第二章熒光和化學(xué)發(fā)光分析法

第二章熒光和化學(xué)發(fā)光分析法第1頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*第2頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*Stokes用分光計(jì)觀察到：熒光的波長(zhǎng)比入射光的波長(zhǎng)稍微長(zhǎng)些五顏六色雨后路面上水珠油膜呈現(xiàn)第3頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*

基態(tài)分子吸收能量(電能、熱能、化學(xué)能或光能等)，電子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，以發(fā)射電磁輻射(即光)的形式釋放能量。

分子發(fā)光：分子+電能化學(xué)能光能生物活性參與化學(xué)發(fā)光

電致發(fā)光化學(xué)發(fā)光光致發(fā)光生物發(fā)光熒光磷光第4頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*分子發(fā)光：光致發(fā)光：光第5頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2.1熒光分析法2.1.1熒光分析法基本概念2.1.2熒光強(qiáng)度及影響因素2.1.3儀器裝置2.1.4定量分析方法2.1.5熒光分析測(cè)定方法、特點(diǎn)和應(yīng)用第6頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*A分子的激發(fā)態(tài)————分子激發(fā)態(tài)和三線激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)：基態(tài)分子吸收能量后，價(jià)層電子躍遷到高能級(jí)的分子軌道上稱為電子激發(fā)態(tài)

。是分子的亞穩(wěn)定狀態(tài)?；鶓B(tài)：

在正常狀態(tài)下，分子處于最低能級(jí)的分子軌道上稱為基態(tài)。是分子的穩(wěn)定狀態(tài)。2.1.1熒光分析法基本概念2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第7頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*

電子自旋多重度

電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，分子中的電子可以處在不同的自旋狀態(tài),常用電子自旋多重度來(lái)描述。M=2S+1S是電子的總自旋量子數(shù)，各電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和。2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第8頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*

單重態(tài)（M=1）：電子自旋都配對(duì)的分子的電子態(tài)稱為單重態(tài)，用“S”表示。

三重態(tài)（M=3）：分子中的電子對(duì)的電子自旋平行的電子態(tài)稱為三重態(tài)，用“T”表示。S2>T2>S1>T1>S0

(洪特規(guī)則)

M=2S+1M自旋多重度S總自旋量子數(shù)2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第9頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2023/5/3S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫分子熒光和磷光發(fā)射過(guò)程第10頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和非輻射躍遷(熱)等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換系間跨越振動(dòng)弛豫非輻射躍遷延遲熒光外轉(zhuǎn)換返回速度快的途徑，發(fā)生幾率大!B分子去激發(fā)過(guò)程及熒光的產(chǎn)生2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第11頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*e（1）.

振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)時(shí)間10-11~10-13s。1、非輻射躍遷2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第12頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*e（2）.

內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重度的電子能級(jí)中,

相等能級(jí)間的非輻射能級(jí)交換。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時(shí)間10-12s。2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第13頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*e（3）.系間跨越：不同多重態(tài)在有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。電子自旋改變，躍遷禁阻，通過(guò)自旋-軌道耦合等躍遷。2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第14頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*（4）.外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而損失能量回到基態(tài)的非輻射躍遷。

外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第15頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*（1）.

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，發(fā)射時(shí)間約為10-7～10-9s。

發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)。

e2、輻射躍遷2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第16頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*（2）.

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)。發(fā)光時(shí)間：10-4～10s。eS0

→激發(fā)態(tài)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)換→系間跨越→振動(dòng)弛豫→

T1

→S0

2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第17頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*1、熒光激發(fā)光譜

固定熒光測(cè)量波長(zhǎng)，改變激發(fā)光的波長(zhǎng)，測(cè)量不同波長(zhǎng)λex激發(fā)光照射下熒光強(qiáng)度的變化，記錄熒光強(qiáng)度F與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。2.1.1.2熒光激發(fā)光譜曲線和發(fā)射光譜曲線第18頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2、熒光發(fā)射光譜

固定激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度，記錄在不同波長(zhǎng)λem下所發(fā)射的熒光強(qiáng)度所得關(guān)系曲線即不同波長(zhǎng)下熒光強(qiáng)度的分布。發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。2.1.1.2熒光激發(fā)光譜曲線和發(fā)射光譜曲線第19頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*

熒光發(fā)射光譜與吸收光譜成鏡像關(guān)系

2.1.1.2熒光激發(fā)光譜曲線和發(fā)射光譜曲線

吸收光譜的形狀表明了分子第一激發(fā)單重態(tài)的振動(dòng)能級(jí)；發(fā)射光譜表明分子基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)。

基態(tài)與激發(fā)態(tài)兩者的振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)相似，激發(fā)與去激發(fā)組成相反的兩個(gè)過(guò)程。S03210S13210第20頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*

分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件1.

