第四章莖尖分生組織培養(yǎng)

一、概念和意義

1.概念莖尖分生組織培養(yǎng)：指對不超過0.1mm的莖尖或幾十微米的莖尖進行的培養(yǎng)。特點：可獲無病毒苗，操作困難，成苗時間長。

普通莖尖培養(yǎng)：對幾毫米至幾十毫米長的莖尖、芽尖及側(cè)芽的培養(yǎng)。操作技術(shù)簡單、易成活、成苗時間短、繁殖速度快。第一節(jié)

莖尖分生組織培養(yǎng)目前一頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點

莖尖分生組織培養(yǎng)除可以生產(chǎn)脫毒苗外，還具有方法簡便，繁殖迅速，遺傳性比較穩(wěn)定，易保持植株的優(yōu)良性狀的優(yōu)點，在基礎(chǔ)理論研究和實際應(yīng)用中具有重要價值。2.意義：1.形態(tài)建成研究莖尖分生組織（不帶葉原基，<250um）2.用于無病株生產(chǎn)莖尖（帶1-3個葉原基，100-1000um）3.進行營養(yǎng)繁殖芽培養(yǎng)（>1mm）4.育種中的應(yīng)用與輻射育種結(jié)合

目前二頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點二、莖尖分生組織培養(yǎng)一般方法1.材料的制備健壯枝梢去除葉片分成1-2cm自來水沖洗消毒75%的酒精30秒0.1%升汞或20倍次氯酸鈉消毒8-10min無菌水修剪剝離莖尖，通常切割下頂端0.2~0.5mm葉原基的莖尖（無菌水）接種。目前三頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點目前四頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點2.培養(yǎng)基

多為MS培養(yǎng)基及其改良配方，還有White、B5等。3.培養(yǎng)條件（1）溫度：26℃~28℃（2）光照：光培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)好。（3）濕度：與其他器官培養(yǎng)相似。目前五頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點一、病毒的危害

多數(shù)栽培植物，尤其無性繁殖植物，都易受到一種或幾種，甚至幾十種病毒的侵染。例如，草莓感染60多種病毒。并且隨著栽培時間的推移，侵染病毒的種類越來越多。受病毒侵染的植物生長緩慢、畸形、產(chǎn)量大幅度下降，品質(zhì)變劣，甚至完全喪失商品價值。因此說，病毒帶來極大的危害。第二節(jié)

脫毒苗的培育和病毒檢測目前六頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點目前七頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點目前，對細菌和真菌侵染的病害，可以通過藥物處理達到治愈的目的，如多菌靈等。但目前，還沒有藥物能治病毒病。種子一般不帶病毒，種子繁殖植物可以得到無菌植株。但對于無性繁殖植物，必須采用一種有效的方法，脫去病毒，才能達到提高產(chǎn)量和質(zhì)量的目的。目前八頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點二、病毒侵染的特點早在40年代，就有科學(xué)家(White等)發(fā)現(xiàn)病毒在根上和莖上的分布是不均勻的，離根尖和莖尖越近，病毒的密度越低。反之，越高。即病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，分生組織一般無病毒侵染。目前九頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點分生組織之所以能避開病毒侵染，可能有4方面原因：1、在植物體中，病毒的移動主要靠兩條途徑，一是通過維管系統(tǒng)，而分生組織中尚未形成維管系統(tǒng)；二是通過胞間連絲，但這條途徑病毒移動速度非常緩慢，難以追趕上活躍生長的莖尖和根尖。目前十頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點目前十一頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點2、在旺盛分裂的分生組織中，代謝活動很高，使病毒無法進行復(fù)制。3、在莖尖中存在高水平內(nèi)源激素，可以抑制病毒的增殖。4、在植物體內(nèi)存在有一種“病毒鈍化系統(tǒng)”，它在分生組織中的活性應(yīng)最高，因而使分生組織不受侵染。目前十二頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點

以上是四種可能原因，無論哪種說法正確，事實是分生組織一般不帶病毒。因此，利用這一原理，進行莖尖培養(yǎng)，培育無病毒苗。目前十三頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點植物脫病毒方法物理方法化學(xué)方法生物方法高溫處理莖尖培養(yǎng)微體嫁接珠心培養(yǎng)愈傷脫毒熱處理脫毒目前十四頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點三、脫毒的方法

