微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用了解有關(guān)微生物及培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進行無菌技術(shù)的操作，進行微生物的培養(yǎng)。

一、課題目標(biāo)：掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點和難點：三、技能目標(biāo)：微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動物特點：結(jié)構(gòu)簡單,形體微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識：

(一)微生物細(xì)菌的外形與大小細(xì)菌：單細(xì)胞不分枝的原核微生物。細(xì)菌細(xì)胞微小而透明，通常用適當(dāng)染料染色后顯微鏡觀察圖1-1常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌細(xì)菌細(xì)胞由外向里依次有鞭毛、菌（纖）毛、莢膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中又有液泡、儲存性顆粒、核質(zhì)等。細(xì)菌的構(gòu)造圖1-3細(xì)菌的結(jié)構(gòu)*細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特點：堅韌且有彈性細(xì)胞壁有哪些功能？①固定細(xì)胞外形；

②保護細(xì)胞免受外力的損傷；

③阻攔大分子物質(zhì)進人細(xì)胞；

④使細(xì)胞具有致病性及對噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細(xì)胞壁中含毒素芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌.菌落：單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異細(xì)菌的營養(yǎng)類型根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同，將細(xì)菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:分類,舉例?異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌光合自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)菌,硫細(xì)菌放線菌1、結(jié)構(gòu)：單細(xì)胞原核分支狀的菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲）鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素

微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產(chǎn)生的

應(yīng)用:病毒的結(jié)構(gòu)2、病毒的增殖：真菌一、基礎(chǔ)知識：（二）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種保存及分離、鑒定菌落、活菌計數(shù)等，半固體培養(yǎng)基可觀察微生物的運動，液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:分離固氮菌

不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:分離自養(yǎng)型微生物

加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基:分離雜交瘤細(xì)胞天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限;成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;

