主細胞的體系，合成病毒包裝所需的外殼蛋白，新復(fù)制的λDNA與外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。宿主細胞膜在R蛋白和S蛋白的作用下破裂，釋放出大量子代λ噬菌體顆粒，感染新的細胞。34第34頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)35第35頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三M13噬菌體單鏈DNA,基因組含6407個堿基.經(jīng)過基因改造后，形成M13mp系列?？扇菁{遠大于自身基因組的外源DNA,(7倍).M13噬菌體感染細胞后,不裂解宿主細胞,但妨礙宿主細胞的生長,因此可見培養(yǎng)平板上的混濁噬菌斑.36第36頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三噬斑37第37頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三單鏈的M13噬菌體（＋）進入受體菌后，以自身為模板，復(fù)制出互補鏈（－），成為雙鏈的結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制型DNA。復(fù)制型DNA在細胞內(nèi)可達200個拷貝。此時，（＋）鏈被特異的蛋白質(zhì)阻斷，不再生成新的（－）鏈。只能生成新的（＋）鏈。（＋）鏈DNA被殼蛋白包裝組成病毒顆粒，擠出宿主細胞。38第38頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三科斯質(zhì)粒載體（cosmid）

又稱粘粒載體，簡稱粘粒。環(huán)形雙鏈DNA分子，一般為4～6Kb。 該載體含有λDNA的cos序列（不少于280個bp）和pBR322質(zhì)粒的序列。該載體轉(zhuǎn)化效率高?？扇菁{高達45kb的外源DNA。以感染方式進入宿主細胞,在宿主體內(nèi)象質(zhì)粒那樣復(fù)制.39第39頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三粘粒載體可像質(zhì)粒一樣在細菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳動物中繁殖。又能像λDNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細胞。屬松弛型質(zhì)粒，拷貝數(shù)較多。40第40頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三41第41頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當(dāng)農(nóng)桿菌與植物接觸時，這種質(zhì)粒會引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤，故名Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）。Ti質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀DNA分子，200～250Kb之間。Ti質(zhì)粒進入植物細胞的只是一小部分，約25kb，稱為T-DNA（transferDNA）。42第42頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三T-DNA兩端各有一個25bp的正向重復(fù)序列，在不同的Ti質(zhì)粒中是高度保守的，該序列對于T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合是不可缺少的。利用大腸桿菌質(zhì)粒與T-DNA的部分序列重組，構(gòu)建Ti質(zhì)?？寺≥d體，可用于植物細胞的基因轉(zhuǎn)移。43第43頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三

第三節(jié)酵母細胞基因工程載體酵母是最簡單的單細胞真核生物。酵母可對表達的多肽鏈進行加工和修飾，如二硫鍵的正確形成、糖基化、除去N－端的甲硫氨酸等。44第44頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三酵母菌的克隆載體YIP酵母整合型質(zhì)粒YRP酵母復(fù)制型質(zhì)粒YEP酵母附加子型載體CIP酵母菌著絲粒型質(zhì)粒45第45頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三上述質(zhì)粒均可在大腸桿菌和酵母菌中穩(wěn)定存在，即所謂的穿梭質(zhì)粒。這些質(zhì)粒含有兩種可供篩選的選擇性標(biāo)記。46第46頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三YIp載體URA3乳清苷酸脫羧酶47第47頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三

酵母菌表達載體

1.選擇性標(biāo)志

當(dāng)使用大腸桿菌做為宿主細胞時，多使用抗生素抗性作為篩選標(biāo)志。由于酵母菌對許多抗生素不敏感，故需要其他的篩選標(biāo)志。

野生型基因：URA3（尿嘧啶）、LEU2、HIS3、TRP1（色氨酸）

這些基因可補償酵母菌細胞中某一種特定的代謝缺陷（營養(yǎng)缺陷）

48第48頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三2.啟動子含有可被RNA聚合酶II識別的酵母啟動子

GAL、GAL10（半乳糖激酶）

PHO5（堿性磷酸酶）

ADH（醇脫氫酶）

TP1（丙糖磷酸異構(gòu)酶）

PGK（磷酸甘油酸激酶）

GAP（磷酸甘油醛脫氫酶）

SUC（蔗糖酶）49第49頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三注釋：細胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)豐度較高，如PGK（磷酸甘油酸激酶）、GAP（磷酸甘油醛脫氫酶），各占細胞總蛋白的5%，屬于高含量的蛋白質(zhì)，它們的啟動子為強啟動子。50第50頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三酵母分泌型表達載體這類載體可以使目的蛋白分泌到細胞外。載體內(nèi)除含有一般表達質(zhì)粒的必要成分外，還需有一個控制蛋白質(zhì)分泌的信號序列。其編碼的多肽鏈叫做信號肽。信號肽內(nèi)多含疏水性氨基酸。51第51頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)哺乳動物細胞表達載體52第52頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三病毒侵入動物細胞后，有兩種生長狀態(tài)

