生物工程制藥之維生素生產(chǎn)工藝

維生素生產(chǎn)工藝2.7維生素B2生產(chǎn)工藝維生素B2的國內(nèi)外生產(chǎn)現(xiàn)狀

目前維生素B2的全球需求量在8000~10000噸，隨著中國、南美等國家飼料業(yè)的不斷發(fā)展，在未來3~5年內(nèi)還會(huì)進(jìn)一步提高。但生產(chǎn)商利潤率降低，使許多公司不得不集中力量理順生產(chǎn)和降低生產(chǎn)成本。由于采用發(fā)酵工藝比采用化學(xué)合成工藝有更大的降低生產(chǎn)成本空間，因此，生產(chǎn)商對(duì)發(fā)酵法維生素B2生產(chǎn)更加重視。飼料仍將是維生素B2最重要的市場(chǎng)，市場(chǎng)份額為50%左右，醫(yī)藥和食品約為30%，其他如保健品等市場(chǎng)份額為20%，。維生素B2產(chǎn)品根據(jù)其純度分為醫(yī)藥級(jí)（純度≥98%）、食品級(jí)（96%）和飼料級(jí)（VB2≥80%）。

目前一頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素B2生理功能和基本性質(zhì)關(guān)于維生素B2商品名：維生素B2化學(xué)名：核黃素（riboflavin），6,7-dimethyl-9-(1-D-ribityl)isoalloxazine。分子式：C17H20N4O6分子量：376.38結(jié)構(gòu)式：目前二頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前三頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)

維生素B2又稱維生素G或核黃素。維生素B2是黃色針狀晶狀，微溶于水，遇堿易降解，遇光也容易分解。熔點(diǎn)：275-280℃溶解度：等電點(diǎn)：6.0

維生素生產(chǎn)工藝25℃27℃40℃100℃0.1g/L0.12g/L0.19g/L2.3g/L目前四頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝

1879年英國化學(xué)家布魯斯首先從乳清中發(fā)現(xiàn)VB2。Kuhn等于1933年首次從酵母、蛋清和乳清中分離出純的核黃素，并于1935年人工合成核黃素。因其結(jié)構(gòu)中含有核糖且呈黃色,故取名核黃素。VB2它在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)含量微少,是維持動(dòng)物良好營養(yǎng)狀況和生產(chǎn)性能所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。

目前五頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素B2的主要功能是在氨基酸、脂肪酸和碳水化合物的代謝中起作用，是生命活動(dòng)極其重要的物質(zhì)，人體及家禽、家畜體內(nèi)不能合成維生素B2，必須從外界攝取。人缺乏維生素B2將導(dǎo)致口角炎，舌炎，眼炎、結(jié)膜炎、陰囊炎等維生素B2缺乏癥。而動(dòng)物缺乏維生素B2將導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩、皮炎、神經(jīng)失調(diào)、食欲不振、生育不良等癥狀。

維生素生產(chǎn)工藝目前六頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素B2產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、營養(yǎng)食品添加劑和著色劑、臨床用藥、保健、美容及化妝品等領(lǐng)域。此外，新的用途不斷被開發(fā)，

維生素B2在治療心絞痛、防治偏頭痛、治療慢性腎炎水腫和治療某些癌癥等方面也日益受到人們的注意；酪酸脂(以維生素B2為原料生產(chǎn))，在日本廣泛用于治療動(dòng)脈硬化、高血壓、糖尿病等頑固的慢性疾病，且有良好反應(yīng)；發(fā)達(dá)國家將維生素B2用于污水處理也有報(bào)道。

維生素生產(chǎn)工藝目前七頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)豬用添加預(yù)混料配方（美國大豆協(xié)會(huì)制定）

維生素生產(chǎn)工藝目前八頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝

維生素B2生產(chǎn)方式維生素B2可以采用微生物發(fā)酵和化學(xué)合成兩種方法生產(chǎn)全化學(xué)合成法

全化學(xué)合成法以葡萄糖為起始原料，工藝路線復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，而且所用到的原料中含有二甲苯等有毒物質(zhì)，對(duì)環(huán)境的污染嚴(yán)重，已經(jīng)在核黃素的工業(yè)化生產(chǎn)中逐漸被淘汰.目前九頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)