根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。合成培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基：血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。液體培類養(yǎng)基：表面生長均勻混濁熱生長沉淀生裳長固體培養(yǎng)洗基：菌落鞭，菌苔半固體培仇養(yǎng)基：無動力蛙有慘動力(彌麥散)(是否迎運動)2.不同懶的微生物譯往往需要卵采用不同板的培養(yǎng)基傳配方(參考癥教材附效錄內(nèi)容念)3.不管閱哪種培養(yǎng)悲基，一般轎都含有水、碳源、和氮源、無機鹽、等營養(yǎng)物形質(zhì)，另外還需胸要滿足微享生物生長持對pH、特殊營表養(yǎng)物質(zhì)魔,例如浸:生長因仿子(即細(xì)菌生飲長必需，呆而自身不慌能合成的遞化合物,趕如維生素龜、某些氨嫁基酸、嘌把呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化槐碳、滲透壓等的要求現(xiàn)。4.培得養(yǎng)基的總用途液體培養(yǎng)詢基：增菌固體培織養(yǎng)基：倍純化，馬增菌半固體培控養(yǎng)基：動樸力檢測，燒保種二、無顛菌技術(shù)1.無菌含技術(shù)的概察念無菌操汗作泛指在培養(yǎng)微微生物的操攪作中，所推有防止雜級菌污染的殃方法。無論是淺隨后將逼要學(xué)到冠的倒平板、平板劃線操作，還啄是平板稀釋瞞涂布法，其操貌作中的付每一步含都需要番做到“俗無菌”面，即防禁止雜菌謝污染。伯只有熟動練、規(guī)吃范地進鎮(zhèn)行無菌枯操作，農(nóng)才可能推成功地不培養(yǎng)微倡生物。（１）消毒定義維：利用化學(xué)煉或物理方尼法，殺死止大部份致秘病微生物泥的過程。遠(yuǎn)區(qū)分為高程度消腿毒（Hig蘋h-le臥vel物Disi兵nfec世tion艱）、中程度消坐毒（Int配erme粥diat物e-le怒vel欄Disi矮nfec賤tion志）、低程度提消毒（Lo感w-l懷eve筐lD苗isi錫nfe第cti休on）雖三種方框式。2.消誼毒與滅清菌的概辨念及兩堵者的區(qū)假別（2）渾滅菌的拾定義：以化學(xué)劑劃或物理方商法消滅所有微生物傻，包括切所有細(xì)艷菌的繁糞殖體、圍芽孢、嗽霉菌及炎病毒，肯而達到完全無菌之過程陵。捎滅征菌消毒播技術(shù)是饒微生物去有關(guān)工雪作中最洪普通也固是最重賀要的技乖術(shù)。1、煮沸消耀毒法:100℃息煮沸5-球6min2、巴例氏消毒齒法：7奶0-7垂5℃追下煮3旅0mi盟n或謀80摔℃下極煮15蹄min3、化來學(xué)藥劑影消毒法宰:用7智5%酒節(jié)精、新棟潔爾滅帝等進行市皮膚消鵲毒;氯帶氣消毒布水源4、紫外雙線消毒……(1)消餐毒的方法扣：3.常用富的消毒與吼滅菌的方車法1、灼燒鎖滅菌2、干熱樹滅菌：1群60-1僵70℃農(nóng)下加熱1賄-2h。3、高占壓蒸氣門滅菌：濱100瞇kPa遵、12彼1℃蓮下維持臥15-狐30m墾in.(2)滅遷菌的方法券：最常用的加滅菌方法躲是高壓蒸蜓汽滅菌，它可慮以殺滅頂所有的糊生物，虎包括最殃耐熱的逃某些微壯生物的湖休眠體寫，同時潑可以基報本保持齊培養(yǎng)基頓的營養(yǎng)膚成分不厚被破壞澇。有些玻璃竿器皿也可街采用高溫干策熱滅菌。為了果防止雜揭菌，特較別是空己氣中的案雜菌污股染，試納管及玻嘉璃燒瓶洋都需采方用適宜始的塞子培塞口，蠶通常采膚用棉花哈塞，也腸可采用俱各種金狐屬、塑雹料及硅光膠帽，紫它們只泥可讓空挽氣通過漿，而空凱氣中的話其他微金生物不慎能通過暖。而平皿是番由正反兩研平面板互抓扣而成，確這種器具嚇是專為防或止空氣中追微生物的紡污染而設(shè)呼計的。分類定義方法滅菌法殺滅一切微生物物理法：熱力、輻射、微波、等離子體化學(xué)法：醛類、烷化劑高效消毒法殺滅一切致病微生物紫外線、含氯劑、臭氧、復(fù)配劑等中效消毒法殺滅除芽孢外的致病微生物超聲波、碘類、醇類、酚類低效消毒法殺滅細(xì)菌繁殖體、親脂病毒單鏈季胺鹽、雙胍類、中草藥、金屬離子無菌技洪術(shù)3.微尾生物實紀(jì)驗室培毅養(yǎng)的基曲本操作潑程序1、器狀具的滅在菌2、培霧養(yǎng)基的車配制3、培養(yǎng)撒基的滅菌4、倒平謀板5、微需生物接俗種6、恒溫幟箱中培養(yǎng)7、菌挪種的保努存1.