酶免疫測試(EIA)技術(shù)

酶免疫測試(EIA)技術(shù)第1頁/共17頁酶免疫分析技術(shù)非均相酶免疫分析均相酶免疫分析非均相液相酶免疫分析非均相固相酶免疫分析以聚苯乙烯制品作為載體的酶聯(lián)免疫吸附實驗---ELISA一、酶免疫測試（EIA）技術(shù)分類

第2頁/共17頁二、ELISA技術(shù)方法與原理

（1）ELISA特點(diǎn)：在固相表面組裝免疫活性物質(zhì)形成"免疫吸附劑"；酶標(biāo)記免疫活性物質(zhì)，進(jìn)行信號放大；有二步溫育反應(yīng)二次洗滌過程；靈敏度特異性相對較高。（2）ELISA局限性：只能檢測到ng水平，精密度差（批內(nèi)CV15-20%）；線性范圍窄（一個數(shù)量級）。（3）根據(jù)檢測目的和操作步驟不同有三種基本方法：雙抗體（原）夾心法；間接法；競爭法第3頁/共17頁ELISA測試原理

1）將鏈霉親合素包被的聚苯乙烯塑料試管安置固定。2）將生物素標(biāo)記的特異性抗體和待測抗原加入鏈霉親合素包被小管內(nèi)，經(jīng)溫育，生物素和親和素發(fā)生連接，待測抗原和特異性抗體發(fā)生結(jié)合，形成固相包被親合素-生物素-特異性抗體-待測抗原復(fù)合物，然后進(jìn)行洗滌，除去未結(jié)合的抗原和生物素標(biāo)記抗體。3）加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的特異性抗體(酶標(biāo)抗體)，經(jīng)溫育形成固相包被鏈酶親合素-生物素-特異性抗體-待測抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，再次進(jìn)行洗滌，除去多余的酶標(biāo)抗體。4）加入底物ABTS和H2O2，經(jīng)溫育，ABTS在辣根過氧化物酶的作用下顯色，然后經(jīng)波長450nm的光度計測定獲得A值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出待測抗原的含量。第4頁/共17頁三、自動化酶標(biāo)儀基本工作原理

光源光路微孔板觸摸屏電源

單

A/D轉(zhuǎn)換程控放大器多路開關(guān)光電檢測顯示器

片打印機(jī)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動步進(jìn)電機(jī)送樣機(jī)構(gòu)電源

機(jī)

圖2工作原理方框圖電源第5頁/共17頁四、ELISA操作步

（1）試劑的準(zhǔn)備（2）加樣（3）保溫使用恒溫水箱使用保溫箱（4）洗滌（5）比色第6頁/共17頁五、ELISA質(zhì)量控制

（一）的測試前標(biāo)本的采集和保存

（1）可作標(biāo)本廣泛，體液（如血清，血漿，各種積液），分泌物（如唾液）和排瀉物（如糞便，尿液）均可。（2）標(biāo)本采集時應(yīng)盡量避免溶血，否則造成假陽性；長菌的標(biāo)本同樣的道理易產(chǎn)生假陽性。（3）抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑。（4）標(biāo)本保存：血清置4℃冰箱5天內(nèi)完成測試；一周以上則要-20℃冰凍保存，融解時應(yīng)上下顛倒充分混勻。（5）ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,標(biāo)本間的污染要盡量避免，尤其不應(yīng)與生化試驗用同一管標(biāo)本，最起碼應(yīng)先做免疫后做生化。第7頁/共17頁（二）儀器質(zhì)控

（1）移液器：ELISA加樣量?。?-100ｕl），其準(zhǔn)確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查，一般應(yīng)在±10%以內(nèi)；（2）水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；（3）洗板機(jī)：每個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；（4）酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。第8頁/共17頁（三）分析中質(zhì)控