（一）熱處理脫毒法熱處理脫毒原理病毒DNA分子進入細胞后隨植物細胞DNA一起復(fù)制。熱處理并不能殺死病毒，只能鈍化病毒活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止，失去傳染能力。

作為一種物理效應(yīng)可以加速植物細胞的分裂，使植物細胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。目前十五頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點熱處理法有：溫湯處理（熱水浸泡）和熱風處理兩種。具體方法：第一，熱水浸泡處理，適用于切下的材料，在50度左右的溫水中浸漬數(shù)分鐘至數(shù)小時，方法簡便易行但材料易受傷。第二，熱風處理，將生長的盆栽植物移入室內(nèi)或生長箱內(nèi)，處理溫度因植物種類、生理狀況而異。一般為35~40度，短則幾十分鐘，長達數(shù)月。

目前十六頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點熱處理的優(yōu)缺點優(yōu)點:方法簡單，效果明顯。缺點:

1)具有局限性，不能去除所有病毒。只對圓形病毒（蘋果花葉病毒），或?qū)€狀病毒（馬鈴薯卷葉病毒）有效；而對桿狀病毒（千日紅病毒）無效。2)熱處理后只有小部分植株能夠存活。極易使植物材料受熱枯死，造成損失3）延長熱處理時間，病毒鈍化效果好，同時也可能會鈍化植物組織中的抗性因子而降低處理效果。目前十七頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點其它效果香石竹（康乃馨）在38℃～40℃下經(jīng)兩個月處理可除去全部病毒。目前十八頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點

馬鈴薯在37℃下處理10～20天能除去卷葉病毒。目前十九頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點（二）莖尖培養(yǎng)脫毒

1.莖尖培養(yǎng)脫毒的原理（1）病毒在植物體內(nèi)的分布病毒濃度不同，離尖端越遠病毒濃度越高。莖尖或根尖離體培養(yǎng)便可獲得無病毒再生植株。必須指出的是，所謂無病毒，只是相對的，不是絕對的。（2）莖尖大小與脫毒莖尖外植體的大小與脫毒效果成反比。莖尖分生組織不能合成自身需要，生長素，細胞分裂素，因而帶葉原基的莖尖生長快，成苗率高。因此莖尖越大培養(yǎng)成活率越高。因此對不同植物脫毒適宜的莖尖大小不同。目前二十頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點2.莖尖培養(yǎng)脫毒的方法（1）取樣與消毒可直接選定的植株上取頂芽進行消毒接種。采頂芽與側(cè)芽消毒接種。消毒方法是：剪取頂芽梢段3、5厘米，剝?nèi)ゴ笕~片，用自來水沖洗干凈，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸鈉或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用無菌水沖洗材料4-5次。目前二十一頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點（2）接種

材料置10～40倍的雙筒解剖鏡下，解剖刀切取0.1～0.3mm帶有1～2個葉原基的莖尖，接種到培養(yǎng)基上。目前二十二頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點（3）培養(yǎng)接種后材料置25+2℃，光照度1500-5000LX，每日光照10-16h條件下培養(yǎng)。但一般光照培養(yǎng)比暗培養(yǎng)效果好。其間應(yīng)更換新鮮培養(yǎng)基。提高培養(yǎng)基中BA的濃度可形成大量從生芽。3.培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式：（1）培養(yǎng)基：常用MS，White等培養(yǎng)基。（2）培養(yǎng)方式：莖尖培養(yǎng)一般采用半固體培養(yǎng)基

目前二十三頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點（三）、熱處理與莖尖培養(yǎng)結(jié)合脫毒果樹等木本植物，熱處理后新芽頂端嫁接成活率較低。莖尖培養(yǎng)時，莖尖過小成活率太低，而莖尖太大又脫除不掉病毒將熱處理后的較大莖尖進行培養(yǎng)獲得無病毒植株，可以克服這些缺點。目前二十四頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點（四）微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法應(yīng)用微體嫁接的原因： 木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根形成植株。具體做法：將極小的莖尖（0.1mm~0.2mm）作為接穗嫁接到不帶病毒的種子實生苗砧木上，然后將砧木、接穗一起在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。優(yōu)點：接穗在砧木上易成活，故可用很小的莖尖來培養(yǎng)，去除病毒幾率大，獲得無病毒苗的可能性大。