具有合適的結(jié)構(gòu)：通常是含有苯環(huán)和稠環(huán)的剛性結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子；2.

具有一定的熒光量子產(chǎn)率。2.1.1.3熒光效率第21頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*Φ=發(fā)射熒光的分子數(shù)激發(fā)分子總數(shù)2.1.1.3熒光效率熒光量子產(chǎn)率（Φ）：

衡量熒光物質(zhì)發(fā)光能力。它表示激發(fā)分子發(fā)射出熒光(或磷光)

的比例。第22頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)，可用各過(guò)程的速率常數(shù)來(lái)表示熒光量子產(chǎn)率：熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)，取決于分子結(jié)構(gòu)。各種非輻射躍遷過(guò)程的速率常數(shù)之和。取決于分子所處的化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。2.1.1.3熒光效率第23頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*

熒光分子與其他分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低甚至熒光消失的現(xiàn)象為熒光猝滅，又稱熒光熄滅。（1）、碰撞猝滅---動(dòng)態(tài)猝滅

M*+Q→M+Q+熱量激發(fā)態(tài)分子猝滅劑2.1.1.4猝滅第24頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*（2）、生成化合物的猝滅---靜態(tài)猝滅

M+Q→MQ

基態(tài)的熒光物質(zhì)與猝滅劑反應(yīng)生成非熒光的化合物，導(dǎo)致熒光的猝滅。2.1.1.4猝滅（3）、能量轉(zhuǎn)移

M*+Q→M+

Q*

激發(fā)態(tài)的分子與猝滅劑作用，能量發(fā)生轉(zhuǎn)移，猝滅劑被激發(fā)。第25頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*（5）、自猝滅

熒光物質(zhì)的濃度較大時(shí)，激發(fā)態(tài)分子之間碰撞較多，在碰撞中引起能量損失，產(chǎn)生自熄，使熒光強(qiáng)度減小。2.1.1.4猝滅（4）、氧的猝滅

氧對(duì)溶液熒光產(chǎn)生猝滅作用的原因比較復(fù)雜，可能包含著多種機(jī)理。

第26頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2.1.2熒光強(qiáng)度及影響因素2.1.2.1熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系2.1.2.2有機(jī)物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系2.1.2.3金屬離子螯合物的熒光2.1.2.4實(shí)驗(yàn)條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響第27頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*Epsilon（大寫(xiě)Ε，小寫(xiě)ε），是第五個(gè)希臘字母。漢字讀音：艾普西龍朗伯-比爾定律P15第28頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*A躍遷的類型

n→π*εmax＜100平均壽命10-5~10-7s；π→π*εmax≥104

平均壽命10-7~10-8sπ*→π是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型，具有π*→π共軛雙鍵的分子才能發(fā)射較強(qiáng)的熒光。2.1.2.2有機(jī)物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光的產(chǎn)生是分子先經(jīng)歷π→π*或n→π*激發(fā)，然后經(jīng)振動(dòng)弛豫或其他非輻射躍遷再發(fā)生π*→π或π*→n而得到熒光。第29頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*B共軛效應(yīng)

產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，熒光量子產(chǎn)率越高，向長(zhǎng)波方向移動(dòng)?；衔锪孔赢a(chǎn)率φF

λex（nm）λem（nm）苯萘蒽丁省2052863653902.1.2.2有機(jī)物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系0.110.280.360.52278321404480第30頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*C分子共平面效應(yīng)芴Φ

=1聯(lián)苯Φ

=0.2熒光分子的共平面性增加，則共軛體系大，有利于π→π*

躍遷。2.1.2.2有機(jī)物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系第31頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*熒光黃Φ

=0.92酚酞Φ

=02.1.2.2有機(jī)物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系第32頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*D取代基效應(yīng)1.

給電子取代基加強(qiáng)熒光-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN產(chǎn)生p→π共軛2.

吸電子取代基減弱熒光-C=O，-COOH，-NO2摩爾吸光系數(shù)小，熒光發(fā)射弱，系間跨躍較大，同樣使熒光減弱。

2.1.2.2有機(jī)物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系第33頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*D取代基效應(yīng)2.1.2.2有機(jī)物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系A(chǔ)躍遷的類型B共軛效應(yīng)C分子共平面效應(yīng)第34頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2.1.2.3金屬離子螯合物的熒光（2）螯合物中金屬離子的發(fā)光（1）螯合物中配位體的發(fā)光第35頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2.1.2.3金屬離子螯合物的熒光（1）螯合物中配位體的發(fā)光

不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)，平面結(jié)構(gòu)的增大，常會(huì)發(fā)生熒光。如8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬螯合物具有很強(qiáng)的熒光。第36頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2.1.2.3金屬離子螯合物的熒光

