食品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)

食品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)第1頁/共27頁食品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)一、概況副溶血性弧菌（V。parahemolyticus）于1950年從日本一次暴發(fā)性食物中毒中分離發(fā)現(xiàn)。該菌存在于近海的海水、海底沉積物和魚類、貝殼等海產(chǎn)品中。根據(jù)菌體O抗原不同，現(xiàn)已有13個(gè)血清群。主要引起食物中毒，尤以日本、東南亞、美國及我國臺(tái)北地區(qū)多見，也是我國大陸沿海地區(qū)食物中毒中最常見的一種病原菌。

第2頁/共27頁食品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)一、概況本菌廣泛存在于海水中，偶亦見淡水。在海水中能存活47日以上，淡水中生存1～2日。在37℃、pH7.7、含氯化鈉3～4%的環(huán)境中生長最好。本菌嗜鹽畏酸，在無鹽培養(yǎng)基上，不能生長，3%-6%食鹽水繁殖迅速，每8～9分鐘為1周期，低于0.5%或高于8%鹽水中停止生長。對(duì)酸敏感，在2%醋酸中或50%的食醋中1分鐘即可死亡。不耐熱，56℃、5分鐘即可殺死，90℃、1分鐘滅活。對(duì)低溫及高濃度氯代鈉抵抗力甚強(qiáng)。第3頁/共27頁一、概況目前已發(fā)現(xiàn)本菌有12種菌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型。從患者糞便分離出菌株屬于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，自致病食物分離的菌株90%以上屬于Ⅳ、Ⅴ型。致病性菌株能溶解人及家兔紅細(xì)胞，稱為“神奈川”試驗(yàn)（kanagawatest）陽性。其致病力與其溶血能力平行，這是由一種不耐熱的溶血素（分子量42000）所致。本菌能否產(chǎn)生腸毒素尚待證明。食品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)第4頁/共27頁食品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)一、概況媒介食品副溶廣泛存在于海岸和海水中，海生動(dòng)植物常會(huì)受到污染而帶菌。海魚、蝦、蟹、蛤等海產(chǎn)品帶菌率極高；被海水污染的食物、某些地區(qū)的淡水產(chǎn)品如鯽魚、鯉魚等及被污染其他含鹽量較高的食物如咸菜、咸肉、咸蛋亦可帶菌，也可因受到污染而引起中毒。帶用少量該菌的食物，在適宜的溫度下，經(jīng)3～4小時(shí)細(xì)菌可急劇增加至中毒數(shù)量。進(jìn)食肉類或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污染所引起。第5頁/共27頁媒介食品第6頁/共27頁食品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)一、概況臨床表現(xiàn)潛伏期多為10小時(shí)左右，一般8-40小時(shí)，主要癥狀有惡心、嘔吐、上腹部陣發(fā)性劇烈腹痛、頻繁腹瀉、洗肉水樣或帶粘液便，無里急后重，每日5-6次，體溫39℃。重癥病人可有脫水、血壓下降、意識(shí)不清等。病程2-4天，一般預(yù)后良好，無后遺癥，少數(shù)病人因休克、昏迷而死亡.第7頁/共27頁二、生物學(xué)特性（一）形態(tài)與染色

1、革蘭氏陰性無芽胞多形態(tài)桿菌，單端鞭毛、兩端濃染。桿狀、棒狀、甚至球狀、絲狀等第8頁/共27頁第9頁/共27頁（二）培養(yǎng)特性1、需氧或兼性厭氧：生長最好2、在2-３%NaCL培養(yǎng)基中生長最好，無鹽或食鹽>10%不能生長。3、最適溫度36℃，PH7.5—7.8（7.7）4、在專用選擇性平板上，菌落呈圓形凸起，混濁不透明，表面光滑，較濕潤，邊緣不整齊。5、血平板：可見溶血環(huán)。第10頁/共27頁（三）生化特性

1、分解GLU(血葡萄糖）產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖，蔗糖。

2、H2S（－）、V-P（－）、靛基質(zhì)（－）、精氨酸（－）

3、甲基紅（＋）、賴氨酸（＋）、溶血＋/-第11頁/共27頁V—P試驗(yàn)陰性陽性第12頁/共27頁靛基質(zhì)試驗(yàn)