維生素B2生產(chǎn)方式

化學(xué)半合成

化學(xué)半合成核黃素的關(guān)鍵中間體為D-核糖（多采用細(xì)菌發(fā)酵將葡萄糖轉(zhuǎn)化），較早的合成途徑是D-核糖經(jīng)氧化等4步化學(xué)反應(yīng)，合成得到核黃素，之后又有化學(xué)家將其簡化成3步。具體合成路線為：D-核糖乙醇溶液（1）制備后，在一定氫壓存在的條件下,使（1）和3,4二甲苯胺或4硝基鄰二甲苯反應(yīng)，得到N-D-核糖醇基-3,4-二甲苯胺（2），（2）再和苯胺重氮硫酸鹽(或鹽酸鹽)反應(yīng)，得到（D-核糖胺基）-6-偶氮苯基-3,4-二甲苯（3）。此后,在酸性縮合劑存在的條件下，使（3）和巴比妥酸反應(yīng)，制得最終產(chǎn)物核黃素(4)。維生素生產(chǎn)工藝目前十頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝發(fā)酵方法發(fā)酵生產(chǎn)的菌種主要包括Bacillussubtilis,Ashbyagossypii(核黃菌),Eremotheciumashbyii(阿氏假囊酵母)等，這些構(gòu)建的微生物基因工程菌在合適的培養(yǎng)基上均可以產(chǎn)生核黃素，多為外分泌，過程采用液體深層發(fā)酵。目前發(fā)酵方法生產(chǎn)維生素B2比化學(xué)合成的方法更具優(yōu)勢(shì)，尤其是生產(chǎn)飼料級(jí)維生素B2，選擇全發(fā)酵法成本更低。目前十一頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)Bacillus

subtilis由于具有下面幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)而被選作構(gòu)建生產(chǎn)核黃素的基因工程菌的出發(fā)菌株。1．Bacillussubtilis是一種非病原微生物，總的來說，許多由這種微生物生產(chǎn)的產(chǎn)品被認(rèn)為是安全可靠的。2．Bacillussubtilis是革蘭氏陽性菌中一種具有代表性的模式菌株，由英、法、德、日、瑞士等八個(gè)國家聯(lián)合完成的枯草芽孢桿菌基因組計(jì)劃（BacillussubtilisGenomeProject），將枯草芽孢桿菌基因組的全部4,214,810個(gè)堿基完全測(cè)序并公開發(fā)表，包括2,379個(gè)基因的枯草桿菌基因圖譜也已繪制完成并發(fā)表，其中相當(dāng)一部分基因及其編碼蛋白的分子生物學(xué)信息已經(jīng)獲得，為枯草芽孢桿菌的基因工程改造、構(gòu)建具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的工程菌株提供了詳細(xì)的背景資料。Bacillussubtilis中的核黃素合成基因在其染色體的210形成一個(gè)單一的核黃素操縱子結(jié)構(gòu)。維生素生產(chǎn)工藝目前十二頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝3.通過經(jīng)典的誘變育種技術(shù)，Bacillussubtilis

已經(jīng)被成功地用于肌苷和鳥苷的工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)量可達(dá)20-40g/L。由于這些產(chǎn)品是合成核黃素的前體物，這顯示了Bacillussubtilis

具有良好的用于工業(yè)化生產(chǎn)核黃素的潛力。目前十三頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝發(fā)酵主要原材料發(fā)酵原材料主要包括糖或淀粉類糖化液、玉米漿、酵母粉、磷酸鹽等。

提取原料主要為去離子水、無機(jī)酸和堿等。生產(chǎn)周期：種子培養(yǎng)14小時(shí)，發(fā)酵50-60小時(shí)；生產(chǎn)效價(jià)：16-18g/L，提取收率90%。目前十四頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前十五頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前十六頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝VB2代謝途徑

維生素B2代謝途徑目前十七頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝

核黃素是異咯嗪的衍生物，在異咯嗪環(huán)的7,8位上有兩個(gè)甲基，10位N上連著一個(gè)核糖醇。關(guān)于核黃素的生物合成過程，不同種類的生物中并不完全相同。目前對(duì)大腸桿菌、枯草芽袍桿菌以及一些酵母中的核黃素合成途徑了解得比較清楚。在枯草芽抱桿菌中核黃素的合成從GTP開始共包括6個(gè)反應(yīng)。如圖(Perkins,2002)所示:目前十八頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前十九頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)目前二十頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前二十一頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)核黃素合成過程中所涉及的酶以及編碼這些酶的基因在枯草芽抱桿菌中核黃素的合成共涉及4種酶蛋白(RibA,RibG,RibH,RibB)。其中RibA,RibG均為雙功能酶。RibA同時(shí)具有GTP環(huán)化裂解酶和3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸合成酶的活性。因此一方面它起到GTP環(huán)化裂解的作用另一方面還可以催化5-磷酸核酮糖生成3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸(Richter,1997)。這一點(diǎn)與大腸桿菌不同。大腸桿菌中這兩種酶分別由兩個(gè)不同的基因編碼并分別行使其功能。