（1）加樣（2）溫育（3）洗滌（4）顯色（5）酶標(biāo)儀判讀結(jié)果第9頁/共17頁六、ELISA操作注意事項

（1）測試之前，冰箱內(nèi)試劑一定要復(fù)溫（至室溫），并檢查是否已經(jīng)變質(zhì)，同時用雙蒸水稀釋濃縮的洗滌液和稀釋液，若用不合格的蒸餾水則可使空白值增高。（2）微量加液器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正，否則結(jié)果誤差較大，同時加樣時不可出現(xiàn)氣泡，以免反應(yīng)物間不能充分混勻反應(yīng)。（3）溫育時要力求受熱均勻，同時避免液體蒸發(fā)。（4）洗滌時力求次數(shù)足夠，且避免形成氣泡，否則洗滌不完全。（5）比色時反應(yīng)管內(nèi)不能留有氣泡，管底不能存有水滴，否則出現(xiàn)較大誤差。第10頁/共17頁七、影響ELLSA測試結(jié)果常見問題原因及解決方法

1.選擇試劑2.加樣3.孵育4.洗板5.顯色6.終止7.讀板第11頁/共17頁八、、RT-2100C型多功能酶標(biāo)儀儀器特點(diǎn)：

1、RT-2100C可廣泛應(yīng)用于傳染病、腫瘤標(biāo)志物、血液病、艾滋病、內(nèi)分泌障礙測定等臨床論斷領(lǐng)域。2、大屏幕漢化界面，利用觸摸屏和筆作為輸入方式，極大地方便了用戶的操作輸入。3、100個可編程的檢驗項目。4、多種定量、定性計算方法5、96孔可視化布板，空白位、對照位、樣本位、標(biāo)準(zhǔn)品位任意設(shè)置，同一板上可同時進(jìn)行最多12個項目的測試。6、8通道檢測迅速準(zhǔn)確(<5秒/板)，測試前的震動混勻功能。第12頁/共17頁7、大容量歷史數(shù)據(jù)保存，最多可保存500個項目，1000個病人，10000條樣本記錄。8、形式多樣的綜合中文報告輸出，支持多種品牌系列的外置打印機(jī)。9、強(qiáng)大的網(wǎng)絡(luò)功能：可與醫(yī)院內(nèi)部計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)、質(zhì)量監(jiān)測中心及雷杜用戶服務(wù)中心聯(lián)網(wǎng)，為工作帶來極大的便捷。10、配合使用雷杜酶標(biāo)實驗室管理系統(tǒng)，可以在聯(lián)網(wǎng)計算機(jī)上進(jìn)行數(shù)據(jù)管理和分析。11、輔助管理功能：內(nèi)置科室數(shù)據(jù)庫、醫(yī)生數(shù)據(jù)庫和系統(tǒng)日志數(shù)據(jù)庫。第13頁/共17頁九、RT-2100C型多功能酶標(biāo)儀常用測試項目（1）肝炎類：甲肝抗體IgM、乙肝兩對半、丙、丁、戊、庚性肝炎抗體等（2）傳染病類：愛滋病、衣原體、肺炎支原體、腺病毒、幽門螺旋桿菌、腮腺炎、麻疹、水痘、百日咳桿菌、流行性出血熱、狂犬病等。（3）腫瘤標(biāo)志物類：卵巢癌、乳腺癌、胃腸道癌、癌胚抗原、甲胎蛋白、膀胱癌、鐵蛋白等。（4）內(nèi)分泌類：T3、T4、促卵泡生成素(FSH)、黃體生成素(LH)、泌乳素(PRL)、人絨毛促性腺激素(HCG)、睪酮(TESTO)、孕酮(PROG)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、生長素(HGH)、促甲狀腺素(TSH)、皮質(zhì)醇或皮質(zhì)酮(C)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)等。（5）自身抗體類：ENA全套6項篩選、抗核抗體、抗Sm抗體、抗精子抗體、抗雙鏈/單鏈DNA、紅斑狼瘡篩選等。（6）Torch類、病毒感染類：弓形蟲、巨細(xì)胞病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒等。（7）細(xì)胞因子類：白細(xì)胞介素、可溶性CD抗原。第14頁/共17頁十、RT-2100C型酶標(biāo)儀基本操作步驟（1）開機(jī)，待機(jī)器