陰性陽性第13頁/共27頁甲基紅試驗(yàn)陽性陰性第14頁/共27頁（四）抗原結(jié)構(gòu)O抗原O1—O1313個(gè)群。H抗原：K抗原：K1—K7065個(gè)型缺：K2K14K17K35K62第15頁/共27頁三、檢驗(yàn)操作要點(diǎn)

采樣→樣品處理→增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)→3.5%氯化鈉三糖鐵培養(yǎng)基→嗜鹽性試驗(yàn)→生化鑒定→動(dòng)物試驗(yàn)→結(jié)果報(bào)告第16頁/共27頁1、采樣：患者糞便、嘔吐物、可凝食品。從海產(chǎn)品的體表面、腸內(nèi)容物、鰓等取樣必要時(shí)包裝物，炊具用具。取樣后盡快送檢，不宜低溫保存以免死亡。2、增菌培養(yǎng)：Nacl結(jié)晶紫增菌液,37℃8-16小時(shí)。第17頁/共27頁3、分離培養(yǎng)：

Nacl蔗糖平板：圓形，半透明或不透明，無粘性，(綠)蘭色，直徑2—4mm

嗜鹽選擇性平板：直徑2.5mm，圓整或不齊，隆起混濁，無粘性，無色，濕潤。4、選擇性培養(yǎng)取上述可疑菌落接種于3.5%Nacl-TSI培養(yǎng)37℃24小時(shí)5、鏡檢：取上述可疑菌落鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陰性，無芽胞多形態(tài)，兩端濃染。第18頁/共27頁副溶血弧菌在蔗糖瓊脂（tcbs）平板上的菌落副溶血性弧菌在海博弧菌顯色培養(yǎng)基上典型特征。典型副溶血性弧菌顯藍(lán)色至藍(lán)綠色，霍亂弧菌和其它弧菌顯無色。第19頁/共27頁

6、嗜鹽性試驗(yàn)

將可疑培養(yǎng)物接種于不同鹽濃度的鹽胨水中，37℃24小時(shí)，觀查生長情況。鹽含量0、3、7、9、11%，在3-7%生長良好。０３７９11第20頁/共27頁7、生化試驗(yàn)分別接種各類生化培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)。除V-P、靛基質(zhì)、甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)48小時(shí)后加試劑觀察外，其他均可在24小時(shí)觀察。試驗(yàn)結(jié)果判定參照下表。第21頁/共27頁7、生化試驗(yàn)

副溶血性弧菌的生化性狀表生化特性生化性狀生化特性生化性狀葡萄糖產(chǎn)酸＋V-P－葡萄糖產(chǎn)氣－靛基質(zhì)＋蔗糖－賴氨酸＋乳糖－鳥氨酸±甘露醇＋精氨酸－硫化氫－溶血±甲基紅＋第22頁/共27頁8、動(dòng)物試驗(yàn)凡符合副溶血弧菌生化反應(yīng)的菌株，一般都有毒力，因此都應(yīng)做動(dòng)物試驗(yàn)，常用的試驗(yàn)方法有：小白鼠毒力試驗(yàn)：將上述各類反應(yīng)的副溶血弧菌接種到3.5%氯化鈉胨水中，置37℃培養(yǎng)16-18小時(shí)待用。用3.5%氯化鈉胨水培養(yǎng)物0.3ml注射到體重13-15g小白鼠的腹腔內(nèi)。觀察2-3d，常見有豎毛，不活潑，食欲不振，腹部貼在飼養(yǎng)缸底，呼吸困難，不幸蹣跚，有時(shí)發(fā)生痙攣性跳動(dòng)，四肢抽搐及尾部痙攣性震動(dòng)，大多在24-48小時(shí)內(nèi)死亡。將小白鼠進(jìn)行解剖檢查和分離培養(yǎng)。第23頁/共27頁8、動(dòng)物試驗(yàn)De試驗(yàn)將家兔的腹壁手術(shù)切開，露出小腸，選取約5cm的一段，將兩頭用手術(shù)線結(jié)扎，注入3.5%氯化鈉胨水培養(yǎng)物，并另選兩段作陽性和陰性對(duì)照，如分離段膨脹隆起，小腸水腫充血說明該菌有致病性。第24頁/共27頁9、結(jié)果報(bào)告樣品經(jīng)過增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)后，根據(jù)形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果判斷是否發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌并報(bào)告制。第25頁