無菌望技術(shù)除了叮用來防止肉實驗室的時培養(yǎng)物被判其他外來灑微生物污瓣染外，還網(wǎng)有什么目脖的？2.請讓你判斷挺以下材扎料或用氏具是否潑需要消匯毒或滅歡菌。如貿(mào)果需要怪，請選召擇合適猛的方法辜。（1）鑼培養(yǎng)跟細(xì)菌用朱的培養(yǎng)孝基與培稿養(yǎng)皿（2）點玻棒報、試管最、燒瓶狠和吸管（3）仿實驗鑼操作者控的雙手答：無菌降技術(shù)還能齡有效避免穩(wěn)操作者自還身被微生榜物感染。答：（1亭）、（2介）需要滅騰菌；（3蠅）需要消老毒。三、實辦驗操作1.制備隊牛肉膏蛋臂白胨培養(yǎng)齊基（用于情培養(yǎng)細(xì)菌很）1．計定算、稱量2．溶豪化3．調(diào)咱pH：健pH酸7．64．過濾屋：這一步號可以省去兆。5．分陽裝：分絹裝過程雕中注意封不要使訓(xùn)培養(yǎng)基朽沾在管喜口或瓶詢口上，多以免沾耐污棉塞歌而引起銅污染。造分裝三舟角燒瓶醒的量以秤不超過刃三角燒簡瓶容積省的一半摩為宜。6．加塞7．包扎操作步驟8．滅依菌:將50m第l培養(yǎng)基庸用玻棒轉(zhuǎn)邪移至三角無錐瓶中，蔬塞上棉花駁塞，包上淡牛皮紙，說再放入高拾壓蒸氣滅逗菌鍋，在駁壓力為1廁00kP犁a、溫度討為121影℃，滅菌狠15～3矛0min余。將培養(yǎng)續(xù)基用舊報績紙包裹，般放入干熱向滅菌箱內(nèi)小，在16釣0～17嫌0℃下掠滅菌2h偽。9．倒平朝板:待培養(yǎng)基慚冷卻到5作0℃左賺右時，在蘆酒精燈附杜近倒平板考。（倒平糟板操作見陜課本）2材d后觀察妻平板，無掏雜菌污染當(dāng)才可用來電接種.10．無道菌檢查：將滅菌的系培養(yǎng)基放春入37℃踢的溫室中躬培養(yǎng)24忘—48小賓時，以檢斑查滅菌是版否徹底。倒平板躺技術(shù)1.培養(yǎng)烘基滅菌后類，需要冷票卻到50棗℃左右今時，才能訓(xùn)用來倒平保板。你用瓣什么辦法歌來估計培興養(yǎng)基的溫忍度？問題討論答：可以用手村觸摸盛有勞培養(yǎng)基的庸錐形瓶，沸感覺錐形插瓶的溫度篇下降到剛囑剛不燙手廚時，就可寇以進行倒蝴平板了。2.為什鞋么需要使揮錐形瓶的逮瓶口通過知火焰？答：通過粱灼燒滅菌賊，防止瓶激口的微生栗物污染培伍養(yǎng)基。3.平板貴冷凝后，叛為什么要蟻將平板倒珍置？4.在倒糟平板的過餐程中，如香果不小心獲將培養(yǎng)基險濺在皿蓋誤與皿底之觸間的部位細(xì)，這個平竊板還能用插來培養(yǎng)微級生物嗎？察為什么？答：平潮板冷凝舊后，皿芒蓋上會春凝結(jié)水架珠，凝蒜固后的匠培養(yǎng)基袋表面的斑濕度也摘比較高捐，將平張板倒置貨，既可今以使培激養(yǎng)基表啦面的水材分更好萍地?fù)]發(fā)會，又可邪以防止扮皿蓋上守的水珠顏落入培床養(yǎng)基，售造成污裝染。答：空氣伐中的微生休物可能在溫皿蓋與皿巨底之間的海培養(yǎng)基上盯滋生，因藏此最好不柱要用這個鉛平板培養(yǎng)并微生物。2、純化易大腸桿菌接種方杠法有：平板劃線洽法和稀釋寧涂布平板昂法平板劃線催法:通過接鑒種環(huán)在曲瓊脂固送體培養(yǎng)你基表面起連續(xù)畫令線的操經(jīng)作,將搏聚集的感菌鐘逐坑步稀釋煮分散到晃培養(yǎng)基侄的表面牽.在數(shù)次畫遷線后,可坑以分離到貼由一個細(xì)尚胞繁殖而嬸來的肉眼騎可見的子遍細(xì)胞群體饅,這就是反菌落.微生物的紛接種技術(shù)平板劃線亭的操作方市法交叉劃籌線法連續(xù)劃線氏法平板劃輔線時不幣能劃破棗培養(yǎng)基若的原因一旦劃奴破，會盤造成劃娃線不均觸勻，難班以達到部分離單愉菌落的翁目的；二是存子留在劃魚破處的霧單個細(xì)扁胞無法伍形成規(guī)歐矩的菌族落，菌桃落會沿邪著劃破廉處生長籠，會形巧成一個斬條狀的熊菌落。問題討論1.為辣什么在識操作的膏第一步拘以及每未次劃線鼻之前都魂要灼燒期接種環(huán)艙？在劃鍬線操作綢結(jié)束時宜，仍然塞需要灼挽燒接種拔環(huán)嗎？輪為什么癥？答：操野作的第堤一步灼唉燒接種墻環(huán)是為愿了避免協(xié)接種環(huán)屢上可能娛存在的受微生物童污染培樓養(yǎng)物；城每次劃冷線前灼形燒接種休環(huán)是為熄了殺死萍上次劃增線結(jié)束豆后，接廈種環(huán)上暴殘留的兔菌種，瞇使下一拳次劃線億時，接膠種環(huán)上夸的菌種績直接來太源于上付次劃線醫(yī)的末端芬，從而浮通過劃腰線次數(shù)經(jīng)的增加驗，使每晌次劃線僑時菌種懸的數(shù)目扒逐漸減惱少，以職便得到貪菌落。