這類發(fā)光過(guò)程通常是螯合物首先通過(guò)配位體的躍遷激發(fā)，接著配位體把能量轉(zhuǎn)給金屬離子，導(dǎo)致dd

躍遷和ff躍遷，最終發(fā)射的是dd躍遷和ff躍遷光譜。（2）螯合物中金屬離子的發(fā)光第37頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2、溶劑3、溶液黏度和溫度

4、溶液的PH值2.1.2.4實(shí)驗(yàn)條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響1、激發(fā)光源第38頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2.1.2.4實(shí)驗(yàn)條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響1、激發(fā)光源激發(fā)光強(qiáng)度I0大，熒光強(qiáng)度增大，靈敏度增高。2、溶劑

主要表現(xiàn)為溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成對(duì)化合物的熒光發(fā)生變化。

*→躍遷類型：溶劑極性增大，躍遷能量降低，發(fā)生紅移，熒光增強(qiáng)。氫鍵、配位鍵的形成主要影響熒光分子的存在型體、電離狀態(tài)，熒光強(qiáng)度和形狀均發(fā)生很大變化。第39頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*3、溶液黏度和溫度

黏度大，溫度低，可減小碰撞引起的熒光熄滅，熒光強(qiáng)度增大。溫度升高，外轉(zhuǎn)換的幾率增加，熒光強(qiáng)度降低。4、溶液的PH值不同PH值下，熒光分子存在形式不同。2.1.2.4實(shí)驗(yàn)條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響第40頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2.1.3儀器裝置CaryEclipse熒光分光光度計(jì)熒光、磷光化學(xué)/生物發(fā)光美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司第41頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*一、熒光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)流程

2.1.3儀器裝置光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器、檢測(cè)器、顯示系統(tǒng)。特殊點(diǎn)：兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。第42頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*1、激發(fā)光源

汞燈、碘鎢燈、氙弧燈、激光等。2、樣品池

I0ItIf樣品池四面透光。2.1.3儀器裝置第43頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*4、檢測(cè)器

一般采用硒光電池。檢測(cè)器的方向與激發(fā)光的方向成直角，以消除樣品池中透射光和雜散光的干擾。

3、單色器

激發(fā)單色器：選擇激發(fā)光波長(zhǎng)，用以分離出所需用的激發(fā)光。發(fā)射單色器：選擇熒光發(fā)射波長(zhǎng)，用以濾去雜散光、瑞利光、拉曼光和雜質(zhì)所發(fā)射的熒光。

2.1.3儀器裝置第44頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*二、磷光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)流程

光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器斬波器（磷光鏡）利用熒光和磷光發(fā)射壽命的差別通常情況下，樣品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶?jī)?nèi)，來(lái)測(cè)定低溫磷光。第45頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2、定量方法

1、定量依據(jù)

2.1.4定量分析方法第46頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*1、定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度

If

正比于吸收的光強(qiáng)度

Ia和熒光量子產(chǎn)率Φ：由朗伯-比耳定律得：熒光強(qiáng)度If：2.1.4定量分析方法第47頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*對(duì)于稀溶液，當(dāng)2.303bC<0.05時(shí)：

If

----熒光強(qiáng)度I0

----入射光強(qiáng)度Φf----熒光量子產(chǎn)率b--吸收光程--摩爾吸光系數(shù)C--物質(zhì)濃度2.1.4定量分析方法第48頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2、定量方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法：FCsFxCx2.1.4定量分析方法第49頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*A無(wú)機(jī)化合物的熒光分析如Mg、Al、Ca等，本身不發(fā)射熒光，但與有機(jī)試劑可形成熒光配合物進(jìn)行定量測(cè)定；

直接法：如8-羥基喹啉與Al離子反應(yīng)生成熒光配合物

安息香，水楊醛縮鄰氨基苯酚，黃酮醇，二苯乙醇酮

2.1.5熒光分析測(cè)定方法、特點(diǎn)和應(yīng)用第50頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*熒光熄滅法第51頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*B有機(jī)化合物的熒光分析本身發(fā)射熒光的，如羅丹明B、熒光素等可直接測(cè)定；不發(fā)射熒光的物質(zhì)可經(jīng)過(guò)處理后成為發(fā)射熒光的物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定；第52頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*C：蛋白質(zhì)的熒光分析蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，有的氨基酸自身可以發(fā)熒光，例如：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸第53頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*2.熒光胺和氨基反應(yīng)生成具有熒光的產(chǎn)物3.鄰苯二甲醛（OPA）在一定的條件下可與伯胺、多胺生成具有熒光的產(chǎn)物第54頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期三*D核酸檢測(cè)生命物質(zhì)常