微嫁接要求的剝離技術(shù)高，嫁接成活率與接穗大小呈正相關(guān)，而脫毒率與接穗大小呈負相關(guān)目前二十五頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點微體嫁接法脫除病毒的關(guān)鍵：

①要求剝離技術(shù)很高②需要考慮砧木和接穗對營養(yǎng)組成的不同要求；③與接穗的取材季節(jié)有密切關(guān)系（蘋果4~6月取材嫁接成活率較高。）目前二十六頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點（五）無病毒種苗的保存、應(yīng)用及繁殖（1）無病毒原種的保存

獲得無毒原種不易，若保存不好會很快重新感染病毒。為防止再度感染，應(yīng)在隔離條件下保存。若原種保存得好，無毒原種可以利用5-10年，在生產(chǎn)上可以創(chuàng)造更多的經(jīng)濟效益。目前二十七頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點1、隔離種植保存

通過無毒原種要在隔離區(qū)或隔蟲網(wǎng)室內(nèi)種植保存。植物病毒的傳播媒介主要是昆蟲如蚜蟲、葉蟬2、離體保存

脫毒苗經(jīng)鑒定后，選擇無病原種株系，回接于試管內(nèi)，可長期保存，是最理想的保存方法。目前二十八頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點（2）無毒原種的應(yīng)用

獲得無毒原種后，一方面要積極進行無毒苗的推廣，另一方面還要做好無病毒種的繁育。無毒苗的推廣應(yīng)在發(fā)展良種的新區(qū)使用才能取得良好的效果；在老病區(qū)使用時應(yīng)實行統(tǒng)一的防治措施，一次性全區(qū)換種，才能取得應(yīng)有的效果。目前二十九頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點（3）無病毒原種的繁殖

可在無毒源和其他病蟲害的大田中進行，場地土壤要進行消毒，防治蚜蟲、線蟲和其他傳毒媒介，并建立一套嚴格的原種繁育制度和栽培管理制度，防止病毒的再次感染。目前三十頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點目前三十一頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點四、植物脫毒苗的鑒定1、視覺觀察法(直接檢測法)

看植株的莖葉是否有該病毒所有可見癥狀。番茄無菌小苗厚葉蓮花掌目前三十二頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點植物病毒的癥狀植物病毒引起植株的癥狀是各異的，在觀賞植物上由病毒引起外部癥狀主要有以下幾種：（1）變色：褪綠、黃化、花葉、斑駁、紅葉等，常見病毒有；香石竹斑駁病毒、黃瓜花葉病毒、芋花葉病毒等。（2）壞死：常見的壞死是病斑或斑點。有輪斑、環(huán)斑、條斑‘條紋等。如香石竹壞死斑點病毒、，鳳仙花壞死斑點病毒草等。（3）畸形：植株可出現(xiàn)矮縮、矮化或葉片皺縮、卷葉、蕨葉等病狀。（4）萎蔫：主要是指植物根或莖的維管束組織受到破壞而發(fā)生供水不足所出現(xiàn)的凋萎現(xiàn)象。目前三十三頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點2、生物鑒定法(指示植物indicatingPlant法)

由于采用汁液接種法比較困難，所以通常采用嫁接接種的方法,

利用嫁接法接種，把待測的植物接種在敏感植物上，然后視其有無病斑，來判斷是否脫除了病毒。指示植物接穗嫁接后的植物目前三十四頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點指示植物法定義:將一些對病毒敏感、癥狀特征顯著的植物作為指示植物(又叫鑒別寄主),利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的方法.優(yōu)點:方法簡單\靈敏\準確\擦方便,仍為一種經(jīng)濟有效的方法缺點:枯斑法不能測出病毒總的核蛋白濃度,而只能測出相對的感染力目前三十五頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點3、電子顯微鏡鑒定法

小于0.1mm的病毒顆粒用電子顯微鏡直接觀察經(jīng)脫毒培養(yǎng)的葉片，檢查是否有的病毒粒子存在，還可測量病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)。較為先進的方法，但需一定的設(shè)備和技術(shù)目前三十六頁\總數(shù)三十八頁\編于十七點4、酶聯(lián)免疫法在血清法的基礎(chǔ)上，結(jié)合酶反應(yīng)發(fā)展起來。在抗體上帶上某種酶，抗原和抗體結(jié)合成的免疫復(fù)合物就有了酶活性，在反應(yīng)體系中加入酶底物，底物在酶的催化下，