①溶細胞感染病毒在宿主細胞內(nèi)合成自身的核酸和結(jié)構(gòu)蛋白，裝配成完整的子代病毒顆粒，釋放到細胞外，擴大感染，宿主細胞因為代謝障礙而死亡。②整合性感染病毒核酸整合到宿主細胞的染色體中，隨細胞DNA的復(fù)制而擴增。53第53頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三病毒載體：（1）含有能夠被真核細胞識別的有效啟動子（2）在感染周期中能夠持續(xù)復(fù)制，達到很高的拷貝數(shù)。（3）控制自己復(fù)制的元件（4）有些載體可高效穩(wěn)定地整合到寄主基 因組上（5）外殼蛋白識別細胞受體，可將外源基 因高效導(dǎo)入受體細胞。54第54頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三1.SV40病毒載體SV40：猿猴空泡病毒（Simianvacuolating virus40)

環(huán)型雙鏈DNA分子，含5243bp。優(yōu)點：1.感染率高；2.拷貝數(shù)高；3.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 高；缺點：1.宿主范圍窄；2.最終導(dǎo)致感染細胞死 亡； 3.制備耗時，成本較高。55第55頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三SV40病毒載體的改建病毒的部分序列＋質(zhì)粒的部分序列如PSV2包括病毒的復(fù)制起始區(qū)、早期啟動子、 增強子序列、部分t抗原基因

pBR322的復(fù)制起始區(qū)、氨芐青霉素 抗性基因56第56頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三

病毒-質(zhì)粒載體病毒的早期區(qū)段和復(fù)制起點+大腸桿菌的質(zhì)粒分子重組而成。例如：pC10＝早期區(qū)段和復(fù)制起點（多瘤病毒）＋質(zhì)粒pBR322的部分區(qū)段這種載體既可在大腸桿菌中復(fù)制，也可在哺乳動物細胞中復(fù)制，稱之為穿梭載體。57第57頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三改造后的病毒優(yōu)缺點

優(yōu)點：1.不需病毒顆粒的包裝過程，故可插入較大長度的DNA片段。2.不引起宿主細胞的裂解，可建立穩(wěn)定傳代的細胞株。3.整合到宿主細胞的染色體中，重組基因不會丟失。缺點：轉(zhuǎn)染效率低于萬分之一。58第58頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三受納細胞：SV40感染CV-1或AGMK猿猴細胞后，產(chǎn)生感染性病毒顆粒，并使宿主細胞裂解，這種感染稱為裂解感染，而猿猴細胞則稱為受納細胞。59第59頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三非受納細胞：SV40感染倉鼠細胞后，不產(chǎn)生感染顆粒，病毒基因組整合到宿主細胞染色體上，細胞被轉(zhuǎn)化（癌變），這種嚙齒類動物細胞為SV40病毒的非受納細胞。60第60頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類單鏈RNA病毒。宿主范圍廣，感染動物或人的細胞。感染效率高，理論上可達100％。具有強啟動子。不引起宿主細胞的死亡，可以維持許多代存在問題：1.容量小，低于10kb。

2.可能引起細胞癌變。61第61頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三腺病毒載體（AV）

線性雙鏈DNA病毒，經(jīng)過改造的腺病毒載體，缺失了大部分的病毒基因，更加安全。

62第62頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)點：①基因組大，可插入大片段的外源基因，最多可達35kb；②可高效的感染不同類型的人體組織細胞；③進入細胞內(nèi)不整合進宿主的基因組，僅瞬間表達。缺點①免疫原性強，可刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；

②幾乎可感染所有的細胞，缺乏特異性。63第63頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三腺相關(guān)病毒載體（AAV）：屬于非致病的微小病毒科家族的成員，只有依賴于輔助病毒才能繁殖。特點：基因組小，只有幾個kb；無致病性；免疫原性弱；裝載外源基因容量小，不超過5kb；制備過程復(fù)雜；64第64頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三痘苗病毒載體：痘苗病毒是動物病毒中最大的一種，與天花病毒有密切的親緣關(guān)系。長期被用作預(yù)防天花的疫苗。病毒基因組中有很大的非必需區(qū)（28kb），可以切除，代之以較大的外源基因，或者同時插入幾個外源基因，構(gòu)成多價疫苗。65第65頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三哺乳動物細胞基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶：G418二氫葉酸還原酶（DHFR）MTX（氨甲喋呤）胸苷激酶（TK）：APT（氨基喋呤）潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH）：潮霉素-B黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）： 霉酚酸腺嘌呤核糖脫氨酶（ADA）：66第66頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三嘌呤和嘧啶合成知識的回顧哺乳動物細胞內(nèi)的兩條合成途徑

1從頭合成：利用各種小分子，如氨基酸、CO2、NH3、磷酸核糖等，合成嘌呤或嘧啶環(huán)，進而合成核苷酸。

2補救合成途徑：利用細胞內(nèi)原有的或從胞外吸收的堿基、核苷、核苷酸。 67第67頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三1.從頭合成途徑：利用小分子合成核苷酸，包括胸苷酸2.補救合成途徑：利用細胞內(nèi)現(xiàn)有的堿基、磷酸合成核苷酸