股劃線結(jié)扒束后灼叮燒接種斷環(huán)，能雞及時殺爐死接種泥環(huán)上殘枯留的菌剃種，避烏免細(xì)菌箱污染環(huán)姥境和感悼染操作彼者。2.在雙灼燒接強種環(huán)之哀后，為王什么要腫等其冷窗卻后再苗進行劃雹線？答：以免桃接種環(huán)溫伸度太高，芝殺死菌種倆。3.在作靈第二次以近及其后的賊劃線操作么時，為什賓么總是從虛上一次劃謝線的末端概開始劃線盞？答：劃兵線后，觸線條末微端細(xì)菌掌的數(shù)目章比線條坡起始處戲要少，浩每次從采上一次溝劃線的未末端開竄始，能魄使細(xì)菌虎的數(shù)目牲隨著劃緣瑞線次數(shù)記的增加道而逐步同減少，偶最終能菌得到由惜單個細(xì)網(wǎng)菌繁殖椅而來的座菌落。問題討論涂布平竟板的所車有操作嚼都應(yīng)在陡火焰附丹近進行藍(lán)。結(jié)合親平板劃闊線與系伏列稀釋吃的無菌匆操作要臥求，想馬一想，句第2步礎(chǔ)應(yīng)如何繭進行無捐菌操作威？應(yīng)從操作逃的各個細(xì)步節(jié)保證“轟無菌”。就例如，酒蔬精燈與培發(fā)養(yǎng)皿的距趕離要合適畝、吸管頭訊不要接觸厭任何其他氣物體、吸清管要在酒講精燈火焰偏周圍等等色。微生物的句恒溫培養(yǎng)微生物晶的恒溫鮮培養(yǎng)菌種的株保存1、臨時搜保藏：接肥種到固體全斜面培養(yǎng)光基，菌落狹長成后置津于4℃冰棒箱保存。2、長期嶼保存：甘耳油冷凍管扇藏法四、課車題成果雅評價（一）檔培養(yǎng)基主的制作齡是否合貌格如果未偏接種的堆培養(yǎng)基動在恒溫噸箱中保撿溫1～跳2d貴后無菌罵落生長恒，說明晚培養(yǎng)基假的制備諸是成功改的，否船則需要落重新制巨備。（二）接悲種操作是仇否符合無堡菌要求如果培養(yǎng)卸基上生長悉的菌落的態(tài)顏色、形謙狀、大小圣基本一致兔，并符合聚大腸桿菌肌菌落的特補點，則說繡明接種操田作是符合罰要求的；濫如果培養(yǎng)導(dǎo)基上出現(xiàn)揮了其他菌籌落，則說并明接種過努程中，無竭菌操作還宇未達到要糠求，需要隆分析原因懷，再次練桶習(xí)。（三）是夕否進行了筋及時細(xì)致促的觀察與熟記錄培養(yǎng)1綁2h百與24蓄h后誕的大腸假桿菌菌肺落的大束小會有六明顯不軍同，及粉時觀察酒記錄的悠同學(xué)會搭發(fā)現(xiàn)這窩一點，幕并能觀荷察到其邀他一些肯細(xì)微的排變化。嗽這一步縮慧的要求碑主要是抵培養(yǎng)學(xué)拒生良好諸的科學(xué)尊態(tài)度與己習(xí)慣。本課題知尺識小結(jié):【典例解上析】例1．凱關(guān)微生樣物營養(yǎng)筐物質(zhì)的度敘述中驗，正確旺的A.是煎碳源的幣物質(zhì)不挪可能同資時是氮卵源B.凡唇碳源都皂提供能打量C.除水禁以外的無旨機物只提揚供無機鹽D.無寇機氮源假也能提玩供能量解析：不同的微粥生物，所瀉需營養(yǎng)物浩質(zhì)有較大口差別，要辟針對微生預(yù)物的具體指情況分析會。對于A譽、B選項伏，它的表數(shù)達是不完訴整的。有楚的碳源只劈燕能是碳源免，如二氧笑化碳；有敞的碳源可疫同時是氮瞎源，如N驢H4HC蕩O3；有雞的碳源同瀉時是能源汪，如葡萄設(shè)糖；有的狼碳源同時姻是氮源，北也是能源敞，如蛋白挖胨。對于條C選項，從除水以外列的無機物淡種類繁多箭，功能也釀多樣。如千二氧化碳衫，可作為局自養(yǎng)型微謙生物的碳父源；Na碗HCO3祥，可作為謙自養(yǎng)型微字生物的碳奏源和無機膨鹽；而N鑒aCl則冬只能提供標(biāo)無機鹽。兩對于D選奴項，無機鍋氮源提供寨能量的情驕況還是存店在的，如閃NH3可園為硝化細(xì)售菌提供能梨量和氮源父。答案：魄D例2．姜下面對朋發(fā)酵工登程中滅巴菌的理奧解不正確的是A.防止盯雜菌污染刮B按.消滅雜欺菌C.培痛養(yǎng)基和頓發(fā)酵設(shè)照備都必丘須滅菌D.滅菌亂必須在接輝種前答案：喚B解析：滅升菌是微生茄物發(fā)酵過售程的一個李重要環(huán)節(jié)菌。A說的紅是滅菌的蓬目的，因銜為發(fā)酵所錫用的菌種灰大多是單梯一的純種薯，整個發(fā)壘酵過程不旁能混入其鹿他微生物短（雜菌）庭，所以是駝?wù)_的；竄B是錯誤攔的，因為泥滅菌的目楚的是防止講雜菌污染詢，但實際君操作中不夫可能只消度滅雜菌，村