RibG則同時(shí)具有嘧啶脫氨酶和嘧啶還原酶的活性。維生素生產(chǎn)工藝目前二十二頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)

RibH和RibB分別具有黃素合成酶β亞基和黃素合成酶α亞基的功能。現(xiàn)在除了導(dǎo)致核糖脫去磷酸的酶沒有被鑒別出來之外，其余的酶均己被鑒定。表1為枯草芽抱桿菌中與核黃素合成相關(guān)的酶與基因(Perkins,2002)核黃素合成酶是一種復(fù)合酶，有輕酶和重酶兩種。由3個(gè)α亞基組成的酶為輕酶，重酶包括輕酶和60個(gè)β亞基，其中輕酶處于60個(gè)β亞基組成的衣殼中心。ribH編碼核黃素合成酶的β亞基，即二氧四氫蝶啶合成酶，分子量為16144，催化DHBP和ArP的縮合產(chǎn)生DRL。ribB編碼核黃素合成酶的α亞基，分子量為23333，催化2分子DRL發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生核黃素和ArP。維生素生產(chǎn)工藝目前二十三頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前二十四頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前二十五頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前二十六頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)ribO是核黃素操縱子ribG基因上游存在的一個(gè)約300bp的非翻譯區(qū)，也稱為前導(dǎo)區(qū)，在早期對(duì)ribO的研究中發(fā)現(xiàn)其中含有一個(gè)不依賴ρ因子的終止子（一個(gè)穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)后跟著6個(gè)U的殘基）和一個(gè)位于5’末端的8個(gè)核苷酸區(qū)域的反終止子，它與終止子發(fā)卡的“左翼”的是完全互補(bǔ)的。反終止子與終止子的左翼配對(duì)將會(huì)阻止發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成，從而使轉(zhuǎn)錄能夠順利進(jìn)行。維生素生產(chǎn)工藝目前二十七頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)

反終止子位于終止子上游193個(gè)核苷酸處，這表明為了有效的與左翼競爭，需要通過特定的折疊而到達(dá)終止子處。該折疊為被稱做rfn-box或RFN元件，為一特異性RNA結(jié)構(gòu)的保守序列。該rfn-box特異的同F(xiàn)MN/FAD結(jié)合從而感知其濃度。當(dāng)FMN/FAD的濃度的較高時(shí)，rfn-box與FMN/FAD結(jié)合形成一個(gè)復(fù)合物。該復(fù)合物的形成對(duì)于rib操縱子的調(diào)控是非常重要的，它可以改變RNA的構(gòu)象，形成抗－反終止子結(jié)構(gòu)并阻止反終止子的形成，導(dǎo)致已經(jīng)開始的轉(zhuǎn)錄在前導(dǎo)區(qū)提前終止，從而抑制核黃素的生成。維生素生產(chǎn)工藝目前二十八頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)破壞RFN元件的ribO突變株均可以解除FMN對(duì)核黃素操縱子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)作用，從而有利積累核黃素。目前二十九頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前三十頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前三十一頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝2.7.6維生素B2的代謝調(diào)控和通量分析細(xì)胞代謝途徑的實(shí)質(zhì)就是與一組特定的流入和流出代謝物相聯(lián)系的任何一個(gè)合理、可觀察的生化反應(yīng)序列，代謝工程利用重組DNA技術(shù)對(duì)細(xì)胞的酶反應(yīng)、物質(zhì)運(yùn)輸以及調(diào)控功能進(jìn)行遺傳操作，進(jìn)而改良細(xì)胞的生物活性，它關(guān)注代謝途徑的組合而非單一的反應(yīng)，用整體、系統(tǒng)的觀點(diǎn)考察完整的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，重視途徑和目標(biāo)產(chǎn)物的熱力學(xué)可行性、代謝通量及其控制。將代謝通量的定量分析方法與代謝通量控制的分子生物學(xué)技術(shù)完美結(jié)合在一起，合理地修飾生物細(xì)胞的遺傳性狀，是代謝工程的基石。系統(tǒng)研究代謝通量及其控制機(jī)制有三大基本步驟：（1）盡可能多地觀察途徑并測(cè)定其流量；（2）在代謝網(wǎng)絡(luò)中施加一個(gè)已知的擾動(dòng)，并確定系統(tǒng)達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)時(shí)的代謝通量；（3）系統(tǒng)分析代謝通量擾動(dòng)的結(jié)果。若某個(gè)代謝通量的擾動(dòng)對(duì)其下游代謝通量未能造成可觀察的影響，那么就可以認(rèn)為該處的節(jié)點(diǎn)對(duì)上游擾動(dòng)的反應(yīng)是剛性的，反之則為柔性。在剛性節(jié)點(diǎn)處，試圖通過改變上游酶活性來影響下游代謝通量的做法是徒勞的。目前三十二頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝

細(xì)胞內(nèi)同時(shí)進(jìn)行的數(shù)千個(gè)生化反應(yīng)構(gòu)成了錯(cuò)綜復(fù)雜的細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)體系，其中的各反應(yīng)速率決定了整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的代謝通量，而這些反應(yīng)的速率受相應(yīng)的酶活水平以及參與反應(yīng)的代謝物濃度的影響，它們同時(shí)又受細(xì)胞性狀和所處環(huán)境的制約。代謝控制分析理論認(rèn)為，代謝通量的控制是由組成代謝途徑的各個(gè)步驟及相互之間的關(guān)系決定的，并且分布在整個(gè)代謝途徑上。生物大分子和效應(yīng)物并不能直接產(chǎn)生控制，而是通過作用于所在的反應(yīng)而影響整個(gè)代謝系統(tǒng)的控制，限速步驟不是固定的，但系統(tǒng)控制系數(shù)的總和卻是固定的，它可以定量描述各個(gè)步驟對(duì)整個(gè)代謝控制發(fā)揮作用的相對(duì)程度，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋更趨合理。目前三十三頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝代謝通量平衡一般包括三個(gè)部分：化學(xué)計(jì)量網(wǎng)絡(luò)分析代謝通量分析同位素標(biāo)記物分析目前三十四頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前三十五頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前三十六頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前三十七頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前三十八頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前三十九頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前四十頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝目前四十一頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝

由定量描述確定的代謝網(wǎng)絡(luò)可知，三種菌株中糖酵解途徑的通量

r7均大于戊糖磷酸氧化途徑（pentosephosphatepathway,PPP）的通量r4，因此糖酵解是葡萄糖代謝的主要途徑，大約有45~50%的葡萄糖用于生物體的合成，2.5-8.5%的葡萄糖用于合成核黃素，在發(fā)酵過程中大約有0.5~2%的葡萄糖用于合成副產(chǎn)物乙酸，3~7%的葡萄糖通過丙酮酸合成其它有機(jī)物，在我們的分析測(cè)定中，這些有機(jī)物中主要為雙乙酰，其含量約占30~70%，副產(chǎn)物中幾乎檢測(cè)不到甲酸。目前四十二頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝

一般認(rèn)為PP途徑的兩個(gè)重要功能是提供還原力NADPH及前體物Ribulose-5-P和4-磷酸赤蘚糖，24R7/pMX45中PPP的通量比較小，通量r6只有3.2%，前體物Ribulose-5-P幾乎全用于合成核酸和核黃素，而在RH13[pRB63]40

中雖然PPP的通量增加了10%，但其合成核黃素的通量卻基本和24R7/pMX45相同。

另外在RH33/pMX45中PPP的通量達(dá)到32%，這比其兩株分別高約20%和10%，但其合成核黃素的通量僅增加了2~2.5%，通量分析的結(jié)果表明Ribulose-5-P的供給已經(jīng)遠(yuǎn)大于合成核黃素的需要，僅僅通過增加r4很難使合成核黃素的通量增加，因此要進(jìn)一步提高RH33/pMX45中核黃素合成的通量必須增加從Ribulose-5-P到核黃素的合成能力，其中主要包括提高GTP的合成通量和從GTP到核黃素的通量兩個(gè)環(huán)節(jié)。目前四十三頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝

將RH33/pMX45

染色體上的pRB63進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)增以增加核黃素操縱子的劑量，然后將擴(kuò)增后的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果擴(kuò)增后菌株的核黃素產(chǎn)量并沒有得到有效的提高。這表明RH33/pMX45

中核黃素合成的主要通量限制因素可能存在于從Ribulose-5-P到GTP的一系列反應(yīng)中。目前四十四頁\總數(shù)四十七頁\編于二十點(diǎn)維生素生產(chǎn)工藝2.7.7維生素B2的提取工藝VB2提取工藝路線（一）（1）

用鹽酸調(diào)發(fā)酵液pH到7，然后加熱到70℃，維持45分鐘；（2）將發(fā)酵液打入一個(gè)中間儲(chǔ)罐，然后靜置，冷卻到20℃，然后將發(fā)酵液進(jìn)行多次離心，第一次需要的離心條件是：離心力2500g—3000g，最好是根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)整，以后的離心條件都是600g—750g，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。（3）離心后的固體加入到酸性的去離子水中，同時(shí)將懸浮液加熱到120℃，攪拌并維持60分鐘，然后冷卻到80℃。離心過濾，得到的固體純度可以達(dá)到96%。（4）

如果此時(shí)的